辛伐他汀誘導(dǎo)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的效應(yīng)研究

歐陽(yáng)騫 ，陳慧娟 ，徐芳菲 ，黃先明 ，邱宇安 ，羅文政

胃癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其起病隱匿，大多數(shù)患者在就診時(shí)就已處于進(jìn)展期，因此其預(yù)后較差[1-3]，探索新型抗胃癌藥物一直是臨床腫瘤學(xué)研究、藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)。他汀類藥物是目前臨床上治療高膽固醇血癥的主要藥物，其通過(guò)抑制羥甲基戊二酰單酰輔酶 A（HMG-CoA）還原酶發(fā)揮降低血清膽固醇作用[4]。近年來(lái)，諸多研究顯示他汀類藥物還具有抑制腫瘤增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與分化，降低腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力等作用[5，6]。辛伐他汀是臨床上常用的他汀類降血脂藥物，本研究旨在探討辛伐他汀誘導(dǎo)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人胃癌BGC-823細(xì)胞由上海信然生物科技有限公司提供，DMEM培養(yǎng)基由美國(guó)Promega公司提供，CCK-8試劑盒、Annexin V/PI試劑盒均由聯(lián)科生物科技有限公司提供，F(xiàn)ACSCALIBUR流式細(xì)胞儀由美國(guó)B-D公司提供，HBS-1096A酶標(biāo)儀由南京德鐵公司提供。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8細(xì)胞增殖法檢測(cè)胃癌BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌BGC-823細(xì)胞接種于每孔含DMEM培養(yǎng)液（青霉素、鏈霉素濃度均為 100IU/ml）180μl的 96 孔板中，3×103細(xì)胞/孔，向 各 孔 中 加 入 50.00μmol/L、25.00μmol/L、12.50μmol/L、6.25μmol/L 辛伐他汀 20μl，因此這 4個(gè)反應(yīng)體系中辛伐他汀終濃度分別為5.00μmol/L、2.50μmol/L、1.25μmol/L、0.63μmol/L， 注意同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，每個(gè)樣本作6個(gè)復(fù)孔。5%CO2條件下培養(yǎng) 68h后每孔中加入 CCK-8溶液 20μl，在540nm波長(zhǎng)處采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，并根據(jù)試驗(yàn)孔、空白對(duì)照孔吸光度值計(jì)算胃癌BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，并進(jìn)一步根據(jù)辛伐他汀終濃度及其對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)抑制率求得辛伐他汀對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞的藥物半數(shù)抑制濃度（IC50）。生長(zhǎng)抑制率（%）=（無(wú)藥細(xì)胞對(duì)照孔A值平均值-用藥孔A值平均值）/無(wú)藥細(xì)胞對(duì)照孔A值平均值×100%，并采用GraphPad Prism 5軟件計(jì)算IC50。

1.2.2 流式細(xì)胞法檢測(cè)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡率將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌BGC-823細(xì)胞接種于96孔板中，1×106細(xì)胞/孔，采用上述方法配制辛伐他汀終濃 度 分 別 為 2.00μmol/L、1.00μmol/L、0.00μmol/L的3個(gè)反應(yīng)體系，經(jīng)48h后收集細(xì)胞制備1×106細(xì)胞/L的單細(xì)胞懸液，取500μl單細(xì)胞懸液加入Annexin V/PI各 5μl，避光染色 30min后采用FACSC-ALIBUR流式細(xì)胞儀FL1、FL3雙通道檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，不同反應(yīng)體系中胃癌BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、凋亡率比較采用單因素方差分析、兩兩比較q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組反應(yīng)體系中胃癌BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較 A組、B組、C組、D組胃癌BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），A組生長(zhǎng)抑制率顯著高于B組、C組、D組（P＜0.01），B組生長(zhǎng)抑制率顯著高于C組、D組 （P＜0.01），C組生長(zhǎng)抑制率顯著D組（P＜0.01）。辛伐他汀對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞的IC50為1.15μmol/L。見(jiàn)表1。

表1 4組反應(yīng)體系中胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較（x±s，%）

2.2 三組反應(yīng)體系中胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡率的比較 E組、F組、G組胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），E組凋亡率顯著高于F組、G組 （P＜0.01），F(xiàn)組凋亡率顯著高于G組（P＜0.01）。 見(jiàn)表 2。

表2 三組反應(yīng)體系中胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡率的比較（x±s，%）

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其位居我國(guó)城市地區(qū)惡性腫瘤發(fā)病率、死亡率的第三位，男性發(fā)病率高于女性[7-9]。胃癌的病因與地域環(huán)境、飲食習(xí)慣、幽門(mén)螺桿菌感染、遺傳和基因等方面相關(guān)[10]。與其他大多數(shù)惡性腫瘤一樣，胃癌起病隱匿，很多病人早期并沒(méi)有明顯的臨床表現(xiàn)，僅表現(xiàn)出上腹部疼痛、惡心、食欲不振等非典型消化道癥狀，但隨著腫瘤的進(jìn)展，其病情進(jìn)入中晚期，嘔血、黑便、消化道梗阻、消瘦、惡病質(zhì)等典型的臨床癥狀及體征逐步出現(xiàn)，但此時(shí)病人多已喪失最佳手術(shù)治療機(jī)會(huì)。基于上述情況，在將來(lái)很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，胃癌病人仍然需要采用各種藥物進(jìn)行抗腫瘤治療，包括早中期胃癌的圍手術(shù)期藥物治療，晚期胃癌的藥物姑息治療等，因此有必要探索安全、有效的抗胃癌藥物應(yīng)用于臨床。

他汀類藥物是目前臨床上使用最廣、最有效的降膽固醇藥物。近年來(lái)，隨著對(duì)抗腫瘤輔助治療藥物的不斷深入研究，他汀類藥物被認(rèn)為可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管生成等機(jī)制發(fā)揮一定的抗腫瘤的作用。辛伐他汀是臨床上最常用的他汀類藥物，目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以通過(guò)多種分子機(jī)制對(duì)各種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生影響，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、頭頸部鱗癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞等[11-13]。既往亦有研究，辛伐他汀可通過(guò)上調(diào)Bax蛋白，下調(diào)Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)等機(jī)制抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡[14，15]。

為研究辛伐他汀對(duì)不同胃癌細(xì)胞系的作用，本課題我們選用胃癌BGC-823細(xì)胞作為研究對(duì)象，初步研究顯示，隨著反應(yīng)體系中辛伐他汀濃度的增加，胃癌BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率亦隨之升高，各濃度組之間比較差異有顯著性，其IC50為1.15μmol/L。進(jìn)一步根據(jù)IC50設(shè)計(jì)新的反應(yīng)體系，結(jié)果顯示胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡率與反應(yīng)體系中辛伐他汀濃度密切相關(guān)，即辛伐他汀濃度越高，胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡率同樣隨之升高。由此可見(jiàn)，辛伐他汀可顯著抑制胃癌BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡，但是其具有機(jī)制有待臨床進(jìn)一步研究。