藿香內(nèi)生細(xì)菌HX-2的鑒定、耐性及對(duì)宿主植物的促生作用

江緒文，李賀勤*，譚勇

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 青島266109；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧530200)

當(dāng)前，不斷惡化的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境導(dǎo)致我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上農(nóng)藥、化肥的投入非常大，這不僅降低了農(nóng)作物品質(zhì)，破壞了土壤生境，加劇了環(huán)境污染，也提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本。如何減少農(nóng)藥、化肥的投入，降低污染，成為我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟待解決的一個(gè)問題[1]。微生物菌肥因可提高作物產(chǎn)量，改進(jìn)作物品質(zhì)，且具有肥效持久、不破壞土壤結(jié)構(gòu)、無毒無污染、保護(hù)生態(tài)環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，成為一條緩解當(dāng)前這一問題的有效發(fā)展途徑[2]，其中利用高效植物生長(zhǎng)促進(jìn)菌研制新型微生物肥料已成為國內(nèi)外生物菌肥研究的熱點(diǎn)之一[3]。

植物內(nèi)生細(xì)菌(endophytic bacteria)，通常指在生活史的某一階段或全部階段生活在健康植物組織內(nèi)又不對(duì)植物組織造成明顯病害癥狀的一些細(xì)菌[4]。在目前研究過的所有植物中均發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生細(xì)菌，它們存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等部位，是一類巨大的微生物資源[5]。內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能，主要通過產(chǎn)生植物生長(zhǎng)物質(zhì)(如植物生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞激動(dòng)素等)、自身的固氮、溶磷或通過增強(qiáng)植物對(duì)礦物質(zhì)利用的有效性以及對(duì)不同植物病原菌的拮抗作用，從而間接地促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物對(duì)生物和非生物脅迫的抗性[6]。因此，將具有良好促生潛力的內(nèi)生細(xì)菌應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，可以在一定程度上替代化肥和農(nóng)藥。前人已從小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)等植物中分離出了超過120種54個(gè)屬的內(nèi)生細(xì)菌，其中比較常見的主要有芽孢桿菌(Baciullsspp.)、假單孢菌(Psuedomonasspp.)、土壤桿菌(Arrobacetriumspp.)、歐文氏菌(Erwiniaspp.)等[7]，這些內(nèi)生細(xì)菌多具有促生功能，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用前景巨大。

藿香(Agastacherugosa)為唇形科多年生草本植物，全株具芳香味，可作園林綠化植物，亦可作保健特色蔬菜食用，也是畜禽飼料添加劑的常用原料[8-9]，其芳香揮發(fā)油還是制造多種中成藥的原料，市場(chǎng)需求大。由于藿香野生植物資源有限，現(xiàn)多采用人工栽培。為應(yīng)對(duì)不斷惡化的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境，發(fā)展藿香生產(chǎn)，開發(fā)藿香豐產(chǎn)栽培技術(shù)尤為重要。內(nèi)生菌不僅為植物生長(zhǎng)提供所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，還能提高植物對(duì)不良環(huán)境的抗性，比如干旱、鹽害、重金屬等[10]。目前有關(guān)藿香內(nèi)生細(xì)菌篩選及生物學(xué)特性的研究還未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以從青島嶗山藿香葉片中分離的一株內(nèi)生細(xì)菌HX-2為研究對(duì)象，測(cè)定其生物學(xué)特性，結(jié)合16S rDNA序列分析，鑒定其歸屬，并采用體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了HX-2對(duì)藿香種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的促生效應(yīng)，為該菌株開發(fā)成微生物菌肥提供理論依據(jù)，為藿香豐產(chǎn)栽培提供新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

