皂角刺總黃酮對肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力影響的實(shí)驗(yàn)研究

何光志

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，中國 貴陽 550002；2.大嶺山畜牧獸醫(yī)站，中國 東莞 523820；3.貴州省疾病預(yù)防控制中心，中國 貴陽 550003;4.貴陽學(xué)院， 中國 貴陽 550005)

皂角刺, 又稱天丁、皂針等，為豆科植物皂莢(GleditsiasinensisLain.)的干燥棘刺，主要產(chǎn)于江蘇、湖北，以及四川和貴州等地．皂角刺在中醫(yī)臨床中應(yīng)用歷史悠久，據(jù)《本草綱目》記載：“消腫脫毒，妒乳，風(fēng)癘惡瘡，排膿，殺蟲”[1]．現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，皂角刺具有抗菌、抗病毒和抗癌等作用．皂角刺總黃酮是皂角刺的提取物．本研究通過提取皂角刺總黃酮，體外細(xì)胞培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞, 探討皂角刺總黃酮對HepG2細(xì)胞細(xì)胞株的增殖和凋亡的影響, 從不同角度研究其抗腫瘤作用機(jī)制，旨在為深入開發(fā)利用皂角刺這一中藥材提供依據(jù)．

1 主要試劑與儀器

人肝癌細(xì)胞株HepG2，購自中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；MEM、DMEM、青霉素和鏈霉素，購自Gibco公司；96、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，購自Costar公司；胎牛血清，購自杭州四季青生物工程材料有限公司；Quick Apoptotic DNA ladder Detection kit，購自Biovision公司；流式細(xì)胞儀，購自美國Becton Dickson公司；瓊脂糖，購自上海生工生物工程有限公司; DMSO，購自北京亞太精細(xì)化工公司產(chǎn)品；WST-1，Quick Apoptotic DNA ladder Detection Kit試劑盒，大連寶生物；Transwell小室，購自美國Corning公司；纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和基底膜基質(zhì)凝膠(Matrigel)，購自BD公司；倒置熒光顯微鏡，上海光學(xué)儀器廠；Model550型酶標(biāo)儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；Transwell小室，美國Corning公司；流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ-FITC 試劑盒，購自美國BACKMAN COULTER 公司；WST-1，Amresco 科技公司產(chǎn)品．

2 方法

2.1 皂角刺總黃酮的提取

參照曹學(xué)鋒等[2]方法進(jìn)行提?。?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

采用MEM培養(yǎng)基(含10%滅活的胎牛血清、1.667 mkat/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)；2種細(xì)胞株均置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

2.3 皂角刺總黃酮對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用

2.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 對照組：每孔100 μL細(xì)胞懸液和10 μL DMSO稀釋液；實(shí)驗(yàn)組：每孔100 μL細(xì)胞懸液和10 μL用DMSO稀釋的皂角刺總黃酮，濃度分別為20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 mg/L共5組，每組設(shè)重復(fù)3次；空白組：每孔100 μL培養(yǎng)液及10 μL皂角刺總黃酮．

2.3.2 WST-1比色法測定皂角刺總黃酮對HepG2增殖的抑制作用 選取對數(shù)期的細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，用含體積比為10%的小牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×106個/mL，置于96孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，100 μL/孔．待細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給實(shí)驗(yàn)組加相應(yīng)濃度皂角刺總黃酮各10 μL，對照組、空白組各加DMSO稀釋液及皂角刺總黃酮10 μL；置于恒溫培養(yǎng)箱中作用12、24和48 h后，每孔加入現(xiàn)配好的四氮唑-1(Water Soluble Tetrazolium-1，WST-1)溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h；酶標(biāo)儀測定各孔光密度OD450值，記錄結(jié)果，計(jì)算均值；細(xì)胞增殖抑制率=[1-(A給藥組-A空白孔) /(A陰性對照組-A空白孔)]×100%，LOGIT 法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)．實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次．

2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段化

取1 000 μL的HepG2細(xì)胞濃度1×106個/mL的細(xì)胞懸液加入6孔培養(yǎng)板中，然后加入500 μL不同濃度(20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 mg/L)的皂角刺總黃酮作用48 h后，1 000 g離心5 min，加40 μL TE細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，采用Quick Apoptotic DNA ladder Detection Kit試劑盒抽提DNA，采用18 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析．

