鐵皮石斛水提物對PM2.5所致人外周血淋巴細胞DNA損傷和炎癥反應的抑制作用

包永芬＊，程夢琳＊，白育庭，尚云龍，陳玲芳，單士剛

（湖北科技學院1.基礎醫(yī)學院，2.臨床醫(yī)學院，湖北咸寧 437100；3.浙江康恩貝制藥股份有限公司，浙江杭州 310000）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，道家經(jīng)典《道藏》將其列為中華“九大仙草”之首。現(xiàn)代毒理學研究表明，鐵皮石斛無遺傳毒性、無致突變作用，可作為新資源食品應用［1］。現(xiàn)代藥理學研究表明，其具有抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫力、降血糖、抗腫瘤和防輻射性損傷等作用［2-6］。霧霾是近年來困擾我國許多城市和地區(qū)的空氣污染問題。目前我國至少有30%的國土、約8億人口長期承受不同程度霧霾的困擾［7］。霧霾可通過炎癥機制和氧化損傷機制對人體健康造成損害。流行病學研究表明，機體血中炎癥標志物水平增加與居民長期暴露于空氣污染環(huán)境相關［8］。PM2.5因顆粒小，比表面積大，可吸附大量的有毒有害物質，且在大氣中滯留時間長，易進入肺泡、肺間質進入血管，到達其他器官，對機體健康造成嚴重影響。PM2.5附著大量的有害物質，其中多環(huán)芳烴為主的有機物和各種重金屬是主要致DNA損傷的成分［9-10］。人群免疫功能損傷、心血管疾病和呼吸系統(tǒng)疾病等與PM2.5濃度增加密切相關［11-13］，并且均有炎癥因子參與。本研究以PM2.5處理培養(yǎng)人外周血淋巴細胞（human periph?eral blood lymphocytes，hPBL），隨后加入鐵皮石斛水提物（Dendrobium officinale water extract，DOWE），檢測DOWE對PM2.5所致hPBL DNA損傷和炎癥反應的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 藥材和樣品制備

新鮮鐵皮石斛于2015年3月30日采自云南，經(jīng)鑒定為蘭科植物鐵皮石斛，標本保存在浙江康恩貝制藥股份有限公司浙江現(xiàn)代中藥與天然藥物研究院（編號20150330）。取鐵皮石斛適量，去根、葉后保留莖部，適度粉碎置圓底燒瓶中，加入8倍量蒸餾水浸沒藥材，浸泡30 min后，加熱至煮沸，保持微沸60 min，分離煎出液；藥渣加入4倍量蒸餾水，依法再次煎煮30 min；合并2次煎出液，置50℃水浴鍋中緩慢蒸發(fā)，濃縮至0.5 L，干燥、粉碎，即得DOWE，于4℃保存?zhèn)溆?。嚴格按照《中華人民共和國藥典》（2010年一部）方法檢測DOWE主要成分。結果表明，干粉中浸出物28.7%，多糖35.5%，甘露糖17.3%。實驗前用磷酸鹽液沖液（PBS）0.01 mol·L-1的溶解成不同濃度的溶液，過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、胎牛血清和0.05%胰蛋白酶（美國Gibco公司）；淋巴細胞分離液（天津灝洋生物）；CCK8試劑盒（碧云天生物技術研究所）；白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-2 ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（美國R&D公司）。FOR?MA3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；TE200倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；SNP1-PM10/PM2.5空氣采樣儀（美國AT公司）；PM2.5重量分析纖維濾膜、超聲振蕩清洗儀和64R型低溫高速離心機（美國Beckman公司）；Bio-Rad酶標分析儀（680型）（美國Bio-Rad公司）。

1.3 PM2.5的采集和制備

選取武漢市醫(yī)學院校門口（車流量大、污染較重）為采樣點，應用智能TSP中流量采樣器采集2015年3～8月的大氣PM2.5于專用質量分析纖維濾膜上，洗脫、過濾，真空冷凍干燥成干粉，收集干粉于-20℃保存?zhèn)溆?。?jīng)分析發(fā)現(xiàn)，所收集物質絕大部分顆粒物粒徑基本＜2.5 μm，較大顆粒表面平整光滑，棱角鈍化，且黏附較多更加細小的顆粒物。PM2.5中的微生物種群分屬于3個細菌類群：厚壁菌門、β變形細菌門和綠彎菌門。用生理鹽水稀釋成相應濃度的PM2.5溶液，高壓蒸汽滅菌10 min，4℃保存。臨用前超聲振蕩使顆粒物充分混勻。

1.4 細胞制備和培養(yǎng)

取健康志愿者外周血10 mL，與10 mL PBS混合均勻，緩慢滴加等密度的人淋巴細胞分離液，離心（500×g，20 min），取中間白色絮狀層，用8 mL PBS稀釋離心2次，每次250×g離心10min。棄上清液，取淋巴細胞加至4 mL RPMI 1640細胞培養(yǎng)液中，加入10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1、鏈霉素100 mg·L-1和PHA 20 mg·L-1（均為終濃度），制成hPBL單細胞懸液備用。