內(nèi)生細(xì)菌HX-2由作物逆境栽培生理與調(diào)控課題組從青島嶗山藿香植株葉片中分離獲得，現(xiàn)保存于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省旱作農(nóng)業(yè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。藿香種子采自青島嶗山，經(jīng)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院譚勇教授鑒定。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、金氏B液體培養(yǎng)基、Salkowsk顯色劑、革蘭氏染色液試劑盒、芽孢染色液試劑盒、Kovacs氏靛基質(zhì)試劑盒以及有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司，2×Taq PCR MasterMix購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司，引物合成和PCR產(chǎn)物測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成，其他試劑為國產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)于2015年10月至2016年4月期間進(jìn)行。

1.2 菌株鑒定

將內(nèi)生細(xì)菌HX-2在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上30 ℃純化培養(yǎng)24 h，觀察并描述菌落的形態(tài)、光澤、質(zhì)地、邊緣特征、表面特征、隆起形狀及菌落顏色等特征。并按照革蘭氏染色液試劑盒、芽孢染色液試劑盒說明書進(jìn)行染色處理。將接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基30 ℃恒溫180 r·min-1搖培48 h的菌液收集，進(jìn)行16S rDNA分子鑒定，重復(fù)3次。按照細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒說明書提取HX-2的基因組，以此基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通用引物為27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，總反應(yīng)體系為20 μL，PCR擴(kuò)增條件: 94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min后存于4 ℃。將 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在GeneBank 上進(jìn)行Blast 比對(duì)，獲得與目標(biāo)菌株相似性較高的序列，再用Clustalx比對(duì)，采用MEGA 5.1工具構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 產(chǎn)激素吲哚乙酸和溶磷能力測(cè)定

將在金氏B液體培養(yǎng)基上30 ℃恒溫180 r·min-1搖培48 h的菌液按照Kovacs氏靛基質(zhì)試劑盒說明書進(jìn)行操作，顏色變紅表明內(nèi)生細(xì)菌HX-2能產(chǎn)生吲哚乙酸，顏色越深，表明產(chǎn)生的吲哚乙酸越多，重復(fù)3次。以吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將培養(yǎng)48 h的菌懸液和對(duì)照10000 r·min-1離心10 min后取上清，加入等體積的Salkowsk顯色劑，室溫下避光顯色 20 min，測(cè)定其OD530 nm吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算內(nèi)生細(xì)菌分泌吲哚乙酸的含量[11]。將HX-2菌株點(diǎn)接于固體有機(jī)磷培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng) 7 d，觀察有無溶磷圈，并測(cè)定溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值，比值為 1 表示無解磷能力[12]，重復(fù)3次。

1.4 耐性測(cè)定

1.4.1耐酸堿性測(cè)定 將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HX-2菌液0.2 mL加入20 mL pH為4，5，6，7，8，9，10的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫?fù)u床180 r·min-1培養(yǎng)48 h，測(cè)菌液OD600 nm的吸光值，以未接菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基作對(duì)照，重復(fù)3次。

1.4.2耐鹽性測(cè)定 將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HX-2菌液0.2 mL加入20 mL NaCl含量為0.5%，2.0%，4.0%，6.0%，8.0%，10.0%的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫?fù)u床180 r·min-1培養(yǎng)48 h，測(cè)菌液OD600 nm的吸光值，以未接菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基作對(duì)照，重復(fù)3次。

1.4.3耐重金屬銅測(cè)定 將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HX-2菌液0.2 mL加入20 mL Cu2+含量為0，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mmol·L-1的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫?fù)u床180 r·min-1培養(yǎng)48 h，測(cè)菌液OD600 nm的吸光值，以未接菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基作對(duì)照，重復(fù)3次。

1.5 促生實(shí)驗(yàn)

