轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷對(duì)小鼠致敏性的研究

孫艷波，黃 毅，段妍慧，富麗娜，劉 金，顏亨梅

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081)

大米雖然被認(rèn)為是低致敏食品，并且是唯一可以免于過(guò)敏性試驗(yàn)的谷物，但是仍有對(duì)大米過(guò)敏的人存在，而采用了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的稻谷的潛在致敏性更是轉(zhuǎn)基因食品安全評(píng)價(jià)的焦點(diǎn)之一[1-2]．隨著食品安全問(wèn)題日益受到國(guó)家政府的重視，相關(guān)國(guó)際組織均建立了致敏性評(píng)估程序．目前轉(zhuǎn)基因食品致敏性評(píng)價(jià)一般首先根據(jù)FAO/WHO[3]和Codex Alimentarius Commission[4]建議的致敏性評(píng)估決策樹(shù)途徑，無(wú)論表達(dá)蛋白是否來(lái)源于已知過(guò)敏原，評(píng)價(jià)時(shí)都將其序列與已知過(guò)敏原的抗原決定簇比對(duì)，分析序列同源性；并利用生物信息學(xué)工具來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建將有助于闡明蛋白質(zhì)在分子水平上的效應(yīng)機(jī)制[5]．之后再利用動(dòng)物致敏模型進(jìn)行研究，用轉(zhuǎn)基因作物食品直接喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以觀察轉(zhuǎn)基因植物/食品的食用安全性．國(guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室相關(guān)研究多為28 d營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)或90 d亞慢性實(shí)驗(yàn)，其得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為無(wú)顯著性差異[6-8]．本實(shí)驗(yàn)考慮到小腸是主要的消化、吸收器官，對(duì)腸道免疫屏障進(jìn)行研究對(duì)致敏性的評(píng)價(jià)有重要意義[9]．因此，本研究選用供試小鼠腸道屏障系統(tǒng)中腸粘液sIgA水平和釋放到血清中的DAO水平，加之外周血血清中IgE檢測(cè)3項(xiàng)指標(biāo)作為過(guò)敏性檢測(cè)指標(biāo)，綜合判斷取食轉(zhuǎn)抗除草劑Bar基因稻谷后的小鼠是否出現(xiàn)致敏性反應(yīng)或病變．

1 材料和方法

1.1 材料

稻谷：實(shí)驗(yàn)品種Bar68-1(農(nóng)基安審字(2006)第060號(hào))為中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所培育抗草丁膦早秈稻；對(duì)照品種D68為Bar68-1的非轉(zhuǎn)基因親本．

飼料：基礎(chǔ)飼料[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2009-0009]，并參照國(guó)際上公認(rèn)的符合小鼠生長(zhǎng)發(fā)育繁殖要求的AIN-93G[10]的經(jīng)典飼料配方(全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料)而重新配比制作的飼料，轉(zhuǎn)基因、常規(guī)水稻的摻入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%(保證蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于18%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于3.0%，以確保小鼠正常的生長(zhǎng)發(fā)育需要，具體配方見(jiàn)表1)．

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)昆明小鼠60只，體重18～24 g[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2009-0004]．

主要試劑：小鼠sIgA、DAO、IgE ELISA定量測(cè)定試劑盒(武漢USCN life公司)．

主要儀器：高速冷凍離心機(jī)(TCL-16A)，酶標(biāo)儀(BIO-TEK680)．

表1 小鼠飼料配方質(zhì)量比

1.2 方法

1.2.1 PAT氨基酸序列的獲得以及過(guò)敏原蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比 PAT氨基酸序列的獲得可在NCBI網(wǎng)站http://ncbi.nlm.nih.gov上查找到bar gene X17220，通過(guò)基因信息可得到其表達(dá)的磷絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricin acetyl transferase，PAT)的全長(zhǎng)氨基酸序列．然后，將PAT的氨基酸序列在三大數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)：在SDAP上使用全序列比對(duì)、80 aa讀碼框滑行比對(duì)以及6 aa 框完全比對(duì)3 種算法進(jìn)行預(yù)測(cè)；在Farrp使用全序列比對(duì)和80 aa 讀碼框滑行比對(duì)2 種算法預(yù)測(cè)；在NCBI 上進(jìn)行全序列Blastp 分析．檢索使用缺省設(shè)置值, 通過(guò)評(píng)估E-values、比對(duì)長(zhǎng)度和一致性百分率來(lái)推斷PAT是否具有致敏性或潛在致敏性[3]．

