術(shù)后序貫DC—CIK細(xì)胞治療對局部晚期非小細(xì)胞肺癌術(shù)后生存率及免疫功能的影響

艾月琴 江龍委 趙華 高艷榮 賈紹昌

[摘要] 目的 探討分析樹突狀細(xì)胞（DC）、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）治療對局部非小細(xì)胞肺癌術(shù)后生存率及免疫功能的影響。 方法 選取2014年1月～2017年1月南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬八一醫(yī)院收治的非小細(xì)胞肺癌術(shù)后患者40例，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為治療組（22例）和對照組（18例）。治療組患者術(shù)后采用DC、CIK細(xì)胞聯(lián)合放化療，對照組患者采用單純輔助放化療的方式；比較兩組患者術(shù)后生存率、血清腫瘤標(biāo)志物、免疫功能及不良反應(yīng)情況。 結(jié)果 治療組中位生存期與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），而無病生存期高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。治療后兩組患者血清腫瘤標(biāo)志物（CEA）及細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1（CYFRA21-1）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。治療后治療組患者輔助性T細(xì)胞及CD4+/ CD8+T細(xì)胞的比值與對照組比較顯著上升，且治療后治療組T淋巴細(xì)胞rDNA轉(zhuǎn)錄活性顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。兩組患者化療相關(guān)不良反應(yīng)無明顯差別，治療組患者有3例發(fā)生DC、CIK治療相關(guān)發(fā)熱反應(yīng)。 結(jié)論 對局部晚期非小細(xì)胞肺癌患者手術(shù)后序貫采用DC-CIK細(xì)胞治療能使患者無病生存期延長，免疫功能增強(qiáng)，是一種安全有效的治療方法，值得臨床推廣和應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] 局部晚期非小細(xì)胞肺癌；樹突狀細(xì)胞；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞；免疫功能；生存率

[中圖分類號] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）10（b）-0100-05

[Abstract] Objective To investigate the influence of Dendritic cell （DC） and Cytokine-induced killer （CIK） cell therapy on the survival rate and immune function of local non-small cell lung cancer. Methods From January 2014 to January 2017， in Bayi Hospital Affiliated Nanjing University of Chinese Medicine， 40 NSCLC patients were selected， they were divided into treatment group （22 cases） and control group （18 cases） by random sampling table method. The control group was treated with adjuvant chemotherapy alone， and the treatment group was treated with DC， CIK combined with chemotherapy. The postoperative survival rate， serum tumor markers， immune function， and adverse reactions of patients in two groups were compared. Results The median survival time of the treatment group was compared with the control group， the difference was not statistically significant （P > 0.05）， but the disease-free survival time of the treatment group was higher than the control group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. After treatment， serum tumor markers CEA and CYFRA21-1 in two groups were compared， the difference was not statistically significant （P > 0.05）. After treatment， the ratio of helper T cells and CD4+/CD8+ T cells in the treatment group were significantly higher than the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）， and the rDNA transcription activity of T lymphocytes in the treated group was significantly higher than the control group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference in chemotherapy-related adverse effects between the two groups， in the treatment group， 3 patients with DC and CIK treatment had related fever reactions. Conclusion Sequential use of DC-CIK cells in patients with locally advanced non-small cell lung cancer can lead to clinical benefit of disease-free survival and enhanced immune function. It is a safe and effective treatment and worthy of clinical promotion and application.

[Key words] Local advanced non-small cell lung cancer； Dendritic cell； Cytokine-induced killer； Immune function； Survival rate