1.5.1種子萌發(fā) 將30 ℃恒溫 180 r·min-1搖培48 h 的菌液，10000 r·min-1離心1 min留取上清液。挑選飽滿健康、大小一致的藿香種子，0.5% NaClO溶液消毒10 min后，用無菌蒸餾水清洗3遍，然后用吸水紙吸去種子表面浮水，將消毒后的種子室溫浸泡在上述上清液中12 h。采用紙床發(fā)芽，在發(fā)芽盒底部墊兩層發(fā)芽紙，用無菌蒸餾水充分潤(rùn)濕后，將浸泡后的種子整齊排放在發(fā)芽紙上，之后蓋上盒蓋，置于智能人工氣候箱中進(jìn)行發(fā)芽，溫度為30 ℃，光照為10 h，每處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)30粒種子。以未浸泡的種子和未接種菌體HX-2的培養(yǎng)基浸泡的種子為對(duì)照，分別記作CK1和CK2。以后每天觀察并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)，于第4天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)(germination energy, GE)，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率(germination rate, GR)[13]。

GE=4 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%
GR=7 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

1.5.2幼苗生長(zhǎng) 搖培48 h 后的菌液經(jīng)4000 r·min-1離心5 min后，保留菌體，用無菌水調(diào)菌體濃度為 108cfu·mL-1。營養(yǎng)土與粗粒蛭石按1∶3的比例混勻，經(jīng)高溫滅菌后稱取100 g置于一次性方形小花盆中，含水容積重量比為10%。將藿香種子播于其中，每盆3粒種子，出苗后只保留1株。出苗7 d后，采用灌根法接種菌HX-2，共設(shè)2個(gè)處理，以不接菌的處理為對(duì)照，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)10株苗。30 d后進(jìn)行破壞性取樣，測(cè)藿香幼苗株高、根長(zhǎng)、莖粗、葉面積、幼苗鮮重與干重、葉綠素含量和根系活力。幼苗株高、根長(zhǎng)、莖粗采用游標(biāo)卡尺測(cè)量，葉面積采用方格紙法測(cè)量[14]，幼苗鮮重與干重采用萬分之一天平測(cè)量，葉綠素含量采用日本美能達(dá)SPAD-502微型葉綠素儀測(cè)定，用SPAD值表示[15]；根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)[16]法測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan法檢驗(yàn)各參數(shù)不同處理間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HX-2的鑒定

在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h，菌落圓形扁平，邊緣整齊，表面干燥，灰白色，中間有一皺點(diǎn)；革蘭氏染色和芽孢染色均呈陽性，桿狀，芽孢呈橢圓形。在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h，高度混濁，表面無膜。以其基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物測(cè)序得片段大小為1459 bp。登錄NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，選取10個(gè)相似度較高的菌株16S rDNA基因序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，HX-2與巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium(KC189946.1)聚在一個(gè)分支，相似率達(dá)99.0%，說明HX-2與該菌株親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)特征和16S rDNA基因序列分析結(jié)果，判定HX-2為巨大芽孢桿菌，命名為Bacillusmegateriumstrain HX-2。

圖1 菌株HX-2系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain HX-2

2.2 產(chǎn)吲哚乙酸和溶磷能力分析

圖2 pH對(duì)菌株HX-2生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of pH on strain HX-2不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。The different lowercase letters show significant difference at P<0.05 level. The same below.

在含100 mg·L-1色氨酸的金氏B液體培養(yǎng)基中，加入該菌培養(yǎng)后Kovacs氏靛基質(zhì)試劑變紅，說明內(nèi)生菌HX-2具有產(chǎn)生吲哚乙酸的能力。Salkowsk顯色后OD530 nm為0.732，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.021x+0.016 (R2=0.957，y代表吸光值，x代表濃度)計(jì)算得吲哚乙酸的含量為34.10 mg·L-1。在有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生透明圈，溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值為1.3，表明內(nèi)生菌HX-2具有溶解有機(jī)磷的能力。

