雷公藤多苷對(duì)雄性SD大鼠生殖系統(tǒng)損傷的動(dòng)態(tài)變化及其可能機(jī)制

郭健敏，黃遠(yuǎn)鏗，雷夏凌，韓 重，梁 純，楊 威

（1.廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510260；2.廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東廣州 510990；3.香港科技大學(xué)，香港 999077）

雷公藤多苷（multi-glycosides from Tripterygium wilfordii Hook.f.，GTW）亦稱雷公藤總苷，GTW片是目前應(yīng)用最廣泛的口服雷公藤制劑之一［1］，主要用于治療風(fēng)濕性和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、腎病綜合征、紅斑狼瘡和自身免疫性肝炎等免疫性疾病，療效顯著［2-3］，但不良反應(yīng)也十分明顯。臨床服用GTW常見的不良反應(yīng)主要有惡心、食欲減退、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶升高、白細(xì)胞及血小板減少、月經(jīng)紊亂及精子減少等［4-6］。其中，在生殖系統(tǒng)方面的毒性十分突出，對(duì)男性生殖系統(tǒng)影響尤為明顯，可引起精子數(shù)量減少、活動(dòng)力下降、畸形率增加、睪丸萎縮和性欲減退等癥狀。目前，對(duì)GTW雄性生殖毒性的研究主要集中在睪丸的生精功能、組織標(biāo)志酶、對(duì)精原細(xì)胞的殺傷與誘變等方面，但未見其對(duì)生殖系統(tǒng)毒性動(dòng)態(tài)過程的研究。為此，本研究選擇處于性器官發(fā)育階段的雄性SD大鼠，通過精子檢查、生殖臟器系數(shù)和組織病理等指標(biāo)，動(dòng)態(tài)觀察GTW生殖毒性的發(fā)展過程及可逆性，同時(shí)針對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸（hypothalamus-pituitarygonadal axis，HPG軸）激素分泌和激素受體表達(dá)探討其毒性機(jī)制，為臨床合理用藥以及配伍減毒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、主要試劑和儀器

5周齡雄性SD大鼠180只，體質(zhì)量110～150 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0006，飼養(yǎng)溫度21～25℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h/12 h明暗交替，級(jí)壓差＞10 Pa；GTW片，江蘇美通制藥有限公司生產(chǎn)，多苷含量為每片10 mg，包裝規(guī)格為每瓶100片，批號(hào)101224；異氟烷，深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號(hào)204110201；促性腺激素釋放激素（gonadotropinreleasing hormone，GnRH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和睪酮（testosterone，T）測(cè)定試劑盒，均購自大連泛邦化工技術(shù)開發(fā)有限公司（R&D公司分裝）；雄激素受體（androgen receptor，AR）免疫組化試劑盒，購自美國(guó)Santa cruz公司。3-18K高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；ASP 300全密封自動(dòng)脫水機(jī)、EG1160石蠟包埋機(jī)和RM2235輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；Olympus BX 41生物熒光顯微鏡和DP71圖像采集頭，日本Olympus公司；IPP 6.0病理圖像分析軟件，美國(guó)Mediacybernetics公司；ELx800型酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司。

1.2 動(dòng)物分組、給藥和動(dòng)態(tài)觀察

大鼠適應(yīng)性觀察7 d后，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)均衡分組。本實(shí)驗(yàn)室前期急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GTW小鼠半數(shù)致死量（LD50）為185.3 mg·kg-1，據(jù)此將大鼠分為正常對(duì)照組、GTW 37.8和94.5 mg·kg-1組（按公斤體質(zhì)量折算約為臨床劑量24和60倍，按體表面積折算為4和10倍），每組60只，各組ig給藥，正常對(duì)照組給予等體積純水，給藥容積10 mL·kg-1，每天1次，連續(xù)90 d。每組于開始給藥后第7天（d7），d15，d30，d60，d90和d120（恢復(fù)30 d）檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3 伊紅染色觀察精子形態(tài)