在全球范圍內(nèi)，肺癌是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的首要因素，也占據(jù)了每年新發(fā)腫瘤的第一位，尤其是在男性中其發(fā)病率和死亡率均遠(yuǎn)高于其他腫瘤[1]。非小細(xì)胞肺癌（none small cell lung cancer，NSCLC）是一種主要的肺癌類型，發(fā)病率約占肺癌的85%[2]。NSCLC的病理類型有大細(xì)胞癌、腺癌、鱗狀細(xì)胞癌。相比小細(xì)胞肺癌而言，其惡性程度較低，大部分患者在發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期[2]。其中，局部晚期的患者的治療方法選擇是臨床上的一個難點(diǎn)。局部晚期NSCLC是指腫瘤僅局限于肺部而無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的ⅢA及ⅢB期NSCLC。手術(shù)切除是局部晚期NSCLC的重要治療方法。近些年，隨著外科技術(shù)的提高及設(shè)備的更新，越來越多的患者可以進(jìn)行手術(shù)切除，術(shù)后再予以常規(guī)放化療，其治療效果有了長足的進(jìn)步。但是局部晚期NSCLC患者總體的生存率仍不容樂觀。免疫治療是一種有潛力的治療方法，近些年發(fā)展迅猛。樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是腫瘤特異性免疫反應(yīng)的始動細(xì)胞，能將腫瘤相關(guān)抗原提呈給T細(xì)胞，激活T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用，在腫瘤免疫治療中有重要的作用[3-4]。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer，CIK）是使用細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的一群異質(zhì)性細(xì)胞，主要效應(yīng)細(xì)胞為CD3+ CD56+具有NK樣特征的T細(xì)胞，具有廣譜抗腫瘤作用，適應(yīng)性廣，可聯(lián)合DC使用[5]。既往的研究[6-8]顯示，DC、CIK治療腫瘤負(fù)荷較大的患者的療效并不讓人滿意。因此，本課題組設(shè)計在術(shù)后腫瘤負(fù)荷小的時機(jī)進(jìn)行DC、CIK治療，利用其能對微小病灶殺傷的優(yōu)點(diǎn)，觀察其對局部晚期手術(shù)后NSCLC患者生存率、復(fù)發(fā)情況及免疫功能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月～2017年1月南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬八一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的局部晚期NSCLC患者40例，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為治療組（22例）和對照組（18例）。治療組中男13例，女9例，年齡41～77歲；大細(xì)胞癌5例，腺癌12例，鱗癌5例；ⅢA期患者15例，ⅢB期患者7例。對照組中男12例，女6例，年齡39～74歲；大細(xì)胞癌3例，腺癌11例，鱗癌4例；ⅢA期患者13例，ⅢB期患者5例。兩組患者性別、年齡、病理分型及分期等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷明確為非小細(xì)胞肺癌，根據(jù)AJCC發(fā)布的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分為ⅢA期或ⅢB期患者；②患者在確診后3個月內(nèi)行手術(shù)治療，肺部病灶已切除，且手術(shù)后未行常規(guī)放化療以外的其他針對腫瘤的相關(guān)治療；③中性粒細(xì)胞≥1.5×109/L，KPS評分≥60分[9]，血小板≥100×109/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠或哺乳期女性；②艾滋病病毒（HIV）陽性、梅毒陽性；③嚴(yán)重自身免疫性疾病患者；④任何不可控的活動性感染；⑤對免疫治療及相關(guān)藥物過敏；⑥無法抽取血液的腫瘤患者；⑦嚴(yán)重精神疾病者。

1.3 主要試劑及儀器

淋巴細(xì)胞分離液購自加拿大Stemcell公司，注射用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）購自廈門特寶生物工程股份有限公司，白細(xì)胞介素-4（IL-4）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）購自Peprotech公司。培養(yǎng)所用培養(yǎng)液為美國Corning公司產(chǎn)品KBM-551培養(yǎng)液及KBM581培養(yǎng)液，抗人CD3單克隆抗體（anti-CD3 mAb）購自北京同立海源公司。流式檢測所使用抗體均為beckman公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀型號為Beckman公司的Beckman Coulter XL。

1.4 DC及CIK細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

采集患者外周血單個核細(xì)胞，體外分離培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)[10]，懸浮細(xì)胞用于CIK細(xì)胞培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞則用于DC的培養(yǎng)。兩組患者回輸?shù)募?xì)胞的數(shù)量及表型的均值詳見表1～2。

1.5 治療方法

治療前對患者行常規(guī)肺CT、血常規(guī)、心電圖及肝腎功能檢查，對照組患者僅進(jìn)行輔助常規(guī)放化療，并做對癥處理及相關(guān)檢查。治療組患者除輔助常規(guī)放化療外同步進(jìn)行DC、CIK治療。DC治療方案：以單個核細(xì)胞采集當(dāng)天為第0天，DC細(xì)胞分別在第7、14、21、28天分4次回輸，回輸方式為雙側(cè)鎖骨下區(qū)、雙側(cè)腋窩及雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)引流區(qū)皮下注射。CIK治療方案：以單個核細(xì)胞采集當(dāng)天為CIK細(xì)胞在第8、10、12天分3次回輸，回輸方式為靜脈回輸。以4次DC及3次CIK治療為1個治療周期，治療組患者至少進(jìn)行一個周期的治療。

1.6 隨訪及療效評價

臨床療效評估指標(biāo)為總生存期（overall surviral，OS）、無病生存期（disease free survival，PFS）及治療前后血清腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）和細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原21-1（cytokeratin fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）。OS是手術(shù)之后到隨訪截止或患者死亡的時間。PFS是從手術(shù)之后到腫瘤復(fù)發(fā)的時間。免疫反應(yīng)評估為外周血淋巴細(xì)胞亞群及T-淋巴細(xì)胞rDNA轉(zhuǎn)錄活性分析，采用流式細(xì)胞法檢測患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化，再通過KL-Ⅱ免疫圖像分析系統(tǒng)計算淋巴細(xì)胞Ag-NORs面積與核面積的比值（IS%）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，組內(nèi)治療前后的比較采用配對t檢驗。計數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗。兩組之間生存率的比較采用Kaplan-meier檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效