2.3 耐性分析

2.3.1耐酸堿性 含鹽量0.5%的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，當(dāng)pH為4時(shí)，內(nèi)生細(xì)菌HX-2不生長(zhǎng)，隨pH值升高，OD600 nm值越來越大且差異顯著，表明菌株逐漸生長(zhǎng)旺盛；當(dāng)pH為8時(shí)，OD600 nm值最大，表明菌株此時(shí)生長(zhǎng)最旺盛；pH值繼續(xù)升高，OD600 nm值顯著下降，表明菌株生長(zhǎng)下降；當(dāng)pH為10時(shí)，菌株生長(zhǎng)最慢(圖2)。可知，菌株HX-2生長(zhǎng)較旺盛的pH范圍是5～9。

2.3.2耐鹽性 pH為8的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，當(dāng)NaCl含量為0.5%時(shí)，OD600 nm值最大(圖3)，表明此時(shí)內(nèi)生細(xì)菌HX-2的生長(zhǎng)最旺盛；隨NaCl含量的增加，OD600 nm值呈下降趨勢(shì)，表明菌株逐漸生長(zhǎng)變慢；當(dāng)NaCl濃度大于10.0%時(shí)，菌株HX-2生長(zhǎng)更慢或停止生長(zhǎng)，表明菌株HX-2具有一定的耐鹽性，耐鹽范圍為0.5%～8.0%。

2.3.3重金屬Cu2+耐性 pH為8的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，隨Cu2+含量增加，OD600 nm值增大，當(dāng)Cu2+含量為1.0 mmol·L-1時(shí)，OD600 nm值最大(圖4)，表明此時(shí)內(nèi)生細(xì)菌HX-2的生長(zhǎng)最旺盛；隨Cu2+含量的增加，OD600 nm值呈下降趨勢(shì)，表明菌株生長(zhǎng)逐漸變慢；當(dāng)Cu2+含量大于8.0 mmol·L-1時(shí)，菌株HX-2停止生長(zhǎng)，表明菌株HX-2具有一定的耐重金屬Cu2+能力，耐性范圍為0～6.0 mmol·L-1。

圖3 NaCl對(duì)菌株HX-2生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of NaCl on strain HX-2

圖4 Cu2+對(duì)菌株HX-2生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of Cu2+ on strain HX-2

2.4 促生實(shí)驗(yàn)

2.4.1菌株HX-2對(duì)種子萌發(fā)的影響 與未浸泡處理的種子(CK1)相比，培養(yǎng)基浸泡(CK2)和菌液浸泡(T)處理均能顯著提高藿香種子的發(fā)芽勢(shì)，分別提高了8.06%和22.59%，且培養(yǎng)基浸泡的種子和菌液浸泡的種子的發(fā)芽勢(shì)存在顯著差異(P<0.05)。同樣，培養(yǎng)基浸泡(CK2)和菌液浸泡(T)處理也能顯著提高藿香種子的發(fā)芽率，分別提高了6.18%和17.95%，且培養(yǎng)基浸泡的種子和菌液浸泡的種子發(fā)芽率也存在顯著差異(表1)。由此可知，內(nèi)生菌HX-2培養(yǎng)液浸種處理可以促進(jìn)藿香種子萌發(fā)。

表1 菌株HX-2對(duì)藿香種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of HX-2 on seed germination of A. rugosa

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。CK1：未浸泡處理的種子; CK2：培養(yǎng)基浸泡處理的種子; T：菌液浸泡處理的種子。

Note: Data in same column followed by different letters indicate significant difference atP<0.05. The same below. CK1：Control 1, seed unsoaked； CK2：Control 2, seed soaked with liquid medium； T：Treatment of strain HX-2.