1.2.2 PAT蛋白酶三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 將PAT蛋白的氨基酸序列輸入SWISS-MODEL Workspace后，得到三維建模預(yù)測(cè)的蛋白結(jié)構(gòu)，再通過(guò)PDB及PHYRE數(shù)據(jù)庫(kù)分析系統(tǒng)可以找出與PAT蛋白酶相似的已知蛋白空間結(jié)構(gòu)．通過(guò)分析已知的與PAT蛋白相似的蛋白酶的特性，推測(cè)出PAT酶是否有致敏性的可能．

1.2.3 動(dòng)物飼養(yǎng) 60只小鼠隨機(jī)等分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，分別供應(yīng)充足的飼料和水，保持鼠房的空氣流通和穩(wěn)定的溫濕度(溫度22～25 ℃，濕度50%～60%)．親代小鼠飼養(yǎng)90 d后，隨機(jī)抽取每組小鼠各20只進(jìn)行檢測(cè)，其余用于繁殖F1代小鼠．F1代小鼠成年后即用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，F(xiàn)2代小鼠做同樣處理．

1.2.3.1腸粘液sIgA的檢測(cè) 解剖小鼠，打開(kāi)腹腔，取其盲腸回部以上7 cm長(zhǎng)小腸段，拭去血污，縱向平鋪于濾紙上，手術(shù)剪挑開(kāi)腸段，刮取小腸所有內(nèi)容物與粘液于EP管中，加入1 mL PBS混勻．置于4 ℃冰箱保存．同樣的方法處理其他小鼠．樣本于4 ℃、離心機(jī)1 500 g離心20 min，取其上清．置于4 ℃冰箱保存待用．按照ELISA說(shuō)明書(shū)步驟操作，并于450 nm處讀出各孔吸光度(A值)．

1.2.3.2 血清DAO和IgE的檢測(cè) 小鼠摘除眼球放血，置于EP管中．靜置1 h后，以4 ℃、1 000 g離心20 min．取上層血清，置冰箱中4 ℃溫度下保存?zhèn)溆茫凑誆LISA說(shuō)明書(shū)步驟操作，并于450 nm處讀出各孔吸光度(A值)．

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)生物信息學(xué)對(duì)PAT的比對(duì)和分析

將膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)全序列183 aa找出后與三大蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的已知過(guò)敏原進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，PAT與已知致敏原無(wú)任何同源性(圖1～5)．

圖1 膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)全長(zhǎng)氨基酸序列

圖2 PAT蛋白序列在SDAP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)搜索結(jié)果

圖3 PAT蛋白序列與SDAP數(shù)據(jù)庫(kù)過(guò)敏原的部分比對(duì)

圖4 PAT蛋白序列與Farrp數(shù)據(jù)庫(kù)過(guò)敏原全序列的部分比對(duì)

圖5 PAT蛋白序列與Farrp數(shù)據(jù)庫(kù)80 aa滑行比對(duì)結(jié)果

由以上各圖可以看出，三大數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)均顯示PAT沒(méi)有與已知過(guò)敏源相似的序列，這說(shuō)明PAT酶的致敏可能性很低．

2.2 PAT蛋白酶三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及分析

將PAT蛋白酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)放入SWISS-MODEL三維結(jié)構(gòu)建模系統(tǒng)進(jìn)行解析，構(gòu)建其可能的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；通過(guò)PDB及PHYRE數(shù)據(jù)庫(kù)軟件找出與之相似三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，一共發(fā)現(xiàn)有13種已知的或預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與其相似，均為N-?；D(zhuǎn)移酶家族(N-acetyl Transferase Super Family，NAT SF)成員，PAT酶與常見(jiàn)的乙酰轉(zhuǎn)移酶具有相似的三維構(gòu)象特征(圖6～7)．它們共同的保守區(qū)域?yàn)橐阴］o酶A(acCoA)的化學(xué)綁定位點(diǎn)．

