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    GAS41基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)譜

    2012-11-22 01:19:24周芳亮吳文韜楊子劍向雙林丁小鳳
    關(guān)鍵詞:反義斑馬魚探針

    周芳亮,胡 翔,吳文韜,楊子劍,李 莉,向雙林,韓 梅,丁小鳳

    (湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)化學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國 長沙 410081)

    基因擴(kuò)增是人類腫瘤中基因過量表達(dá)的一個(gè)主要原因,其中在人類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中大量的基因擴(kuò)增是促進(jìn)其腫瘤產(chǎn)生的一個(gè)決定性因素.神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤序列41(GAS41)最初是從星型細(xì)胞瘤的4個(gè)發(fā)展階段中均擴(kuò)增到的一段高拷貝的DNA序列,它與轉(zhuǎn)錄因子AF-9和ENL結(jié)構(gòu)高度同源[1].后來研究發(fā)現(xiàn)GAS41是一個(gè)必需基因,泛素化表達(dá)于人類組織細(xì)胞核中,其中人腦表達(dá)量最高[2-3].而且GAS41基因在雞的前淋巴細(xì)胞系DT40中定點(diǎn)敲除后,細(xì)胞中的RNA合成大量降低,細(xì)胞隨后死亡.由此可見,GAS41是一個(gè)重要的管家基因,決定細(xì)胞的生長與存活[4].此外,GAS41與人類急性白血病融合蛋白MLL/AF10相互作用,參與人類血液惡性轉(zhuǎn)化[5].GAS41與通用轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體成員TFIIF相互作用,和特異的轉(zhuǎn)錄因子AP-2beta也相互作用促進(jìn)RNA轉(zhuǎn)錄從而參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[6-7].最近發(fā)現(xiàn)GAS41與磷酸酶PP2Cbeta相互作用,促進(jìn)了腫瘤抑制基因P53的去磷酸化,進(jìn)而抑制腫瘤抑制基因P53信號通道[8-9].因此,GAS41在細(xì)胞增殖與腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用.

    GAS41在胚胎發(fā)育中的功能卻少有報(bào)道,作者選用新型模式生物斑馬魚作為研究對象,它具有體型小、體外受精、生長迅速、產(chǎn)卵量大和胚胎透明等有利特點(diǎn)[10],便于觀察和操作,以此來分析GAS41在胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)譜.本研究發(fā)現(xiàn)GAS41是一個(gè)高度保守的基因,泛素化表達(dá)于斑馬魚成體組織中,特異性表達(dá)于胚胎頭部.這為進(jìn)一步研究GAS41在胚胎發(fā)育中的功能奠定了基礎(chǔ),同時(shí)為揭示GAS41在胚胎發(fā)育調(diào)控中的機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

    1 材料和方法

    1.1 材料

    斑馬魚購自武漢中國科學(xué)院水生生物研究所,總RNA抽提試劑盒和RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于QIAGEN,exTaqDNA聚合酶,SP6和T7 RNA聚合酶均為TAKARA產(chǎn)品,限制性內(nèi)切酶和連接酶購自NEB公司,地高辛標(biāo)記試劑盒購自Roche,pGEM-T Easy載體為Promega產(chǎn)品,DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自Fermentas公司,PCR引物合成和DNA測序均在上海生工生物工程有限公司完成,質(zhì)粒小量提取試劑盒和膠回收試劑盒購自長沙安比奧公司.兔抗GAS41抗體購于Sigma公司,Alexa 488羊抗兔熒光二抗購于Molecular Probes公司.其他常規(guī)試劑均購于上海生工生物工程有限公司.

    1.2 斑馬魚GAS41基因序列分析

    從GenBank中查到斑馬魚GAS41(YEATS4)基因的CDS序列(登錄號:BC076436),GAS41蛋白在不同物種中的序列比對在DNAStar軟件Meglign程序上進(jìn)行,GAS41基因的進(jìn)化樹用CLUSTAL X軟件分析.