大鼠安樂死后，取出單側(cè)附睪尾剔除脂肪，剪斷球狀部位后，將斷面涂于滴有生理鹽水的潔凈載玻片，干燥后伊紅染1 min，95%乙醇漂洗，干燥后封片鏡檢。每只大鼠400倍下采圖5張，隨機(jī)計(jì)數(shù)并觀察200個(gè)精子，計(jì)算未成熟精子率（immature sperm rate，ISR）和畸形精子率（abnormal sperm rate，ASR）［7-8］。ISR（%）=未成熟精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。ASR（%）=畸形精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。

1.4 臟器系數(shù)

大鼠禁食16～20 h，麻醉后腹主動(dòng)脈取血安樂死，取出腦、垂體、睪丸和附睪，剔除脂肪后稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。臟體系數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100。臟腦系數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/腦質(zhì)量（g）。

1.5 HE染色檢查組織病理變化

臟器用4%甲醛固定后，常規(guī)脫水、包埋，切片4 μm，HE染色，鏡下觀察睪丸和附睪組織病理變化。病理變化使用半定量方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.6 ELISA法檢測(cè)生殖激素水平

大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，2000×g離心15 min取血清，雙夾心ELISA試劑盒檢測(cè)d60血清GnRH，LH，F(xiàn)SH和T激素水平［9］，具體步驟參見試劑盒說明書。

1.7 免疫組化法檢測(cè)HPG軸和臟器組織中AR表達(dá)水平

SABC免疫組化法檢測(cè)正常對(duì)照組和GTW 94.5 mg·kg-1組d60，d90和d120（恢復(fù)30 d）大鼠下丘腦、垂體、睪丸和附睪AR表達(dá)水平，具體步驟參見試劑盒說明書。陽性顆?；蜿栃詤^(qū)域呈棕黃色［10］。結(jié)果采用IPP6.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)算陽性顆?；蜿栃詤^(qū)域的積分吸光度（integrated absor?bance，IA），判斷陽性反應(yīng)的強(qiáng)度。

Tab.1 Grading standard of pathological changes in testis and epididymis tissues（HE staining）

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 17.0軟件分析組間差異，檢驗(yàn)方差齊時(shí)采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用t′檢驗(yàn)。以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GTW對(duì)雄性大鼠精子形態(tài)的影響

與正常對(duì)照組相比，GTW 37.8和94.5 mg·kg-1組d60，d90和d120（恢復(fù)30 d）ISR顯著升高（P＜0.01）；d30，d60和 d90 ASR 明顯升高（P＜0.05，0.01）。大鼠開始給藥時(shí)約為5周齡，未達(dá)到性成熟，d30后正常對(duì)照組雄性大鼠ISR＜5%，ASR＜30%，精子發(fā)育良好；GTW 37.8和94.5 mg·kg-1組d30后ISR持續(xù)升高，表現(xiàn)出精子發(fā)育障礙（表2）。主要畸形有斷頭、圓頭、折疊和頭部不定型4種。

2.3 GTW對(duì)大鼠生殖臟器系數(shù)的影響

與正常對(duì)照組相比，GTW 37.8 mg·kg-1組自d60、GTW 94.5 mg·kg-1組自 d15起，睪丸和附睪臟器質(zhì)量、臟體系數(shù)和臟腦系數(shù)明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），d120（恢復(fù)30 d）未見改善（P＜0.01）。表明GTW長(zhǎng)期給藥可使睪丸和附睪萎縮及臟器減輕，恢復(fù)30 d后未恢復(fù)（圖1）。

2.4 GTW對(duì)大鼠睪丸和附睪組織病理變化的影響

Fig.1 Effect of GTW on reproductive organ mass（A），organ-body coefficient（B）and organ-brain coeffi?cient（C）of male SD rats.See Tab.2 for the rat treatment.1：testis；2：epididymis.Organ-body coefficient=organ mass（g）/body mass（g）×100.Organ-brain coefficient=organ mass（g）/brain mass（g）.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