圖6 PAT酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、銅綠假單胞菌乙酰轉(zhuǎn)移酶PA4866結(jié)構(gòu)、銅綠假單胞桿菌乙酰轉(zhuǎn)移酶PA01的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)

圖7 PHYRE系統(tǒng)分析所得三維結(jié)構(gòu)相似性蛋白圖部分

2.3 sIgA、DAO和IgE含量檢測(cè)

隨機(jī)抽取各代小鼠每組20只，ELISA檢測(cè)sIgA、DAO和IgE含量，用酶標(biāo)儀于450 nm處讀出各樣本的吸光度OD值，即A值．SPSS17.0統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2．

表2 sIgA、DAO和IgE吸光度(A值)統(tǒng)計(jì)分析(mean±SD)

由表2可以看出，親代小鼠實(shí)驗(yàn)組腸道黏液sIgA的吸光度值(A值)略低于對(duì)照組，但描述性統(tǒng)計(jì)中的箱圖顯示其水平基本在對(duì)照組的范圍之內(nèi)，二者之間沒(méi)有顯著性的差異(0.703±0.038 vs 0.861±0.065，P=0.293>0.05)．血清DAO的A值波動(dòng)范圍略大于對(duì)照組，中數(shù)略高，但是并沒(méi)有顯著性差異(0.884±0.042 vs 0.844±0.061，P=0.678>0.05)．而血清IgE的組間比較時(shí)實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)了一個(gè)極大值，分析時(shí)用排除個(gè)案的方法排除此個(gè)案，再進(jìn)行組間獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，并沒(méi)有顯著性的差異(1.581±0.090 vs 1.313±0.102，P=0.985>0.05)．推測(cè)這個(gè)極大值的出現(xiàn)可能系實(shí)驗(yàn)者的操作誤差所造成，也有可能系小鼠自身產(chǎn)生了過(guò)敏反應(yīng)，但考慮到過(guò)敏原的多重性以及IgE的特異性，IgE的增高還有可能是由于其他感染、炎癥的發(fā)生，如鼠間的打斗撕咬導(dǎo)致傷口的感染發(fā)炎等．

F1代與F2代小鼠實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比, 腸道黏液中sIgA的含量、血清DAO含量、血清IgE含量與對(duì)照組也無(wú)顯著性差異(P=0.180，0.178，0.078 >0.05；P=0.074，0.497，0.440>0.05)．由此可見(jiàn)，食用轉(zhuǎn)Bar基因稻谷并沒(méi)有對(duì)小鼠的遺傳產(chǎn)生影響，親代實(shí)驗(yàn)組的后代并沒(méi)有因?yàn)殚L(zhǎng)期食用轉(zhuǎn)基因稻谷而出現(xiàn)機(jī)體過(guò)敏增加．在90 d的觀察期內(nèi)，每一代小鼠都沒(méi)有明顯的過(guò)敏癥狀出現(xiàn)，如嘔吐、腹瀉、過(guò)敏性休克等．

3 小結(jié)與討論

Bar基因(bialaphos resistance gene)來(lái)源于吸水鏈霉菌(streptamyces hygroscopicus)，屬于NAT Super Family中的一員．其作用機(jī)理為編碼的PAT蛋白能使除草劑中草丁膦的自由氨基乙?；セ钚裕瑥亩尸F(xiàn)對(duì)除草劑的耐受性．吸水鏈霉菌在自然界中廣泛存在，屬于生物圈的一部分，鏈霉菌屬中幾乎沒(méi)有任何菌種與人、動(dòng)物、植物的病原體有關(guān)．吸水鏈霉菌與鏈霉菌屬的許多菌種相似，表達(dá)蛋白PAT具有專(zhuān)一酶活性，可以認(rèn)為這些菌種至少含有Bar基因的同源物，而目前尚無(wú)這些同源物對(duì)人和動(dòng)物是毒素或過(guò)敏原的報(bào)道[11]．