    1.3 RT-PCR

    按照總RNA抽提試劑盒說明書分別提取斑馬魚胚胎發(fā)育中各時(shí)間點(diǎn)和成體斑馬魚各組織的總RNA.然后用RT-PCR方法擴(kuò)增GAS41 cDNA序列(PCR擴(kuò)增長度為180 bp).GAS41的RT-PCR引物序列見表1.PCR的反應(yīng)條件為:預(yù)變性94 ℃ 3 min,變性94 ℃ 30 s,退火60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,共28個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min.?dāng)U增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察GAS41基因的表達(dá)情況.同時(shí)擴(kuò)增β-actin作為內(nèi)參對照.

    表1 引物序列

    1.4 反義RNA探針制備

    載體構(gòu)建:采用RT-PCR方法以48 hpf時(shí)期斑馬魚胚胎的總RNA為模板擴(kuò)增GAS41全長cDNA序列(擴(kuò)增長度為681 bp).引物序列如表1. PCR的反應(yīng)條件為:預(yù)變性94 ℃ 3 min,變性94 ℃ 1 min,退火56 ℃ 1 min,延伸72 ℃ 1 min,共28個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min.將PCR產(chǎn)物插入pGEM-T Easy載體中,重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶鑒定和測序分析.

    探針制備:重組質(zhì)粒分別用NcoⅠ和NdeⅠ酶切線性化,經(jīng)SP6和T7 RNA聚合酶和地高辛標(biāo)記試劑盒體外轉(zhuǎn)錄獲得地高辛標(biāo)記的反義RNA探針和正義RNA探針.

    1.5 整體原位雜交

    采用40 g/L的多聚甲醛將各個(gè)時(shí)期的胚胎于4 ℃固定過夜,甲醇梯度脫水,并置于-20 ℃的甲醇中備用.原位雜交主要步驟為:將胚胎梯度復(fù)水,用蛋白酶K處理18 hpf時(shí)期以后的胚胎,用1×PBST清洗胚胎,于65 ℃雜交爐中將胚胎進(jìn)行預(yù)雜交4 h,然后分別加入反義RNA探針和正義對照RNA探針,于65 ℃雜交爐中雜交過夜.雜交第2天回收探針,以SSCT梯度清洗胚胎,加入anti-Dig-AP抗體與反義RNA探針4 ℃結(jié)合過夜.雜交第3天回收抗體并用1×PBST溶液清洗胚胎,然后加入BCIP/NBT(Roche)染液顯色,顯色完全后用1×PBST溶液沖洗,在顯微鏡下觀察并進(jìn)行拍照記錄結(jié)果.

    1.6 整體免疫組織化學(xué)

    采用40 g/L的多聚甲醛將不同發(fā)育時(shí)期的胚胎于4 ℃固定過夜,將胚胎置于含有10%羊血清的1×PBST中封閉1 h,加入GAS41多克隆抗體(一抗稀釋比例1∶200)4 ℃孵育過夜,1×PBST中洗滌30 min×3次.加入Alexa 488羊抗兔熒光二抗(二抗稀釋比例1∶100)于4 ℃孵育10 h, 1×PBST中洗滌15 min×3次.最后于熒光顯微鏡(Zeiss Axioskop 2)下分析熒光信號.

    1.7 Western印跡雜交

    圖1 斑馬魚和部分物種GAS41蛋白的同源性(A和B)與進(jìn)化樹(C)分析

    將不同發(fā)育時(shí)期的胚胎加入真核細(xì)胞裂解液[50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.2), 150 mmol/L NaCl, 體積分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-100, 10 g/L sodium deoxycholate, 1 g/L SDS] 含蛋白酶抑制劑,提取胚胎總蛋白.加入SDS上樣緩沖液,105 ℃金屬浴5 min, 將蛋白質(zhì)作12%的SDS-PAGE,轉(zhuǎn)移至PVDF膜.以10 g/L的脫脂奶粉室溫封閉1 h,兔抗GAS41多克隆抗體為一抗,稀釋為1∶500;辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗,稀釋為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1∶1 000.用DAB 進(jìn)行發(fā)色顯跡.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 斑馬魚GAS41基因序列的分析