GTW 94.5 mg·kg-1組大鼠自d7起，即出現(xiàn)睪丸曲細(xì)精管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少甚至消失，管腔縮小、管壁變薄，形態(tài)不規(guī)則，部分曲細(xì)精管內(nèi)可見多核巨細(xì)胞；隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，病變?cè)矫黠@，病變嚴(yán)重者可見睪丸內(nèi)所有曲細(xì)精管均萎縮，曲細(xì)精管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞消失，睪丸體積明顯縮小。上述病變?cè)赿120（恢復(fù)30 d）未見明顯恢復(fù)（圖2和表3）。

Tab.2 Effect of multi-glycosides from Tripterygium wilfordii Hook.f.（GTW）on immature sperm rate（ISR）and abnormal sperm rate（ASR）in male SD rats

GTW 94.5 mg·kg-1組d7時(shí)，附睪管內(nèi)精子未成熟現(xiàn)象，與正常對(duì)照組比較無明顯差異；d15和d30時(shí)附睪管內(nèi)精子發(fā)育障礙，出現(xiàn)短小、斷頭或斷尾或形態(tài)異常精子；d60和d90多出現(xiàn)附睪管內(nèi)空虛，管腔縮小，僅見未成熟精子或細(xì)胞成分；d120（恢復(fù)30 d）未見恢復(fù)（圖2和表3）。

2.5 GTW對(duì)大鼠生殖激素分泌的影響

與正常對(duì)照組相比，d60時(shí) GTW 37.8和94.5 mg·kg-1組血清FSH，LH和T水平明顯降低（P＜0.01），GnRH分泌未見異常（表4）。

Fig.2 Effect of GTW 94.5 mg·kg-1on pathological changes of testis and epididymis in male rats（HE staining，×100）.See Tab.2 for the rat treatment.↑（in testis tissue）：seminiferous tubular atrophy and/or sperm production disorders；↑（in epididymis tissue）：emptiness of epididymal lumine and/or no mature sperm.

Tab.3 Effect of GTW on pathological changes of testis and epididymis in male rats

2.6 GTW對(duì)大鼠雄激素受體表達(dá)水平的影響

免疫組化結(jié)果顯示（圖3，表5），d60和d90時(shí)GTW 94.5 mg·kg-1組下丘腦中AR表達(dá)水平低于正常對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），d120（恢復(fù)30 d）恢復(fù)。睪丸和附睪中AR表達(dá)水平在給d60，d90和d120均低于正常對(duì)照組（P＜0.01）。

Tab.4 Effect of GTW on reproductive hormone levels of male SD rats

Fig.3 Effect of GTW 94.5 mg·kg-1on androgen receptor（AR）expression in SD male rats（Immunohistochemical staining，×400）.See Tab.2 for the rat treatment.Positive particles or positive areas are brownish yellow.↑：positive reaction particle.