2.5 流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)法檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期密度為1×106的HepG2細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后棄上清，各組加入終濃度為20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 mg/L的皂角刺總黃酮作用48 h，采用胰酶消化、收集細(xì)胞，每樣本細(xì)胞數(shù)均大于1×106個，用4 ℃的PBS洗滌后，加250 μL結(jié)合緩沖液混勻細(xì)胞，再加2.5 μL AnnexinⅤ-FITC和2.5 μL PI (終濃度均為1 mg/L)，避光作用20 min后立即采用流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算細(xì)胞早晚期凋亡率．

2.6 細(xì)胞運(yùn)動實(shí)驗(yàn)

采用Kantor等所用方法，在Transwell小室濾膜的下室面鋪上10 μL FN(0.2 g/L)，自然晾干備用．含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的BSA(下同)的MEM培養(yǎng)基將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞制成1×106個/mL的細(xì)胞懸液．實(shí)驗(yàn)分為皂角刺總黃酮組和對照組，皂角刺總黃酮組小室的上室中分別加入100 μL皂角刺總黃酮終濃度分別為20.0 mg/L(A組)、40.0 mg/L(B組)、80.0 mg/L(C組)的細(xì)胞懸液，下室分別加入600 μL皂角刺總黃酮濃度分別為20.0、40.0、80.0 mg/L的0.1%BSA的MEM．對照組上室加入不含皂角刺總黃酮的細(xì)胞懸液，下室加入0.1%BSA的DMEM 600 μL，各組均重復(fù)3孔．皂角刺總黃酮組和對照組均放入37 ℃ 5%CO2中培養(yǎng)48 h后取出濾膜，甲醇固定，去掉上室面的腫瘤細(xì)胞，采用蘇木素-伊紅(HE)染色．隨機(jī)于顯微鏡下取上、下、左、右、中心5個視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)．以此細(xì)胞數(shù)目來表示腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力．

2.7 體外侵襲實(shí)驗(yàn)(穿膜實(shí)驗(yàn))

采用Albini等所用方法，在Transwell小室的濾膜的下室面鋪上FN并風(fēng)干后，在小室上室面均勻鋪上MEM稀釋的Matrigel，置37 ℃培養(yǎng)箱30 min使之凝固，其余步驟與2.6相同．

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析．

3 結(jié)果

3.1 皂角刺總黃酮對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用

運(yùn)用WST-1比色法，觀察皂角刺總黃酮作用于HepG2細(xì)胞12、48、72 h后對細(xì)胞增殖的影響．與對照組比較，皂角刺總黃酮在12、48、72 h及各濃度(20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 mg/L)均對HepG2細(xì)胞有抑制作用(P<0.05)；同一時(shí)相不同藥物濃度，同一藥物濃度不同時(shí)相各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)．隨著藥物濃度的提高和培養(yǎng)時(shí)間的延長，皂角刺總黃酮對HepG2細(xì)胞的抑制作用也逐漸增強(qiáng)，即具有劑量和時(shí)間依賴性．不同濃度的皂角刺總黃酮溶液作用于HepG2細(xì)胞48 h后的抑制作用最強(qiáng)，隨著藥物濃度的增高，對HepG2 細(xì)胞的抑制率也逐漸升高，與對照組比較有顯著性差異，皂角刺總黃酮的IC50為(190.62±0.89) mg /L，見表1．

表1 皂角刺總黃酮對HepG2增殖的影響(OD值，±s，n=9)

注：**表示P<0.01．

3.2 凋亡細(xì)胞的DNA斷裂

加入20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 mg/L的皂角刺總黃酮作用48 h后，細(xì)胞DNA均出現(xiàn)典型的DNA梯狀條帶(圖1)，說明皂角刺總黃酮能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡．

3.3 PI單標(biāo)檢測細(xì)胞凋亡率

在細(xì)胞周期G0/G1期前可檢測到sub-G1峰(sub-G1期細(xì)胞占檢測細(xì)胞的百分比即為凋亡率)．隨著皂角刺總黃酮作用時(shí)間的延長，凋亡率逐漸升高，與對照組凋亡率0.23%±0.04%相比, 20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 mg/L的皂角刺總黃酮作用HepG2細(xì)胞48 h后的凋亡率分別為9.27%±0.11%、15.23%±0.36%、25.72%±0.80%、32.08%±0.51%(P<0.01)和43.97%±1.47%(P<0.01)．

3.4 遷移試驗(yàn)

劃痕后肝癌細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后觀察20.0 mg/L(A組)、40.0 mg/L(B組)、80.0 mg/L(C組)3組細(xì)胞的平均遷移速率分別為(36.53±0.83)μm/h、(32.70±2.10)μm/h、(78.37±2.15)μm/h．A組和B組比較細(xì)胞遷移速率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但A、B組細(xì)胞劃痕后平均遷移速率顯著低于C組，A、B組分別與C組比較，均存在差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)．