    使用DNAStar軟件中的MegAlign程序進(jìn)行GAS41基因在不同物種中氨基酸同源序列比對分析.結(jié)果顯示,斑馬魚GAS41蛋白與人類(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculu)和大鼠(Rattus)的氨基酸序列同源性都為91.2%.不同物種GAS41蛋白同源氨基酸序列在N端tf2f結(jié)構(gòu)域?yàn)楸J貐^(qū)域,而在C端激活結(jié)構(gòu)域有一定程度的變異[3].人類、小鼠和大鼠中的GAS41氨基酸序列同源性高達(dá)98.7%~99.6%(圖1A,B).這提示GAS41蛋白質(zhì)具有高度保守性.

    使用CLUSTAL X系統(tǒng)軟件進(jìn)行GAS41在不同物種中的同源序列分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(圖1C).從圖中可以看出人類的同源序列與小鼠的GAS41序列親緣關(guān)系最近,其次為大鼠,與斑馬魚GAS41關(guān)系稍遠(yuǎn).

    圖2 GAS41在斑馬魚成體組織(A)和胚胎發(fā)育不同時(shí)期(B)表達(dá)情況的RT-PCR分析

    2.2 GAS41基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)譜

    2.2.1 RT-PCR分析 為了研究GAS41基因在斑馬魚中的作用,作者通過RT-PCR方法檢測了GAS41在成體斑馬魚器官組織中的表達(dá).圖2A顯示GAS41在斑馬魚9種主要的器官組織中均有特異性的擴(kuò)增條帶,其條帶信號強(qiáng)度沒有顯著差異.同時(shí)作者分析了GAS41基因在斑馬魚胚胎發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá).GAS41基因在胚胎受精后持續(xù)表達(dá),從4 h開始表達(dá)量升高,一直到72 h表達(dá)量基本不變(圖2B).

    2.2.2 整體原位雜交分析 pGEM-T Easy-GAS41重組質(zhì)粒用NcoⅠ酶切經(jīng)SP6 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄獲得反義RNA探針,用NdeⅠ酶切經(jīng)T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄獲得正義RNA探針.RNA探針經(jīng)20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳(圖3B),泳道M為DNA marker,泳道1為反義RNA探針,泳道2為正義RNA探針.探針大小約為681 bp,與預(yù)期大小相符.因RNA的復(fù)雜構(gòu)型合成的探針在普通凝膠電泳下均跑出2個(gè)清晰的條帶.

    箭頭指示GAS41的表達(dá)區(qū)域:m:中腦;i:間腦;c:小腦;h:后腦.比例尺:200 μm.M: DNA marker;1: 反義探針;2:正義探針圖3 GAS41基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的整體原位雜交表達(dá)譜(A)和GAS41探針電泳圖(B)

    與正義RNA探針相比,反義RNA探針在前期的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)可特異性結(jié)合GAS41.用反義RNA探針分別與不同發(fā)育時(shí)期的斑馬魚胚胎雜交,圖3A結(jié)果表明,GAS41在斑馬魚胚胎發(fā)育中均可檢測到GAS41基因轉(zhuǎn)錄,但表達(dá)部位不同.GAS41在受精后2 h和4 h普遍性表達(dá),8 h時(shí)集中出現(xiàn)在胚胎的一側(cè), 斑馬魚體節(jié)期18 h開始后GAS41特異性表達(dá)于胚胎頭部,尤其是中腦、間腦、小腦和后腦表達(dá)明顯,并且GAS41在這些部位的特異性表達(dá)一直持續(xù)至受精后48 h,專一性表達(dá)于腦部中樞神經(jīng)系統(tǒng).

