RANK信號調(diào)控破骨細(xì)胞分化與成熟的研究進(jìn)展

梅良偉 桑文華 陳富春 李曉春 王登峰 吳卓 穆佐洲 邵海龍

1.陜西省第四人民醫(yī)院骨科，陜西 西安 710043 2.陜西省第四人民醫(yī)院病理科，陜西 西安 710043

健康骨骼通過骨的重塑來維持，首先由破骨細(xì)胞行使骨吸收功能形成骨吸收陷窩，接著成骨細(xì)胞在腔隙內(nèi)重新成骨，這是一個動態(tài)平衡的過程[1]。因此，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的結(jié)合在空間和時間上都受到嚴(yán)格的調(diào)控。破骨細(xì)胞是一種具有骨吸收功能的多核巨細(xì)胞，其主要來源于骨髓中形成的造血前體細(xì)胞。M-CSF和RANKL由成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞表達(dá)，為破骨前體細(xì)胞分化為成熟破骨細(xì)胞所必需[2]。M-CSF刺激破骨前體細(xì)胞表面表達(dá)RANK(由Tnfrsf11a編碼)，進(jìn)而使RANKL與其受體RANK結(jié)合。Tnfsf11或Tnfrsf11a基因缺失的小鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的石骨癥，同時伴有因破骨細(xì)胞完全死亡而導(dǎo)致的牙齒脫落缺陷[3]。RANKL-RANK信號也受到骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)(Tnfrsf11b編碼)的負(fù)調(diào)控，OPG是RANKL的一個可溶性誘導(dǎo)受體，能夠阻礙RANKL與RANK的結(jié)合[4]。

RANK是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的一名成員，它缺乏激活下游信號分子所需的內(nèi)在酶活性。因此，RANK必須通過募集配體分子例如TNFR相關(guān)性因子(TRAFs)，進(jìn)而激活MAPKs和NF-κB傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號[5]。RANK信號調(diào)控下游信號，從而導(dǎo)致單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞譜系的分化和成熟破骨細(xì)胞的激活。

在RANK信號的起始步驟，RANKL與相應(yīng)的受體RANK結(jié)合導(dǎo)致銜接蛋白如TRAF6的募集，從而形成RANK三聚體，同時快速激活MAPKs、NF-κB和AP-1[6]。繼而通過激活A(yù)P-1和協(xié)同刺激信號介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+振蕩，放大 NFATc1進(jìn)行信號傳遞[7]。最終，活化的NFATc1促使破骨細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控破骨細(xì)胞的多核和骨吸收功能。本文中筆者主要闡述目前已知的在這一過程中所涉及的分子機(jī)制，以及近期關(guān)于RANK信號調(diào)控破骨細(xì)胞的新發(fā)現(xiàn)。

1 RANK信號和TRAF銜接蛋白

RANKL與RANK結(jié)合促使RANK形成三聚體并募集銜接蛋白—TRAF6，從而啟動下游信號的級聯(lián)放大反應(yīng)。TRAF家族的其他成員如TRAF2、TRAF3和TRAF5，也可以與RANK結(jié)合激活破骨細(xì)胞分化所需的轉(zhuǎn)錄因子。然而，對TRAF6缺陷小鼠的研究[8]表明，TRAF6是主要的銜接蛋白，主要負(fù)責(zé)RANKL激活引起的信號級聯(lián)反應(yīng)。活化的TRAF6通過激活I(lǐng)κB激酶(IKK)復(fù)合體或者非典型蛋白激酶C(aPKC)或TGFβ活化激酶1(TAK1)依賴的磷酸化刺激NF-κB的激活，同時這也是一個需要IKKγ(也被稱為NEMO)泛素化以實(shí)現(xiàn)最佳激活的過程[9]。支架蛋白p62結(jié)合到TRAF6并與aPKCs相互作用，導(dǎo)致多聚蛋白復(fù)合物的形成并調(diào)節(jié)IKKβ[9]。TRAF6還可與TAK1、銜接蛋白TAK1結(jié)合蛋白1(TAB1)和TAB2形成復(fù)合物[10]。激活后，TAK1使IKK復(fù)合物磷酸化，從而進(jìn)一步激活NF-κB通路[11]。NF-κB信號對破骨細(xì)胞的形成至關(guān)重要，有研究表明，NF-κB p50/p52雙敲除小鼠因無法生成破骨細(xì)胞而表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨硬化性疾病[12]。AP-1轉(zhuǎn)錄因子包括Fos(c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2)、Jun(c-Jun、JunB和JunD)和ATF(ATFa、ATF2、ATF4和B-ATF)家族成員的激活也是通過銜接蛋白誘導(dǎo)c-Fos實(shí)現(xiàn)[13]。c-Fos基因敲除小鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的骨硬化病[14]。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB和AP-1是早期RANKL信號通路重要的下游靶點(diǎn)。銜接蛋白的募集也導(dǎo)致MAPKs的激活，包括c-Jun氮端激酶(JNK)、p38、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶和Akt/PKB[15]。近期有研究[16]發(fā)現(xiàn)，激活的C激酶1受體(RACK1)為Trp-Asp40(WD40)重復(fù)蛋白家族的一名成員，是破骨細(xì)胞分化的必要條件。RACK1充當(dāng)支架蛋白將TRAF6-TAK1復(fù)合物與MKK6而不是MKK3相結(jié)合，通過選擇性地促進(jìn)p38的激活在RANKL誘導(dǎo)的破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中起重要作用。此外，考慮到RACK1在RANKL誘導(dǎo)下的表達(dá)方式及其與β1、β2整合素亞單位和c-Src之間的關(guān)系，RACK1可能參與到破骨細(xì)胞的骨吸收功能階段。其他研究[17]表明，Akt、JNK和NF-κB通路的激活需要生長因子受體結(jié)合蛋白2(Grb2)—相關(guān)性結(jié)合-2(Gab2)。此外，磷脂酶Cγ2(PLCγ2)與Gab2形成復(fù)合物進(jìn)而使Gab2磷酸化，同時調(diào)節(jié)RANK募集Gab2。Lee等[18]的研究表明RANK-TRAF6-Rac1-NADPH氧化酶1依賴途徑產(chǎn)生的活性氧是MAPK激活和破骨細(xì)胞形成的必要條件。