2.4.2菌株HX-2對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響 未接種HX-2處理下，藿香幼苗的株高、根長(zhǎng)、莖粗、葉面積分別為8.14 cm、5.76 cm、0.48 cm和16.55 cm2；接種HX-2處理下，株高、根長(zhǎng)、莖粗、葉面積分別為9.53 cm、6.81 cm、0.53 cm和18.98 cm2，分別提高了17.08%，18.23%，10.42%和14.68%，且除莖粗外均有顯著性差異(P<0.05)。同樣，未接種HX-2處理下，藿香幼苗的鮮重、干重為2.4254和0.2317 g·株-1，接種HX-2處理下，鮮重、干重為2.9781和0.2895 g·株-1，顯著提高了22.79%和24.95%。接種HX-2后，葉綠素含量和根系活力分別由22.9(SPAD值)、9.01 μg·g-1FW·h-1提高至25.2(SPAD值)、10.74 μg·g-1FW·h-1，分別提高了10.04%和19.20%，且有顯著性差異 (P<0.05) (表2)?？梢?，接種內(nèi)生細(xì)菌HX-2可以促進(jìn)藿香幼苗生長(zhǎng)。

表2 菌株HX-2對(duì)藿香幼苗生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of HX-2 on seedling growth of A. rugosa

CK：對(duì)照組Control；CK+HX-2：接種內(nèi)生細(xì)菌HX-2處理Treatment of strain HX-2.

3 討論

內(nèi)生細(xì)菌在寄主植物體內(nèi)生存空間穩(wěn)定，易定殖，受外界環(huán)境影響小，長(zhǎng)期的進(jìn)化選擇形成了植物體內(nèi)的固定組分。通常情況下，植物內(nèi)生和根圍細(xì)菌可通過固氮、溶磷、分泌植物激素等方式直接影響植物的新陳代謝[17]，進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育。因此，作為一種新的微生物資源，植物內(nèi)生細(xì)菌受到越來越多的關(guān)注。目前從很多植物上都分離出了具有促生作用的內(nèi)生細(xì)菌，如雷公藤內(nèi)生菌LJ10具有產(chǎn)生植物生長(zhǎng)素和鐵載體的能力，兼具溶磷特性，回接LJ10能夠使雷公藤(Tripterygiumwilfordii)組培苗長(zhǎng)勢(shì)良好，根系發(fā)達(dá)，平均質(zhì)量增加[12]；短小桿菌屬Curtobacterium能使馬鈴薯組培苗的鮮重和干重提高17.56%和24.46%[18]；辣椒內(nèi)生枯草芽孢桿菌Bacillussubtilisstrain BS-2可誘導(dǎo)辣椒(Capsicumannuum)體內(nèi)吲哚乙酸等植物生長(zhǎng)激素含量的提高，從而使辣椒鮮重和干重提高168.70%和181.25%[19]；油菜內(nèi)生細(xì)菌環(huán)狀芽孢桿菌Bacilluscirculans的發(fā)酵液對(duì)油菜(Brassicanapus)種子萌發(fā)、胚根及胚軸生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[20]；草莓內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌BacillussubtilisNA-108可產(chǎn)生吲哚乙酸提高草莓(Fragaria×ananassa)的株高和植株干重[21]；洽草(Koeleriacristata)內(nèi)生細(xì)菌QS3、QG3和QS15可通過分泌吲哚乙酸顯著提高苜蓿(Medicagosativa)、紅三葉(Trifoliumpratense)、燕麥(Avenasativa)、黑麥草(Loliumperenne)種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)度等[6]；人參內(nèi)生細(xì)菌熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens具有較高1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶活性，且具有解磷、固氮和產(chǎn)生鐵載體的能力，能明顯促進(jìn)人參(Panaxquinquefolius)種子及根部的生長(zhǎng)[1]; 水稻內(nèi)生細(xì)菌HerbaspirillumseropedicaeDX35具有固氮、溶磷、產(chǎn)鐵和分泌生長(zhǎng)激素的能力[22]；苜蓿內(nèi)生團(tuán)泛菌Pantoeavagans和短小芽孢桿菌Bacilluspumilus均具有溶磷、嗜鐵和產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素吲哚乙酸的作用，從而促進(jìn)苜蓿生長(zhǎng)[23]。由此可知，很多植物內(nèi)生細(xì)菌有促生作用，與能分泌植物激素吲哚乙酸關(guān)系密切，因吲哚乙酸生理活性較強(qiáng)，在濃度較低時(shí)就能刺激植物生理代謝、促進(jìn)植物生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)生細(xì)菌HX-2也具有產(chǎn)生吲哚乙酸的能力，同時(shí)兼具溶磷能力，能提高藿香種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和幼苗的苗高、根長(zhǎng)、莖粗、葉面積、鮮重以及干重，也能提高根系活力和葉綠素含量?？梢姡臃N內(nèi)生細(xì)菌HX-2不僅給藿香提供了生長(zhǎng)素，還給植物增加了磷元素，提高了藿香的根系吸收能力和光合作用能力，從而促進(jìn)藿香幼苗的生長(zhǎng)。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示藿香內(nèi)生細(xì)菌HX-2對(duì)鹽堿和重金屬銅有一定的耐性，前人也有類似的研究報(bào)道，如劉莉華等[24]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生巨大芽孢桿菌能促進(jìn)龍葵(Solanumnigrum)生長(zhǎng)且兼具鉻耐性，韓坤等[25]發(fā)現(xiàn)海濱錦葵(Malvasylvestris)內(nèi)生細(xì)菌巨大芽孢桿菌能提高小麥幼苗的耐鹽性。耐性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明藿香內(nèi)生細(xì)菌HX-2有應(yīng)用于鹽堿地改良和銅污染土壤修復(fù)的潛力，這對(duì)我國農(nóng)業(yè)和生態(tài)的可持續(xù)發(fā)展意義重大。