3.5 穿膜實(shí)驗(yàn)

穿膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果，皂角刺總黃酮濃度分別為20.0 mg/L(A組)、40.0 mg/L(B組)、80.0 mg/L(C組)3組浸過濾膜的細(xì)胞數(shù)目分別為(21.77±0.91)、(20.60±0.85)和(55.80±2.75)個．A組和B組比較穿膜細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但A、B組穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯比C組少，A組、B組分別與C組作比較，均存在極顯著差異(P<0.01)．

4 討論

(1)原發(fā)性肝癌占我國惡性腫瘤死亡率的第二位[3-6]，是我國最常見的惡性腫瘤之一．肝癌在臨床診斷時(shí)多為中晚期，手術(shù)機(jī)會就會被延誤．近年來，國內(nèi)外治療肝癌的其他新技術(shù)和新方法療效依然不理想，中醫(yī)藥作為肝癌綜合治療的重要方法日益受到重視和肯定．

(2)中醫(yī)藥在預(yù)防肝癌發(fā)生、抑制瘤灶形成、防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢[7-8]．廣大學(xué)者借助現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段，對中醫(yī)藥在癌前預(yù)防、癌中根治、防止復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移等的作用機(jī)理進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)研究，提供了客觀的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)．據(jù)統(tǒng)計(jì)我國80%的原發(fā)性肝癌患者不同程度地接受過中醫(yī)藥治療，中醫(yī)藥在控制患者病情發(fā)展、減少復(fù)發(fā)、改善癥狀體征、提高生存質(zhì)量和延長生存等方面有著自己獨(dú)特的優(yōu)勢．因此，深入研究有效的抗癌中藥對肝癌細(xì)胞的凋亡和侵襲能力及其作用機(jī)制，對指導(dǎo)臨床用藥和研發(fā)中藥抗癌新藥具有重要的意義．

(3)抗癌中藥的化學(xué)成分含黃酮、皂苷、三萜、氨基酸、酚類等，其中主要是黃酮類化合物．傳統(tǒng)藥物皂角刺來源廣泛、作用多樣、不良反應(yīng)小，無論作為單味藥還是復(fù)方組成，在臨床應(yīng)用上都是一味十分有效的中藥材．徐哲等從皂角刺中分離得到黃酮中的化合物3β-acetoxyolean-12-en-28-oic acid 對人肝癌細(xì)胞株等7 種腫瘤細(xì)胞的生長均有較強(qiáng)的抑制作用[9]．

(4)皂角刺總黃酮是皂角刺的提取物．黃酮類化合物是一類天然有機(jī)化合物, 廣泛存在于自然界中許多藥用植物的根、葉、皮、果實(shí)以及水果和蔬菜中, 多以苷類形式存在, 一部分以游離形式存在, 具有多種潛在的藥用價(jià)值. 其抗腫瘤作用的研究由來已久, 大約從20 世紀(jì)70年代起就有人發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有較好的抗腫瘤作用[10]，其作用機(jī)制主要包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[11]．

(5)本研究通過四氮唑-1(Water Soluble Tetrazolium-1，WST-1)比色法檢測皂角刺總黃酮對HepG2細(xì)胞體外增殖活性的影響，瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果顯示不同濃度的皂角刺總黃酮處理組出現(xiàn)了凋亡細(xì)胞所特有的DNA ladder條帶，PI單染檢測sub-G1峰結(jié)果表明皂角刺總黃酮都能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡并具有時(shí)間依賴性．

(6)肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是肝癌死亡率居高不下的主要原因.腫瘤細(xì)胞能侵犯、破壞周圍組織細(xì)胞，發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，是腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素．肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程[12-13]．目前研究認(rèn)為，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移都需要借助于蛋白酶的表達(dá)與激活．基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是鋅離子依賴的內(nèi)分泌蛋白水解酶，它是人體內(nèi)降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellar matrix，ECM)的主要酶類，與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14-15]．本研究使用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)評價(jià)皂角刺總黃酮對肝癌細(xì)胞遷移運(yùn)動能力的影響．結(jié)果提示皂角刺總黃酮對肝癌細(xì)胞的遷移運(yùn)動能力具有明顯的抑制作用，由此作者認(rèn)為皂角刺總黃酮可抑制肝癌細(xì)胞向其他器官或組織轉(zhuǎn)移．

總之，本研究結(jié)果表明，皂角刺總黃酮可以抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力，為皂角刺總黃酮在臨床上用于肝癌的治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

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