1.5 CCK8測定hPBL存活

將上述單細胞懸液調(diào)整細胞密度至1×108L-1，接種于96孔板，每孔100 μL（空白對照組加入等體積的培養(yǎng)基），37℃，5%CO2培養(yǎng)48 h，分別加入不同濃度PM2.5溶液（終濃度為10，20，40，80和160 mg·L-1）培養(yǎng)24 h；或預先加入DOWE（終濃度為25，50，100，200和400 mg·L-1）培養(yǎng)1 h，隨后加入PM2.5溶液（終濃度為40 mg·L-1）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細胞對照組和空白對照組加入等體積生理鹽水。加入10 μL CCK-8，繼續(xù)孵育30 min，于450 nm波長處測定吸光度（A450nm）值。細胞存活率（%）=（實驗組A450nm-空白組A450nm）/（細胞對照組A450nm-空白組A450nm）×100%。

1.6 彗星實驗測定hPBL DNA損傷

調(diào)整細胞密度至1×108L-1，接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)48 h，分別加入不同濃度PM2.5溶液（終濃度為10，20，40，80和160 mg·L-1）處理淋巴細胞24 h；或預先加入DOWE（終濃度為25，50，100，200和400 mg·L-1）預處理淋巴細胞1 h，再加入PM2.5溶液（終濃度40 mg·L-1）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細胞對照組加入等體積生理鹽水。用彗星實驗測定DNA損傷［14-15］，用CASP 軟件分析DNA損傷指標Olive尾矩。Olive尾矩為尾部DNA占總DNA百分比與尾長（μm）的乘積。

1.7 ELISA法測定hPBL分泌IL-1 β，IL-2和TNF- α水平

將1×109L-1單細胞懸液1 mL接種于48孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h，加入不同濃度DOWE（終濃度為25，50，100，200和400 mg·L-1）預孵育1 h，細胞對照組加入等體積生理鹽水，隨后加入PM2.5溶液（終濃度40 mg·L-1），24 h后收集各組培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β，IL-2和TNF-α濃度。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗結果數(shù)據(jù)x±s標示，采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析，組間差異性比較采用單因素方差分析，實驗組與對照組間比較用t檢驗。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PM2.5對hPBL存活和DNA損傷的影響

如圖1A所示，PM2.510，20和40 mg·L-1作用24 h，hPBL存活率與細胞對照組相比無明顯差異；PM2.580和160 mg·L-1時，細胞存活率降低至約70%（P＜0.05）。彗星實驗結果（圖1B）所示，與細胞對照組相比，H2O2陽性對照組和PM2.510，20，40，80和160 mg·L-1組hPBL Olive尾矩明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），且呈濃度-效應關系（r=0.92，P＜0.01），表明 PM2.510～160 mg·L-1可導致 hPBL DNA損傷。為了保證實驗中有足夠數(shù)目的存活細胞且可導致DNA損傷，后續(xù)實驗選擇PM2.540 mg·L-1作用24 h作為DNA損傷實驗的造模條件。

Fig.1 Effect of PM2.5on viability（A）and DNA damage（B，C）of human peripheral blood lymphocytes（hPBLs）.

2.2 DOWE對hPBL存活的影響

如圖 2A 所示，DOWE 25，50，100，200和400 mg·L-1組細胞存活率均＞90%，與細胞對照組相比無統(tǒng)計學差異。如圖2B所示，與細胞對照組比較，PM2.540 mg·L-1組細胞存活率無明顯差異；與PM2.540 mg·L-1組比較，DOWE 25，50，100，200和400 mg·L-1組細胞存活率亦無明顯差異。表明DOWE在該濃度范圍內(nèi)對細胞存活無明顯影響。

Fig.2 Effect of Dendrobium officinale water extract（DOWE）on viability of hPBLs assayed with CCK-8 assay.A：hPBLs were incubated with DOWE for 24 h；B：hPBLs were incubated with DOWE for 1 h and further incubated with PM2.540 mg·L-1for 24 h.±s，n=3.

2.3 DOWE對PM2.5所致hPBL DNA損傷的影響

如圖3所示，與細胞對照組比較，PM2.540 mg·L-1組細胞Olive尾矩明顯增加（P＜0.01）；與 PM2.540 mg·L-1組比較，DOWE 25 mg·L-1組細胞Olive尾矩無明顯變化，DOWE 50，100，200和400 mg·L-1組細胞Olive尾矩均明顯降低（P＜0.05），且呈濃度-效應關系（r=0.83，P＜0.01），表明DOWE對PM2.5所致hPBL DNA損傷具有一定的保護作用。

Fig.3 Effect of DOWE on PM2.5-induced DNA damage of hPBLs.hPBLs were incubated with DOWE for 1 h and further incubated with PM2.540 mg·L-1for 24 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with PM2.5group.