Tab.5 Effect of GTW on AR expression in male rats

3 討論

生殖系統(tǒng)功能在機(jī)體內(nèi)各種因素共同調(diào)控下運(yùn)行，藥物對(duì)生殖系統(tǒng)造成的損傷可能是通過多種途徑，例如直接損傷生殖器官、組織或細(xì)胞［9］，或通過影響各種酶類，生殖激素和細(xì)胞因子等間接損傷生殖系統(tǒng)。臨床上GTW對(duì)生殖系統(tǒng)的不良反應(yīng)多發(fā)，對(duì)于男性患者，短期服用可造成精子活力下降，畸形精子增多；服用2個(gè)月后，精液幾乎無可見精子［11-12］。青少年應(yīng)用雷公藤制劑對(duì)第二性征發(fā)育及性激素水平無明顯影響，但可影響部分患兒青春期的生精過程［13］。目前大部分研究已證實(shí)，GTW的毒性與用藥劑量和時(shí)程有關(guān)，但是對(duì)雷公藤所致的生殖系統(tǒng)功能損傷的發(fā)生時(shí)點(diǎn)、具體損傷的部位和程度是否可逆等，由于臨床研究的局限性，尚缺乏系統(tǒng)的研究［14］。本研究選用的雄性大鼠在給藥開始時(shí)為5周齡、出生后35 d（postnatal 35 day，PND 35），性器官發(fā)育處于關(guān)鍵階段，給藥期大鼠從5周齡（PND 35）至18周齡（PND 125）基本覆蓋了青春期至青壯年時(shí)期，同時(shí)根據(jù)臨床用藥特點(diǎn)設(shè)計(jì)了給藥后d7，d15，d30，d60和d90為觀察時(shí)間點(diǎn)，以對(duì)應(yīng)臨床短期用藥和長(zhǎng)期用藥的情況，用于動(dòng)態(tài)觀察GTW對(duì)雄性大鼠生殖系統(tǒng)的影響。本研究結(jié)果顯示，GTW在d7起即對(duì)雄性大鼠生殖器官造成損傷，造成精子形成障礙，畸變精子增多，病變發(fā)生起始時(shí)間有劑量相關(guān)性。值得關(guān)注的是，經(jīng)過90 d長(zhǎng)期給藥后恢復(fù)30 d，ASR趨于正常，ISR繼續(xù)升高，睪丸和附睪的病變未見改善。雄性SD大鼠精子發(fā)育成熟約12 d，精子發(fā)生整個(gè)時(shí)程約48 d，可見GTW的毒性可能作用于精子發(fā)生的整個(gè)過程［15］，并隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)損傷進(jìn)行性加重。據(jù)臨床報(bào)道，男性服藥1～2個(gè)月后停藥一段時(shí)間生殖功能可恢復(fù)，但缺乏長(zhǎng)期用藥的臨床報(bào)道［16］。本研究結(jié)果提示，有生育需求的男性在長(zhǎng)期應(yīng)用GTW時(shí)需要慎重權(quán)衡。

為了探討GTW生殖毒性機(jī)制，考察GTW是否影響HPG軸，且由于d30后大鼠才達(dá)到性成熟，因此選擇在d60檢測(cè)性激素。結(jié)果顯示，d60大鼠激素水平已經(jīng)很低，因此選擇GTW 94.5 mg·kg-1組繼續(xù)檢測(cè)AR表達(dá)，進(jìn)一步觀察GTW對(duì)生殖系統(tǒng)的損傷是否與HPG軸有關(guān)，期望為臨床上患者應(yīng)用GTW出現(xiàn)明顯生殖系統(tǒng)毒性時(shí)的防治提供思路。本研究結(jié)果表明，GTW組雄性大鼠血清FSH，LH和T水平降低，但GnRH分泌正常。LH降低使睪丸間充質(zhì)細(xì)胞得不到足夠的刺激，造成T分泌減少（T降低負(fù)反饋調(diào)節(jié)減弱，因此GnRH分泌正常），影響精子形成的過程。FSH的降低阻礙了精子發(fā)生的啟動(dòng)，影響到精子生成的全過程，兩者相互作用。HPG軸是一個(gè)既有層次又相互作用的系統(tǒng)內(nèi)分泌架構(gòu)，形成調(diào)控性激素分泌穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)環(huán)路，調(diào)節(jié)生殖器官的成熟發(fā)育和生殖的全過程［17］，提示GTW可通過抑制激素分泌影響精子生成，導(dǎo)致精子生成障礙并且隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)行性加重。本研究結(jié)果還表明，GTW能顯著下調(diào)雄性大鼠下丘腦、睪丸和附睪中AR表達(dá)。AR是介導(dǎo)雄激素發(fā)揮作用的必須物質(zhì)，雄性大鼠AR的基因突變或缺失會(huì)造成生殖器官發(fā)育畸形甚至不育［18-19］，提示GTW可能會(huì)引起生殖器官發(fā)育損傷。經(jīng)過本研究動(dòng)態(tài)觀察，GTW給藥后精子發(fā)育、睪丸和附睪臟器損傷進(jìn)行性加重，提示GTW對(duì)生殖系統(tǒng)的毒性機(jī)制與下調(diào)AR表達(dá)有關(guān)。