2 共刺激信號

在初始階段NF-κB、c-Fos/AP-1和NFATc2誘發(fā)NFATc1后，RANK信號與免疫球蛋白樣受體/免疫受體酪氨酸活化基序(immunoglobulin-like receptor/immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)信號共同作用，這導(dǎo)致NFATc1的瀑布樣放大并且移位入核結(jié)合到DNA上聯(lián)同其他轉(zhuǎn)錄因子一起上調(diào)NFATc1靶基因的轉(zhuǎn)錄[19]。大量的體內(nèi)研究證明了NFATc1在破骨細(xì)胞形成中的重要作用。在動物實(shí)驗(yàn)中，破骨細(xì)胞特定NFATc1條件性敲除小鼠表現(xiàn)出骨硬化和破骨細(xì)胞形成抑制[20]。此外，NFATc1不僅調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性和骨形成，還調(diào)節(jié)其他生物系統(tǒng)中細(xì)胞的活化和發(fā)育，如免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和骨骼肌系統(tǒng)[21]。

除了RANK信號，免疫球蛋白樣受體如2型髓系細(xì)胞觸發(fā)受體(triggering receptor expressed in myeloid cells-2,TREM-2)和破骨細(xì)胞相關(guān)受體(osteoclast-associated receptor,OSCAR)也可以誘導(dǎo)NFATc1信號[22]。這些免疫受體具有短細(xì)胞質(zhì)尾的特點(diǎn)，并且與銜接蛋白如DNAX-活化蛋白12(DNAX-activation protein 12,DAP12)或Fc受體共同的γ亞基(Fc receptor common γ subunit,FcRγ)相關(guān)聯(lián)，其中就包含ITAM[19]。當(dāng)ITAM由于RANKL的刺激發(fā)生酪氨酸磷酸化時，一個含有酪氨酸激酶的復(fù)合物便形成，這些酪氨酸激酶包括布魯頓酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,Btk)/Tec、銜接分子B細(xì)胞連接蛋白(adaptor molecules B cell linker protein,BLNK)和SLP-76，這些復(fù)合物將RANK和ITAM下游信號融為一體，最終激活PLCγ2的磷酸化[23]。Btk和Tec缺陷小鼠由于破骨細(xì)胞分化被破壞、RANKL誘導(dǎo)的PLCγ2酪氨酸磷酸化高度抑制而表現(xiàn)為骨硬化表型[23]。同時，由于Btk和Tec缺陷，使得RANKL誘導(dǎo)的Ca2+振蕩在細(xì)胞內(nèi)消失。這表明，Btk和Tec對破骨細(xì)胞形成至關(guān)重要，并且這些激酶通過PLCγ2和Ca2+信號通路調(diào)節(jié)NFATc1的激活。當(dāng)DAP12和FcRγ缺乏時，在細(xì)胞內(nèi)無法檢測到Btk/Tec和BLNK/SLP-76復(fù)合物的形成，這表明Tec激酶和BLNK復(fù)合物的形成均需要ITAM信號的激活，該復(fù)合物可作為連接RANK和ITAM信號的分子開關(guān)。近期一項研究[24]表明，在破骨細(xì)胞形成過程中由RANKL刺激產(chǎn)生的早期雌激素基因1(EEIG1)能夠與RANK相互作用，并且RANKL刺激后與Gab2、PLCγ2和Btk/Tec激酶相連接。EEIG1敲除導(dǎo)致RANK誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成明顯減少，這是因?yàn)镽ANKL介導(dǎo)的PLCγ2的活化和NFATc1的產(chǎn)生被抑制所引起。在RANKL的刺激下，RANK形成了包括EEIG1、Gab2、PLCγ2和Btk/Tec在內(nèi)的信號復(fù)合物，這表明，EEIG1為一種銜接蛋白同時也是RANK和ITAM信號的連接蛋白[24]。