2.4 DOWE對PM2.5所致hPBL分泌IL-1 β，IL-2和TNF- α水平的影響

如圖4所示，與細胞對照組比較，PM2.540 mg·L-1組IL-1β，IL-2和TNF-α分別水平明顯升高（P＜0.01）；與PM2.5組相比，DOWE 25，50，100，200和400 mg·L-1可明顯抑制IL-1β，IL-2和TNF-α分泌（P＜0.05，P＜0.01），對 IL-1β 的抑制 率分別為22.8%，34.2%，45.6%，55.7%和64.6%；對IL-2的抑制率分別為25.0%，36.8%，47.1%，60.3%和69.1%；對TNF-α抑制率分別為17.2%，24.6%，36.1%，59.8%和68.0%。

Fig.4 Inhibitory effect of DOWE on PM2.5-induced interleukins-1 β（IL-1 β），IL-2 and tumour necrosis factor- α （TNF- α） production of hPBLs examined by ELISA.See Fig.3 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with PM2.5group.

3 討論

近年來，隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，大氣顆粒物污染頻繁發(fā)生，尤其是PM2.5對人類健康造成的危害日益嚴重，引起廣泛關注。PM2.5成分復雜，含有重金屬和多環(huán)芳烴等多種有害物質，PM2.5對細胞DNA的損傷作用也可能與其上附著的重金屬和多環(huán)芳烴等有害物質有關，這些有害物質經(jīng)人體代謝后，其代謝產(chǎn)物可與DNA形成共價加合物，并且在此過程中會形成大量活性氧，造成DNA的氧化損傷［16-17］。

本研究結果表明，PM2.510，20和40 mg·L-1對hPBL存活無明顯影響，80和160 mg·L-1使hPBL存活率降低至約70%。因此，選取PM2.540 mg·L-1作為后續(xù)實驗的濃度。彗星實驗結果所示，與細胞對照組相比，H2O2陽性對照組和PM2.510，20，40，80和160 mg·L-1組hPBL Olive尾矩明顯增加，且呈濃度-效應關系（r=0.92，P＜0.01），表明PM2.510～160 mg·L-1可導致hPBL DNA損傷。由此推測，在日常的大氣PM2.5暴露下，PM2.5的濃度升高可能導致人體DNA損傷。DOWE 50，100，200和400 mg·L-1對hPBL存活率無明顯影響，但可逆轉PM2.540 mg·L-1導致的hPBLOlive尾矩增加，且呈濃度-效應關系，提示DOWE對PM2.5所致hPBLDNA損傷具有一定的保護作用。上述結果亦提示，可將Olive尾矩作為PM2.5對人體DNA損傷的評價指標。

國內(nèi)外空氣PM2.5的流行病學研究表明，PM2.5濃度增加與人體免疫功能異常、呼吸系統(tǒng)疾病和心血管疾病等密切相關［12-13］，并且主要作用機制中均有炎癥因子的參與。IL-1具有廣泛的生物學作用，參與宿主的感染和損傷應答，是機體調(diào)節(jié)免疫與炎癥反應的重要介質。IL-2的轉錄和合成被視為T細胞活化的標志，反映細胞免疫功能。TNF-α是一種重要的炎癥介質，在啟動和維持炎癥反應中起著非常重要的作用。已有的動物實驗研究表明，小鼠經(jīng)氣管滴注不同來源的PM2.5后，其肺組織和血液中IL-1和IL-6表達增加［18］。Tablin等［19］研究報道，小鼠連續(xù)暴露于環(huán)境PM2.52周后，可引起血清中IL-2和TNF-α表達升高。據(jù)報道，PM2.5可引起TNF-α和（或）TNF-α mRNA表達水平的增加［20-22］。Sakai等［23］在動物實驗研究中，使小鼠暴露于柴油機廢氣后，發(fā)現(xiàn)暴露組小鼠TNF-α的表達增加。本研究結果發(fā)現(xiàn)，PM2.5刺激后，hPBL分泌 IL-1β，IL-2和TNF-α明顯增加，DOWE可抑制hPBL IL-1β，IL-2和TNF-α的分泌。提示PM2.5可誘導暴露人群產(chǎn)生明顯的炎癥反應，DOWE可對該炎癥反應有一定的抑制作用。

綜上所述，PM2.5可以引起hPBL DNA損傷和炎癥反應，DOWE對PM2.5所致hPBL DNA損傷具有一定的保護作用，且可抑制PM2.5誘導的hPBL炎癥反應，但其可能的作用機制還待繼續(xù)研究。本研究結果提示，使用鐵皮石斛等有可能緩解霧霾導致的DNA損傷和炎癥反應，為使用中藥防治霧霾導致的人體損傷提供了實驗依據(jù)。