分析外源基因編碼的氨基酸序列是判定食物是否致敏的最快捷方法，通常情況下致敏原具有結(jié)構(gòu)和功能上的保守性，因此通過(guò)比對(duì)序列的同源性能夠很好地對(duì)外源蛋白做出理論預(yù)測(cè)．本研究選用目前國(guó)際上過(guò)敏原相關(guān)信息比較豐富、功能強(qiáng)大并且可以互相補(bǔ)充的SDAP、Farrp和NCBI 三大數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行PAT蛋白的氨基酸序列(圖1)與已知過(guò)敏原相似性的比較，采用全序列比對(duì)、80 aa讀碼框滑行比對(duì)以及6 aa 框完全比對(duì)3種方法檢測(cè)(圖2～5)．

目前蛋白序列相似性分析大多僅局限于比較氨基酸一級(jí)序列，由于除氨基酸順序決定簇外還存在構(gòu)象決定簇致敏，而序列相似性分析并不包括構(gòu)象決定簇分析，因此，蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的比較有一定局限性，對(duì)于非連續(xù)抗原決定簇的比較并不適用，而蛋白質(zhì)的空間立體結(jié)構(gòu)是保守的，所以比較其三維結(jié)構(gòu)更為有效．本實(shí)驗(yàn)對(duì)PAT酶的三維構(gòu)象進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并找出了與其氨基酸序列相似的蛋白的三維結(jié)構(gòu)，均系NAT Super Family成員．這些乙酰轉(zhuǎn)移酶家族的共同點(diǎn)是具有乙酰輔酶A(acCoA)的化學(xué)綁定位點(diǎn)這一保守區(qū)域(圖6～7)．

分泌型免疫球蛋白 A ( secretory Immunoglobulin A，sIgA )是黏膜免疫系統(tǒng)的主要體液防御因子, 許多食物過(guò)敏個(gè)體都會(huì)出現(xiàn)腸道黏膜損傷、腸壁通透性增加的現(xiàn)象．以sIgA作為主要防御因子的黏膜免疫系統(tǒng)含有特異的淋巴組織，它和內(nèi)環(huán)境中的抗原接觸并吞噬抗原，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞反應(yīng)，B淋巴細(xì)胞分化的漿細(xì)胞分泌sIgA，起黏膜免疫保護(hù)作用[12-13]．如若腸道粘液中sIgA的含量超出正常水平，則說(shuō)明腸道免疫處于亢進(jìn)狀態(tài)，食物存在致敏性．二胺氧化酶(Diamine Oxidase，DAO)是一種具有高度活性的含有脫氨的腐胺和組胺的細(xì)胞內(nèi)酶，是組胺等多胺物質(zhì)的分解代謝酶，95%以上存在于哺乳動(dòng)物小腸的黏膜或纖毛上皮細(xì)胞中，其活性與絨毛高度及腸黏膜細(xì)胞的核酸和蛋白合成密切相關(guān)．小腸黏膜屏障功能衰竭時(shí)，腸黏膜細(xì)胞脫落入腸腔，DAO進(jìn)入腸細(xì)胞間隙淋巴管和血流，使血DAO升高．因此，血DAO活性可反映腸道損傷和修復(fù)情況．IgE 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是食品過(guò)敏的主要效應(yīng)，過(guò)敏原與IgE結(jié)合是過(guò)敏原發(fā)揮生物活性的中心環(huán)節(jié)[14]，可以通過(guò)對(duì)IgE水平的檢測(cè)來(lái)檢驗(yàn)是否機(jī)體產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)．

本實(shí)驗(yàn)的sIgA、DAO檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異，由此可見(jiàn)轉(zhuǎn)Bar基因水稻并沒(méi)有對(duì)小鼠腸道黏膜及免疫屏障造成損害，這可能是由于PAT蛋白對(duì)胃腸液無(wú)耐受性，在生物體的消化液中會(huì)快速降解掉．IgE的檢測(cè)也未出現(xiàn)顯著性差異，食用轉(zhuǎn)Bar基因稻谷3代的小鼠都沒(méi)有引起IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)，一方面可以說(shuō)明轉(zhuǎn)Bar基因的水稻無(wú)致敏性反應(yīng)，但另一方面也可能跟Bar基因在水稻中的表達(dá)含量較低有關(guān)，雖然受試小鼠長(zhǎng)期喂養(yǎng)且繁殖3代檢測(cè)，但微量的PAT蛋白也不足以致敏．

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