PLCγ2也通過其高度保守域與RANK相互作用，并且與Gab2和TRAF6形成復(fù)合物，從而表現(xiàn)為一種信號依賴方式的磷酸化。ITAM信號與RANK信號一起介導(dǎo)長期的感應(yīng)性PLCγ2激活?；罨腜LCγ2通過分解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸產(chǎn)生1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)，IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)表面的IP3受體結(jié)合。因此，儲存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+被釋放到胞質(zhì)中，并誘導(dǎo)產(chǎn)生Ca2+振蕩[25]。NFATc1的誘導(dǎo)也受其亞細(xì)胞定位的調(diào)控，這依賴于其絲氨酸殘基的磷酸化[26]。在缺乏RANKL刺激的條件下，NFATc1主要由位于細(xì)胞質(zhì)中的活性糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)磷酸化。當(dāng)RANK信號在其抑制性絲氨酸殘基(GSK-3β的Ser9)處誘導(dǎo)GSK-3β磷酸化后，GSK-3β即被滅活。這使NFATc1通過鈣依賴磷酸酶去磷酸化，隨后轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，NFATc1誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)。在破骨細(xì)胞過表達(dá)GSK-3β的突變型轉(zhuǎn)基因小鼠中，由于體內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)量的減少以及體外破骨細(xì)胞形成和NFATc1感應(yīng)受損而表現(xiàn)出骨硬化病[27]。此外，抑制3-磷酸肌醇激酶可以降低破骨細(xì)胞的形成，減弱NFATc1的表達(dá)。GSK-3β因磷酸化增加而失活，Akt在破骨細(xì)胞前體中過表達(dá)也可以引起NFATc1的表達(dá)及其核定位。最近的一項研究[28]表明，PKCβ通過滅活GSK-3β調(diào)控NFATc1的激活，從而導(dǎo)致破骨細(xì)胞生成。這些結(jié)果表明，在破骨細(xì)胞分化過程中，GSK-3β/NFATc1級聯(lián)信號在RANK信號通路內(nèi)具有重要作用。

3 破骨細(xì)胞分化晚期的主要信號

在RANK信號后期，擴(kuò)增的NFATc1激活和誘導(dǎo)破骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)，這些基因能夠編碼與破骨細(xì)胞分化、融合和功能相關(guān)的蛋白。此外，在破骨細(xì)胞分化過程中，NFATc1的正性或負(fù)性調(diào)節(jié)因子得到增強(qiáng)或抑制。在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過程中，負(fù)性調(diào)節(jié)因子的表達(dá)下調(diào)：v-maf肌肉筋膜纖維肉瘤癌基因家族、蛋白B(MafB)、干擾素調(diào)節(jié)因子-8(IRF8)以及B細(xì)胞淋巴瘤6(Bcl6)等在破骨細(xì)胞分化過程中抑制NFATc1表達(dá)[29-31]。所有負(fù)性調(diào)節(jié)因子都被轉(zhuǎn)錄抑制因子B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的成熟蛋白1(Blimp1)下調(diào)[32]。在破骨細(xì)胞分化過程中，Blimp1是由RANKL刺激引起的，而在破骨細(xì)胞中缺乏Blimp1的小鼠，由于破骨細(xì)胞嚴(yán)重破壞而表現(xiàn)出骨硬化表型[33]。最近有研究結(jié)果[32]表明，sirtuin 6(Sirt6)是一種核組蛋白去乙?；福ㄟ^Blimp1直接抑制抗破骨基因的表達(dá)。在造血細(xì)胞中，Sirt6的特異性消融可以通過降低破骨細(xì)胞的分化而增加骨體積。RANKL誘導(dǎo)的NFATc1上調(diào)了Sirt6的表達(dá)，而誘導(dǎo)的Sirt6通過抑制MafB與Blimp1的結(jié)合，對NFATc1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了積極的調(diào)控作用[32]。因此，NFATc1通過誘導(dǎo)其靶基因Blimp1和Sirt6的表達(dá)來維持其自身的表達(dá)，并下調(diào)負(fù)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。