已有的研究報(bào)道多采用體外實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)生細(xì)菌生物學(xué)特性，通過檢測(cè)菌株能否產(chǎn)生植物激素類物質(zhì)、是否具有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶活性、是否具有分泌鐵載體的能力等來評(píng)判它們的促生作用。這些方法能了解內(nèi)生細(xì)菌的促生潛能，但是存在不能反映菌株在植物體內(nèi)作用情況的局限性。因此，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的研究結(jié)果，能更充分地反映內(nèi)生細(xì)菌的生物學(xué)功能。本研究中，在體外檢測(cè)到藿香內(nèi)生細(xì)菌HX-2具有產(chǎn)生植物類激素吲哚乙酸的能力，培養(yǎng)液浸種具有提高藿香種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的能力；通過室內(nèi)盆栽回接菌株到植物體內(nèi)，該菌能提高藿香幼苗的根長(zhǎng)、苗高、莖粗、葉面積、鮮重、干重、葉綠素含量和根系活力。本研究比較全面地反映了內(nèi)生細(xì)菌HX-2對(duì)藿香種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，為進(jìn)一步大田實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

綜上所述，藿香內(nèi)生細(xì)菌HX-2為巨大芽孢桿菌，能產(chǎn)生植物激素吲哚乙酸，能溶解有機(jī)磷，兼具一定的鹽堿適應(yīng)性和重金屬銅耐性，對(duì)藿香種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有促生作用。本研究結(jié)果為藿香內(nèi)生細(xì)菌HX-2開發(fā)成微生物菌肥用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

References：

[1] Tian L, Jiang Y, Chen C Q,etal. Screening and identification of an endophytic bacterium with 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase activity fromPanaxginsengand its effect on host growth. Acta Microbiologica Sinica, 2014, 54(7): 760-769.

田磊, 姜云, 陳長(zhǎng)卿, 等. 一株人參內(nèi)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶活性細(xì)菌的篩選、鑒定及其對(duì)宿主生長(zhǎng)的影響. 微生物學(xué)報(bào), 2014, 54(7): 760-769.

[2] Han W X, Yao T, Xi L Q,etal. PGPR bio-fertilizers producing and its effect onAvenasativagrowth and quality development. Acta Prataculturae Sinica, 2008, 17(2): 75-84.

