免疫檢查點抑制劑療效相關的生物標志物研究進展

趙海云，吉 芃，李小光，胡 欣

>復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

隨著腫瘤免疫基礎研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)不僅可以識別并清除腫瘤細胞，還可以幫助腫瘤逃避免疫攻擊［1］。免疫逃逸是腫瘤的基本特征之一［2］。腫瘤通過自身的基因、表觀遺傳的改變及周圍環(huán)境的馴化逐步獲得了免疫逃逸的能力，其中免疫檢查點的配體受體結合抑制活化的T淋巴細胞是造成免疫逃逸的關鍵原因［3］。因此，研究者開始嘗試阻斷免疫檢查點的配體受體結合進而激活免疫細胞以達到抗腫瘤的目的［4］，從而揭開了腫瘤免疫治療的新篇章。

免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint blockade，ICB）以抗溶細胞性T淋巴細胞相關抗原4（cytolytic T-lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4）和程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）及其配體（programmed death-ligand 1，PD-L1）抗體為代表，已被批準用于晚期或轉移性的黑色素瘤［5］、非小細胞肺癌［6］、腎癌［7］、經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤［8］、尿路上皮癌［9］、頭頸部鱗癌［10］、默克爾細胞癌［11］及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高（microsatellite instability-high，MSI-H）或錯配修復缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）的實體腫瘤［12］的治療。但是在臨床應用過程中存在兩個問題：① 25%～30%的患者會發(fā)生免疫相關的不良反應包括皮膚反應、結腸炎、內(nèi)分泌疾病及肝功能損害等，3～4級不良反應的發(fā)生率為6%～10%，更嚴重者會導致患者死亡［13-14］；②60%～80%的癌種適應證患者出現(xiàn)原發(fā)性耐藥，臨床試驗隨訪結果顯示，30%的患者出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥［15-16］。ICB相關的生物標志物研究能夠幫助我們實現(xiàn)患者篩查及個體化治療，規(guī)避無效人群的過度用藥，減少不良反應的發(fā)生，最終改善患者生活質(zhì)量，延長患者生存。因此，研究并鑒定ICB療效相關的生物標志物尤為迫切和重要。

1 ICB的作用機制

免疫檢查點是生理情況下一類負向調(diào)節(jié)機體免疫應答的分子，能夠維持機體免疫耐受和減少免疫應答過程中自身組織的損傷［4］。從腫瘤抗原的攝取、加工和呈遞，到T淋巴細胞的活化、遷移、浸潤和殺傷腫瘤細胞，腫瘤免疫循環(huán)過程的每一步都受到免疫檢查點的調(diào)控［17］。腫瘤逃避免疫攻擊的機制之一便是利用免疫檢查點下調(diào)免疫應答。以美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準的兩類ICB靶點舉例說明：① CTLA-4表達于中央淋巴器官的T淋巴細胞，在腫瘤免疫循環(huán)的早期階段調(diào)節(jié)T淋巴細胞的活化。T淋巴細胞活化的信號一是T淋巴細胞表面的受體特異性結合抗原；二是共刺激分子即可與白細胞分化抗原28（CD28）結合的抗原提呈細胞表面的配體白細胞分化抗原80/86（CD80/CD86）。CTLA-4競爭性結合其同源類似物CD28的配體從而負向調(diào)節(jié)T淋巴細胞的活化。② PD-1分子主要表達于外周組織中尤其是腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞表面。T淋巴細胞表面的PD-1分子與腫瘤細胞表面的PD-L1分子結合使免疫應答信號減弱，最終抑制瘤床中T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷［18］。因此抗CTLA-4抗體、抗PD-1/PD-L1抗體能夠有效地解除免疫檢查點對T淋巴細胞抗腫瘤免疫應答的剎車作用，從而達到治療腫瘤的作用。新的免疫檢查點分子如吲哚胺-2,3加雙氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）、淋巴細胞激活基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG3）及T細胞膜蛋白3（T cell membrane protein 3，TIM-3）等也被發(fā)現(xiàn)參與腫瘤免疫逃逸，其抑制劑實際臨床療效有待于大樣本前瞻性臨床試驗結果的檢驗［19］。

2 ICB療效相關的生物標志物

2.1 免疫相關生物標志物

針對抗PD-1/PD-L1抗體的療效預測，腫瘤組織中PD-L1的表達成為首要研究對象，臨床試驗結果證實腫瘤組織中PD-L1的表達與腫瘤對ICB的療效密切相關［20］。此外研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中浸潤的CD8+T細胞增多、γ-干擾素的分泌常提示腫瘤引起了機體活躍的免疫應答，此時ICB治療腫瘤常有更好的應答率［21］；而腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細胞的浸潤，其他免疫檢查點分子如TIM-3、LAG3和IDO的過表達提示腫瘤可能存在除PD-1/PD-L1信號通路以外的其他免疫逃逸機制［22］，此時單用ICB治療反應可能較差。研究發(fā)現(xiàn)，CC族趨化因子配體9［chemokine（C-X-C motif）ligand 9，CXCL9］被表觀遺傳學修飾后其生物學功能受到抑制，最終阻斷效應T細胞浸潤到瘤床中發(fā)揮其免疫功能［20］。為此單一的ICB不足以抑制腫瘤生長時，聯(lián)用其他ICB及表觀遺傳學修飾抑制劑等可能會增強腫瘤殺傷效果。