樹突狀細(xì)胞特異性跨膜蛋白(DC-STAMP)、液泡質(zhì)子泵亞單位Atp6v0d2和c-Src底物Tks5等幾種蛋白參與破骨細(xì)胞間的融合；其表達(dá)受NFATc1與PU.1、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)和c-Fos的調(diào)控。DC-STAMP缺陷型小鼠表現(xiàn)為中度的骨硬化，這與大量TRAP陽性破骨細(xì)胞不同的是雖具有骨吸收功能，但吸收能力不完全[34]。同樣，Atp6v0d2缺陷型小鼠由于缺乏多核TRAP陽性破骨細(xì)胞也表現(xiàn)為中度骨硬化；然而，這些小鼠主要是單核TRAP陽性細(xì)胞[35]。αVβ3，一種整合素受體，能夠與骨基質(zhì)中的維甲酸結(jié)合，通過募集c-Src酪氨酸激酶的合成導(dǎo)致骨吸收[36]。接下來，c-Src使Syk磷酸化，Syk通過募集DAP12和SLP-76形成銜接蛋白復(fù)合物，激活包括Rac在內(nèi)的小Rho家族GTP酶。這些相互作用通過溶酶體分泌囊泡與細(xì)胞質(zhì)膜融合，導(dǎo)致皺褶邊界膜的形成。至于骨吸收，H離子通過皺褶邊界被泵出，并與Cl離子形成HCl將骨基質(zhì)分解，同時激活各種水解酶如蛋白酶K、CLC-7氯離子通道和TRAP[7]。

Kim等[37]認(rèn)為，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的RANK通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的肌動蛋白骨架和存活，特異性地參與破骨細(xì)胞的形成和功能。他們使用了一種細(xì)胞通透性RANK受體抑制劑(RRI)靶向作用于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的RANK。RRI肽可阻斷RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成，并通過Vav3、Rac1和細(xì)胞分裂周期42破壞下游RANK信號，從而破壞破骨細(xì)胞形成過程中產(chǎn)生的肌動蛋白環(huán)。此外，RRI抑制破骨細(xì)胞的骨吸收作用和增強(qiáng)破骨細(xì)胞的凋亡。RRI肽并不能消除任何TRAF6介導(dǎo)的蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)，亦不能改變NFATc1和破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)。這些結(jié)果表明，RRI肽作用于NFATc1和破骨細(xì)胞形成的高度特異性調(diào)控之后，主要作用于破骨細(xì)胞形成的晚期，而不影響參與免疫信號等多種信號通路的其他信號分子。

4 總結(jié)

RANK信號是調(diào)控破骨細(xì)胞分化和功能的關(guān)鍵分子信號。這一發(fā)現(xiàn)使破骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中能夠產(chǎn)生幾乎純合的種群，從而促進(jìn)了對包括細(xì)胞分化和功能在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制和信號網(wǎng)絡(luò)的解析。該信號始于RANKL與RANK的結(jié)合，并通過募集大量的銜接蛋白如TRAF6和激酶形成一系列的信號復(fù)合物，從而促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)。RANK信號與免疫受體/ITAM信號相互作用，這是破骨細(xì)胞生成所需的另一個信號通路。RANKL信號與ITAM介導(dǎo)的Ca2+信號一起，最終誘導(dǎo)NFATc1的擴(kuò)增和破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。正因如此，針對這些信號的分子藥物，不僅會抑制破骨細(xì)胞的生成，也可能對其他系統(tǒng)如免疫系統(tǒng)造成影響，探討破骨細(xì)胞生成、分化及功能的機(jī)制，尋找真正的特異性靶基因及靶分子尤為關(guān)鍵。然而，關(guān)于共同分子的調(diào)節(jié)以確保破骨細(xì)胞形成所需的特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式尚不清楚。因此，通過對RANK信號通路機(jī)制的探討，TRAF6、ITAM、Ca2+以及NFATc1等作為調(diào)控破骨細(xì)胞分化與成熟的潛在新靶點(diǎn)，將為今后骨科相關(guān)疾病的診治和藥物研發(fā)提供新的選擇。