韓文星, 姚拓, 席琳喬, 等. PGPR菌肥制作及其對(duì)燕麥生長(zhǎng)和品質(zhì)影響的研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 17(2): 75-84.

[3] Hafeez F Y, Yasmin S, Ariani D,etal. Plant growth-promoting bacteria as biofertilizer. Agronomy for Sustainable Development, 2006, 26(2): 143-150.

[4] Kobayashi D Y, Palumbo J D. Bacterial Endophytes and Their Effects on Plants and Uses in Agriculture//Bacon C W, White J F. Microbial Endophytes. New York (NY): Marcel Dekker, 2000.

[5] Lodewyckx C, Vangronsveld J, Porteous F,etal. Endophytic bacteria and their potential applications. Critical Reviews in Plant Sciences, 2002, 21: 583-606.

[6] Wang C Y, Chen X R, Yang C D. Screening of IAA-producing endophytic bacteria fromKoeleriacristataand the effect on seed germination. Grassland & Turf, 2013, 33(1): 21-24.

王辰月, 陳秀蓉, 楊成德. 分泌吲哚乙酸洽草內(nèi)生細(xì)菌的篩選及其對(duì)種子發(fā)芽的影響. 草原與草坪, 2013, 33(1): 21-24.

[7] Hu M. Recent advances on endophyte research. Journal of Shandong Agricultural University (Natural Science Edition)， 2008, 39(1): 148-151.

胡萌. 植物內(nèi)生細(xì)菌研究進(jìn)展. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2008, 39(1): 148-151.

[8] Chen Y H. Feed additive for effectively regulating pig intestine: China, CN105876126A. 2016.

陳永紅. 一種有效調(diào)理豬腸道的飼料添加劑: 中國， CN105876126A. 2016.

[9] Cuo M J. Application of special anti-diarrhea powder in prevention of piglet diarrhea. Chinese Abstracts of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2015, 31(1): 204.

措毛加. 特效止痢散在仔豬腹瀉預(yù)防中的應(yīng)用. 中國畜牧獸醫(yī)文摘, 2015, 31(1): 204.

[10] Mercadoblanco J, Ben J J L. Biotechnological applications of bacterial endophytes. Current Biotechnology, 2014, 3(1): 60-75.

[11] Glickmann E, Dessaux Y. A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria. Applied & Environmental Microbiology, 1995, 61(2): 793-796.

[12] Xu J J, Song P, Feng L,etal. Growth-promoting effect and triptolide production regulation of endophytic bacteria fromTripterygiumwilfordii. Chinese Journal of Applied Ecology, 2014, 25(6): 1681-1687.

許進(jìn)嬌, 宋萍, 封磊, 等. 雷公藤內(nèi)生細(xì)菌的促生作用及其對(duì)雷公藤甲素生成的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2014, 25(6): 1681-1687.

[13] Jiang X W, Li H Q. Effects of exogenous salicylic acid on seed germination and seedling growth ofPogostemoncablinunder salt stress. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2015, 46(15): 2303-2308.

江緒文, 李賀勤. 外源水楊酸對(duì)鹽脅迫下廣藿香種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響. 中草藥, 2015, 46(15): 2303-2308.

[14] Tie J, Ma J, Jin S,etal. Measurement and correlation analysis on leaf area in endangered plantTaxuschinensisvar.mairei. Journal of Shanxi University (Natural Science Edition), 2012, (3): 581-586.

鐵軍, 馬婧, 金山, 等. 瀕危植物南方紅豆杉的葉面積測(cè)定及其相關(guān)分析. 山西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2012, (3): 581-586.

[15] Xu Z L, Li T F. The use of the SPAD-502 chlorophyll meter during the flue-cured tobacco growth. Guizhou Agricultural Sciences, 2006, 34(4): 23-24.

徐照麗, 李天福. SPAD-502葉綠素儀在烤煙生產(chǎn)中的應(yīng)用研究. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 34(4): 23-24.