治療組和對照組中位生存期分別為25個月和18個月，1年生存率分別為77.3%（17例）和83.3%（15例），2年生存率為45.4%（10例）和55.6%（10例），3年生存率為22.7%（5例）和33.3%（6例）。兩組之間的OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。治療組和對照組PES分別為（13.4±6.4）個月和（9.1±5.8）個月，治療組顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

兩組患者治療前CEA、CYFRA21-1比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；兩組治療后CEA、CYFRA21-1比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。同時，兩組組內(nèi)治療前、后CEA、CYFRA21-1比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

2.2 免疫反應(yīng)評估

兩組患者治療前淋巴細(xì)胞亞群各項差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。治療后治療組患者CD4+及CD4+/CD8+ T細(xì)胞的比值較對照組有顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），其余各項兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。對照組患者治療前后淋巴細(xì)胞亞群各項差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），治療組患者治療后CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值較治療前有顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），其余各項差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表4。治療前兩組患者T淋巴細(xì)胞rDNA轉(zhuǎn)錄活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），治療后，治療組顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。對照組治療前后rDNA轉(zhuǎn)錄活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），而治療組治療后rDNA轉(zhuǎn)錄活性顯著高于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表5。

2.3 不良反應(yīng)

所有行DC、CIK治療患者中，僅有3例在回輸時出現(xiàn)發(fā)熱的不良反應(yīng)，均不超過39℃，采用物理降溫處理后恢復(fù)正常。

3 討論

肺癌是當(dāng)今世界上最常見的一種惡性腫瘤，NSCLC是其主要的一種類型，引發(fā)此病的因素有大氣污染、電離輻射、吸煙、職業(yè)、既往肺部慢性感染、環(huán)境接觸等因素，患者均有不同程度的胸部脹痛、低熱、痰血、咳嗽、呼吸困難、咯血、食欲下降等臨床癥狀[11]。外科治療是早期肺癌的首選治療方法。局部晚期的NSCLC，其手術(shù)治療的指征受到很多限制，只有當(dāng)腫瘤局限于局部范圍之內(nèi)，才適用于手術(shù)治療。有些微小的腫瘤病灶肉眼觀察不到，手術(shù)治療往往不能達(dá)到完全切除的目的，故而局部晚期的NSCLC患者術(shù)后一般予以常規(guī)放化療。腫瘤免疫治療是利用機(jī)體免疫功能抑制腫瘤細(xì)胞的一種新的治療模式，其作用機(jī)制決定了其對微小的轉(zhuǎn)移灶乃至單個的腫瘤細(xì)胞都能進(jìn)行有效殺傷，而且腫瘤免疫治療對患者術(shù)后的免疫功能恢復(fù)也有一定的作用。因此，局部晚期肺癌患者術(shù)后除予以常規(guī)放化療外，序貫免疫治療可能是一種有利于提高患者生存率的治療途徑[12-13]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)DC、CIK治療的NSCLC患者中位生存期為25個月，雖略高于對照組的18個月，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這可能是由于本研究入組患者的病例數(shù)不夠多，無法產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上的差異。而本研究中治療組的無病生存期卻顯著高于對照組，提示DC、CIK治療能使局部晚期NSCLC患者臨床獲益。同時，本研究的結(jié)果顯示，經(jīng)DC、CIK治療后，局部晚期NSCLC患者的血清腫瘤標(biāo)志物未產(chǎn)生明顯變化，可能是因為腫瘤已經(jīng)手術(shù)切除，而血液中的腫瘤標(biāo)志物主要來源于腫瘤細(xì)胞，故DC、CIK治療對其沒有太大影響。

腫瘤患者免疫功能往往較正常人低下，而局部晚期NSCLC患者大多需要進(jìn)行開放性手術(shù)。研究顯示，開放性手術(shù)患者較微創(chuàng)手術(shù)患者術(shù)后恢復(fù)不佳，免疫功能受到顯著抑制，而免疫功能的高低將直接影響患者的術(shù)后康復(fù)和遠(yuǎn)期腫瘤復(fù)發(fā)[14-16]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)DC、CIK治療的患者其免疫功能相較于對照組有顯著上升，提示DC、CIK治療能使手術(shù)后患者獲得免疫功能的獲益。

本課題組既往的研究都顯示，DC、CIK治療無嚴(yán)重不良反應(yīng)[10，17-20]，本研究中22例患者均無嚴(yán)重不良反應(yīng)出現(xiàn)，提示術(shù)后序貫DC、CIK治療是安全的。

綜上所述，對局部晚期非小細(xì)胞肺癌患者手術(shù)后序貫采用DC-CIK細(xì)胞治療能使患者受到臨床獲益，增強(qiáng)免疫功能，是一種安全有效的治療方法，值得臨床推廣和應(yīng)用。

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（收稿日期：2018-07-02 本文編輯：蘇 暢）