雖然上述免疫分子的確與ICB療效相關，但作為生物標志物也存在不足。以研究較多的PD-L1分子為例，首先，腫瘤微環(huán)境中PD-L1分子表達呈現(xiàn)動態(tài)多樣性［25］：一是由染色體改變?nèi)?p24.1基因轉位、擴增引起的；二是由癌基因信號通路如絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）激活引起的；三是由其他免疫細胞分子如γ-干擾素引起的誘導性表達。為此單一時間點的PD-L1表達檢測并不能評估腫瘤對ICB的反應［26］。其次，PD-L1檢測方法的分歧和表達的臨界值設定及腫瘤異質(zhì)性等問題使其尚不能成為可靠的ICB療效預測生物標志物［27］。此外，其預測ICB療效的靈敏度和特異度都有一定的不足，亞組分析表明，PD-L1表達陽性的腫瘤ICB反應率為36%～100%，而PD-L1表達陰性的腫瘤反應率為0～17%［28］。所以為減少單一的免疫分子檢測的不準確性，聯(lián)合檢測多個免疫分子可能更有價值。

2.2 基因組學相關生物標志物

隨著基因測序及生物信息學的發(fā)展，利用基因組學技術深入分析對ICB敏感或耐藥的腫瘤組織樣本，已成為發(fā)現(xiàn)ICB療效相關生物標志物的重要方法。臨床研究表明，MSI-H或dMMR可能與ICB反應率有關，ICB已被美國FDA批準用于此類基因組異常的實體瘤治療［12，29］。研究者報道了1例對ICB敏感的子宮內(nèi)膜癌患者，通過分析腫瘤原發(fā)灶和轉移灶的基因組學數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，DNA聚合酶ε（polymerase epsilon，POLE）基因突變可能與這一生物學表型相關，其原因可能是POLE基因的突變影響了微衛(wèi)星的穩(wěn)定［30］。此外研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌TP53、KRAS基因突變的患者對ICB治療反應較好，可能是因為TP53、KRAS基因突變改變了包括細胞周期調(diào)控及DNA復制、損傷修復在內(nèi)的一系列基因的表達，并能協(xié)同激活PD-L1的表達［31］。此外研究發(fā)現(xiàn)，人類白細胞抗原I類（Human leukocyte antigen I，HLA-I）基因位點A、B和C的全部雜合相比至少單一位點純合的患者對ICB治療有更好的臨床獲益［23］。

單個基因或一類基因的發(fā)現(xiàn)促使研究者對腫瘤樣本進行更系統(tǒng)的分析。研究者通過對ICB治療的非小細胞肺癌患者進行腫瘤組織樣本的全外顯子測序，發(fā)現(xiàn)對ICB反應較好的患者腫瘤組織樣本常有較高的非同義突變［32］。研究者對黑色素瘤ICB治療前活檢標本及配對的癌旁組織標本進行基因組測序，發(fā)現(xiàn)腫瘤體細胞突變的數(shù)量與ICB療效呈正相關［33］。此外，對ICB反應較好的腎癌患者相比對ICB治療不敏感的腎癌患者腫瘤組織往往有更多的基因插入、缺失等突變［34］。為此，腫瘤突變負荷（tumor mutational burden，TMB）相比單基因與ICB的療效關系得到了更為廣泛的研究。基于大數(shù)據(jù)庫的不同腫瘤類型的TMB分析發(fā)現(xiàn)，較高TMB的癌種如黑色素瘤、非小細胞肺癌、頭頸部鱗癌及膀胱癌對ICB反應率也較高，而那些TMB較低的癌種如胰腺癌、前列腺癌對ICB反應率較差［35］。研究者推測這一發(fā)現(xiàn)與腫瘤新生抗原有著密切的聯(lián)系，腫瘤新生抗原是腫瘤細胞基因突變或重排、插入及缺失等基因改變特異性表達在腫瘤細胞表面的抗原，也是機體免疫應答T細胞特異性識別和攻擊的靶標。TMB越高，其越有可能表達可被免疫細胞識別攻擊的特異性抗原，此時運用ICB往往具有較好的抗腫瘤療效［36-37］。

然而，關于TMB作為ICB療效預測生物標志物也有以下幾點問題值得關注：首先，并沒有確切的TMB臨界值可以明確哪些人群可以從ICB治療中獲益［33，38］；其次，引起免疫應答攻擊的腫瘤新生抗原可能只是小部分的基因突變產(chǎn)生，在蛋白層面直接檢測腫瘤細胞表面抗原呈遞情況的腫瘤抗原負荷可能更能準確預測腫瘤對ICB的療效［27］；此外，低TMB的腫瘤可能通過表觀遺傳學修飾提高了其腫瘤新生抗原的免疫原性，此時ICB的治療反應反而較好［7，39］，而那些具有高TMB的癌種其腫瘤免疫微環(huán)境中也可能存在其他免疫抑制分子如白細胞介素10、代謝相關酶IDO等影響ICB的療效［4，40］。因此，單一采用TMB來預測ICB療效可能存在一定的不足。