[16] Zheng J, Chen Q X, Jin C,etal. The effects of different TTC method for the determination of root vigor of pine broadleaf tree seedling. Zhejiang Agricultural Sciences, 2008, (1): 39-42.

鄭堅(jiān), 陳秋夏, 金川, 等. 不同TTC法測(cè)定楓香等闊葉樹容器苗根系活力探討. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, (1): 39-42.

[17] Gaiero J R, Dunfield K E. Inside the root microbiome: Bacterial root endophytes and plant growth promotion. American Journal of Botany, 2013, 100(9): 1738-1750.

[18] Shen L Z, Liang F, Wang Z,etal. Identification of the endophytic bacteria StC01 and its plant-growth-promotion effect on potato. Jiangsu Agricultural Sciences, 2008, (1): 143-146.

沈麗珍, 梁峰, 王忠, 等. 馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌StC01的鑒定與促生作用. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, (1): 143-146.

[19] Cai X Q, He H, Hu F P. The effects of endophytic BS-2 (Bacillussubtilis) on growth and internal phytohormone of capsicum. Subtropical Agriculture Research, 2005, 1(4): 49-52.

蔡學(xué)清, 何紅, 胡方平. 內(nèi)生菌BS-2對(duì)辣椒苗的促生作用及對(duì)內(nèi)源激素的影響. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究, 2005, 1(4): 49-52.

[20] Xing K, Han J C, Liu H P,etal. Studies on the growth promotion of endopytic bacteria yc8 from rape. Acta Agriculturae Boreall-Sinica, 2007, 22(5): 180-183.

邢鯤, 韓巨才, 劉慧平, 等. 油菜內(nèi)生細(xì)菌yc8促生作用及其機(jī)理研究. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2007, 22(5): 180-183.

[21] Pereira G V D M, Magalh?es K T, Lorenzetii E R,etal. A multiphasic approach for the identification of endophytic bacterial in strawberry fruit and their potential for plant growth promotion. Microbial Ecology, 2012, 63(2): 405-417.

[22] Wang X C, Cao Y H, Tang X,etal. Rice endogenous nitrogen fixing and growth promoting bacteriumHerbaspirillumseropedicaeDX35. Acta Microbiologica Sinica, 2014, 54(3): 292-298.

王秀呈, 曹艷花, 唐雪, 等. 水稻內(nèi)生固氮菌HerbaspirillumseropedicaeDX35的篩選及其促生特性. 微生物學(xué)報(bào), 2014, 54(3): 292-298.

[23] Kang H Y, Wang W, Liu J L,etal. Isolation and identification of two plant-growth promoting endophytes from alfalfa. Microbiology China, 2015, 42(2): 280-288.

康慧穎, 王偉, 劉佳莉, 等. 兩株具促生作用的苜蓿內(nèi)生菌的分離純化與鑒定. 微生物學(xué)通報(bào), 2015, 42(2): 280-288.

[24] Liu L H, Liu S J, Chen F M,etal. Effect of endophytic bacteria inoculation on cadmium uptake inSolanumnigrumL. Acta Scientiae Circumstantiae, 2013, 33(12): 3368-3375.

劉莉華, 劉淑杰, 陳福明, 等. 接種內(nèi)生細(xì)菌對(duì)龍葵吸收積累鎘的影響. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 33(12): 3368-3375.

[25] Han K, Tian Z Y, Liu K,etal. Effect of endophytic bacteria with ACC deaminase activity inKosteletzkyapentacarposon wheat salt tolerance. Plant Physiology Journal, 2015, (2): 212-220.

韓坤, 田曾元, 劉珂, 等. 具有ACC脫氨酶活性的海濱錦葵(Kosteletzkyapentacarpos)內(nèi)生細(xì)菌對(duì)小麥耐鹽性的影響. 植物生理學(xué)報(bào), 2015, (2): 212-220.