    2.2.3 整體免疫組織化學(xué) 為了進(jìn)一步證實(shí)GAS41在斑馬魚頭部的表達(dá),作者采用GAS41抗體和綠色熒光標(biāo)記的第二抗體通過胚胎整體免疫組織化學(xué)方法檢測GAS41蛋白質(zhì)在胚胎發(fā)育中的表達(dá)情況.在熒光顯微鏡下觀察到受精后24,36和48 h胚胎中明顯的綠色熒光(圖4A).信號集中出現(xiàn)在胚胎的頭部,尤其是間腦(眼部)和中腦部位高表達(dá).同時(shí)檢測了GAS41抗體的特異性,圖4B為Western印跡分析斑馬魚不同時(shí)期GAS41蛋白質(zhì)的表達(dá),GAS41的多克隆抗體檢測到了GAS41(25 000),與預(yù)期蛋白大小相符,條帶單一,抗體特異性非常好,也顯示GAS41蛋白在斑馬魚胚胎受精后24~48 h均有表達(dá),且表達(dá)水平相當(dāng).

    箭頭指示GAS41的表達(dá)區(qū)域.比例尺:200 μm. M: protein marker圖4 GAS41基因在斑馬魚胚胎不同時(shí)期表達(dá)情況的整體免疫組織化學(xué)(A)和Western印跡(B)分析

    3 討論

    GAS41是最早在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中通過顯微切割調(diào)節(jié)cDNA捕獲技術(shù)分離到的人類腫瘤中高度擴(kuò)增的基因[1].GAS41處于染色體12q13-15區(qū)域,共227個(gè)氨基酸.GAS41的N端包括tf2f結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域普遍存在于YEATS家族轉(zhuǎn)錄因子AF9和ENL中,參與基因轉(zhuǎn)錄與染色質(zhì)重排[3,7].而在GAS41的C端60個(gè)氨基酸中包括大量的酸性氨基酸(27%),是一種帶負(fù)電荷的酸性α螺旋結(jié)構(gòu),這是真核轉(zhuǎn)錄因子激活結(jié)構(gòu)域的典型特點(diǎn),也是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的區(qū)域[3].GAS41通過C端激活結(jié)構(gòu)域與MLL融合蛋白AF10相互作用參與癌癥的發(fā)生發(fā)展過程[5].而且GAS41在雞前淋巴細(xì)胞中定點(diǎn)敲除后細(xì)胞死亡,GAS41的表達(dá)干擾后子宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長阻滯[4,11].由此可見GAS41在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖和惡性腫瘤中發(fā)揮了重要的作用[4-5,8].但GAS41在胚胎發(fā)育中的研究并未有報(bào)道.生物信息學(xué)軟件分析斑馬魚GAS41蛋白質(zhì)序列與部分物種中GAS41同源性達(dá)91.2%,該基因表現(xiàn)出較高的進(jìn)化保守性,這也說明GAS41基因的重要性.

    本研究以斑馬魚為模式動物對GAS41的時(shí)空表達(dá)譜進(jìn)行分析,GAS41泛素化表達(dá)于成體組織(腦、心臟、肝臟、腎、肌肉、小腸、卵巢、睪丸、眼睛)中,而GAS41在斑馬魚胚胎發(fā)育中特異性表達(dá)于胚胎頭部,尤其是中腦、間腦(眼部)、小腦和后腦表達(dá)明顯.這與此前的Northern印記雜交顯示GAS41在人腦組織中表達(dá)量最高是一致的[2-3],這說明GAS41在不同物種中表達(dá)的專一性.GAS41在胚胎體節(jié)期特異地表達(dá)于頭部的中樞神經(jīng)系統(tǒng),這些表明GAS41除了維持成體組織正常生理功能外,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、成熟等過程也扮演了重要的作用.

    通過顯微注射嗎啡啉修飾的反義寡核苷酸使GAS41表達(dá)下調(diào),從而分析GAS41對斑馬魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育表型及相關(guān)信號傳導(dǎo)通道的影響,由此揭示GAS41調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生的機(jī)制,這些問題仍在深入研究.總之,本研究結(jié)果為進(jìn)一步分析GAS41在斑馬魚胚胎發(fā)育中的功能奠定了基礎(chǔ),并且為以后深入研究GAS41在哺乳動物發(fā)育調(diào)控中的作用機(jī)理提供了有利的線索.

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