2.3 腸道微生物菌群

既往研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物菌群可以通過改變機體免疫系統(tǒng)功能、調(diào)節(jié)機體細胞代謝而最終影響癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程［41］。破壞小鼠模型腸道微生物菌群如B族多型擬桿菌、脆弱類桿菌及雙歧桿菌屬等會降低腫瘤對ICB的療效［42］。臨床回顧性研究發(fā)現(xiàn)，ICB治療前后2個月使用抗生素的患者的臨床獲益明顯少于未使用抗生素的患者［43］，可能是因為抗生素破壞了患者腸道微生物菌群的穩(wěn)態(tài)及某些優(yōu)勢腸道菌群。近期研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物菌群的組分、多樣性與ICB療效相關，有效患者腸道微生物菌群常有較高的多樣性和瘤胃球菌科［44］。通過移植那些顯著臨床獲益的患者腸道微生物菌群給無菌培養(yǎng)的小鼠，可以提高ICB的抗腫瘤效應［43-44］。因此，腸道微生物菌群的組分、多樣性有望成為預測ICB療效的生物標志物。

2.4 血液學標志物

外周血液檢測技術因其非侵入性、操作簡便等特點引起了研究者對ICB療效相關血液學標志物研究的興趣。研究人員通過分析接受ICB治療患者的血液細胞計數(shù)結果發(fā)現(xiàn)，絕對淋巴細胞及嗜酸性粒細胞數(shù)量的早期升高可能提示ICB較好的療效，疾病預后相對較好［45-47］。然而，基線的絕對中性粒細胞數(shù)量及中性粒細胞與淋巴細胞的比值較高可能意味著患者對ICB的治療反應較差［48］。此外，通過流式細胞檢測方法，研究者發(fā)現(xiàn)，那些對ICB反應較好的患者基線血液檢測中有較高的CD45RO+CD8+記憶性T淋巴細胞及調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的比例［24，49］，而ICB治療過程中CD4+和CD8+T淋巴細胞比例的增加也與ICB較好的療效相關［50］，可能是因為這些T淋巴細胞在血液中的分布比例影響了機體抗腫瘤免疫的應答程度。通過對20例接受ICB治療的患者和20位年齡、性別與患者匹配的健康人群的外周血樣本檢測結果進行分析，研究人員發(fā)現(xiàn)，治療前的CD14+CD16-HLA-DRhi經(jīng)典型單核細胞在外周血中的比例能夠很好地預測患者對ICB的反應，并且在隨后的驗證集中得到了很好的證實，可能是因為這類單核細胞維持了機體抗腫瘤免疫的有效應答狀態(tài)［51］。

此外，研究人員對66例接受ICB治療的黑色素瘤患者進行血液檢測，發(fā)現(xiàn)治療前血清乳酸脫氫酶的基線值、ICB治療過程中乳酸脫氫酶的變化與患者對ICB治療的反應及生存結局相關，較高的血清乳酸脫氫酶基線值及治療過程中較基線增加10%可能意味著ICB療效較差［52］。研究發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤和非小細胞肺癌患者血漿外泌體中PD-L1的mRNA表達量與ICB的療效相關，血漿中的外泌體常攜帶了腫瘤細胞的DNA、RNA及蛋白質(zhì)信息，當外泌體中PD-L1的mRNA表達量升高時，可能會向參與抗腫瘤免疫的效應細胞如巨噬細胞、T淋巴細胞傳遞抑制免疫應答的信號，此時使用ICB抗腫瘤療效就較差［53］。

雖然研究發(fā)現(xiàn)上述血液學標志物與ICB的療效甚至是疾病的預后相關，但仍存在幾點不足。首先，ICB治療過程中血液檢測的細胞計數(shù)結果及流式細胞術分析結果，很難辨別是ICB本身藥效學的體現(xiàn)還是機體自身抗腫瘤免疫狀態(tài)的表現(xiàn)；其次，這些研究大部分是基于小樣本人群的回顧性分析，研究結果有待大型臨床前瞻性試驗的驗證；此外，利用這些血液學檢測指標及流式細胞術分析結果研究ICB的療效時，可能會有其他如腫瘤組織中PD-L1表達量或患者本身基因組改變等混雜因素的干擾。

3 結論

目前，免疫檢查點抑制劑治療能有效延長部分腫瘤患者的總生存期，為了提高療效，尋找合適的生物標志物來預測ICB療效是亟待解決的重要問題。雖然現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)了一批與ICB療效相關的標志物，但具體的機制和預測的準確性有待大規(guī)模的前瞻性臨床試驗的驗證。鑒于機體免疫應答是動態(tài)的過程，深入研究ICB抗腫瘤免疫的具體機制，從而選擇合適的時機進行目標分子的聯(lián)合檢測也許更能準確地預測ICB的療效。高通量測序技術、多重免疫組織化學等技術將會有效助力于新型免疫檢查點療效生物標志物的發(fā)現(xiàn)，從而為ICB的精準應用提供指導。