苜蓿黃酮對脂多糖誘導(dǎo)下奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的影響

占今舜，陳小連，詹康，蘇效雙，趙國琦*

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009；2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200)

乳腺上皮細(xì)胞是合成和分泌乳汁主要場所，當(dāng)奶牛該組織在金黃葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌等病原菌感染下，會產(chǎn)生乳房炎，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)下降。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又稱內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌如大腸桿菌等細(xì)胞壁中的一種成分，當(dāng)細(xì)菌死亡溶解時，其釋放出來會使乳腺組織等產(chǎn)生損傷[1]。Shi等[2]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活性隨著LPS濃度和培養(yǎng)時間的延長而降低；細(xì)胞的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性隨著LPS濃度的升高呈降低趨勢，而丙二醛(MDA)含量則呈升高趨勢。Sun等[3]發(fā)現(xiàn)，奶牛乳腺上皮細(xì)胞在10 μg·mL-1LPS刺激下，其細(xì)胞膜的滲透性增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。朱麗萍等[4]發(fā)現(xiàn)，奶牛乳腺上皮細(xì)胞在1 μg·mL-1LPS處理3～24 h后可顯著增加炎癥因子(TNF-α和IL-1β)的表達(dá)。以上結(jié)果說明，LPS的刺激可促使乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化能力下降，增加細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

黃酮類物質(zhì)是含有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)，以C6-C3-C6為碳架的一類化合物，是植物一種重要的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物的根、莖、葉和花、果實中[5]。張城等[6]研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞IL-1β、iNOS、P53基因mRNA的表達(dá)升高，而添加1 μg·mL-1金雀異黃酮能夠提高增殖活性和降低這些基因的表達(dá)。姜念等[7]發(fā)現(xiàn)，4′,5,7-三羥基異黃酮能夠拮抗人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)LPS處理后引起的活力降低及ephrinB2和IL-6 mRNA的表達(dá)增加。另外，黃芪(Astragalusmembranaceus)總黃酮能夠抗小鼠RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[8]。結(jié)果表明，黃酮類物質(zhì)能夠提高細(xì)胞活性，發(fā)揮抗炎癥的作用。紫花苜蓿(Medicagosativa)被稱為“牧草之王”，是一種豆科多年生草本植物。苜蓿中黃酮含量較高，據(jù)報道，45個紫花苜蓿品種中有70%以上品種的總黃酮含量為0.6%～0.9%[9]。之前研究發(fā)現(xiàn)，在正常培養(yǎng)和熱應(yīng)激情況下，添加75 μg·mL-1的苜蓿黃酮能夠提高體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活性，改善抗氧化能力和抑制細(xì)胞凋亡[10-11]。黃酮類化合物具有抗炎癥作用，但不同種類可能作用存在差異。因此，本試驗研究在LPS刺激下，苜蓿黃酮對奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的影響，為苜蓿黃酮的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

脂多糖(LPS，血清型O55:B5)購于美國Sigma公司，試驗所用苜蓿黃酮和奶牛乳腺上皮細(xì)胞與文獻(xiàn)[11]相同。

1.2 試驗方法

1.2.1細(xì)胞活性檢測 試驗于2016年7月開始進(jìn)行，細(xì)胞活性采用CCK-8法進(jìn)行檢測。試驗方法如下：試驗分為4組，即基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Con)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1 μg·mL-1的LPS(L)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1 μg·mL-1的LPS和75 μg·mL-1苜蓿黃酮(L+F)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入75 μg·mL-1苜蓿黃酮(F)，每組5個重復(fù)，其中苜蓿黃酮用二甲基亞砜[DMSO(索萊寶，北京)]完全溶解，4個處理組中的DMSO含量低于2‰。在96孔板中，接種100 μL·孔-1的細(xì)胞懸液，懸液中含有1×104個的乳腺上皮細(xì)胞，然后在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞完全貼壁后，去除培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗兩次后加入不同處理的培養(yǎng)基100 μL·孔-1。細(xì)胞培養(yǎng)12和24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液(購于上海碧云天公司)，在培養(yǎng)箱中孵育3 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值，然后計算細(xì)胞活性。

細(xì)胞相對活性=(As-A0)/(Ac-A0)×100%

式中:As為試驗組的OD值；Ac為對照組的OD值；A0為空白組(只有培養(yǎng)基)的OD值。

1.2.2活性氧(ROS)的檢測 細(xì)胞內(nèi)的ROS采用DCFH-DA檢測探針(購于南京建成生物工程研究所)來檢測。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。取密度為1×105個·mL-1細(xì)胞接種到12孔板中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基，PBS清洗兩次，試驗分組同上。細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗，然后加入含有DCFH-DA(稀釋1000倍)培養(yǎng)基1 mL孵育1 h。細(xì)胞孵育之后，加入胰酶消化細(xì)胞(消化時間4 min)，加入培養(yǎng)基終止消化，制成懸液。將細(xì)胞懸液進(jìn)行1500 r·min-1離心5 min收集細(xì)胞，然后用PBS清洗一次，加入200～300 μL PBS重懸細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，檢測由揚州大學(xué)檢測中心完成。

1.2.3炎癥因子基因的檢測 取密度為5×105個·mL-1細(xì)胞接種到6孔板，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基，PBS清洗兩次，試驗分組同上。細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，然后提取RNA。細(xì)胞RNA提取、cDNA合成和RT-PCR等的方法和條件同文獻(xiàn)[12]。引物由Invitrogen公司合成，炎癥因子相關(guān)基因引物序列見表1。

表1 引物設(shè)計Table 1 Primer design

1.2.4凋亡相關(guān)蛋白的檢測 取密度為5×105個·mL-1細(xì)胞接種到6孔板，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)每孔細(xì)胞鋪滿時，將培養(yǎng)基去除，PBS清洗兩次，試驗分組同上。細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，提取細(xì)胞蛋白，然后進(jìn)行Western bolt檢測。一抗：p53購于英國Abcam公司，GAPDH、p38、P-p38和Caspase3購于美國Cell Signaling Technology公司；二抗(羊抗鼠、羊抗兔)購于美國Cell Signaling Technology公司。檢測方法如下：

1)根據(jù)蛋白分子量的大小配制相應(yīng)的SDS分離膠(10%～12%)，將分離膠打入制膠板中，加入無水乙醇，室溫放置40 min凝膠后，去除乙醇，加入濃縮膠，插入梳子后室溫放置40 min。

2)將制好的膠轉(zhuǎn)入電泳槽中進(jìn)行電泳，蛋白樣品上樣量為30 μg，電泳條件為140 V，15 min；110 V，65 min。

3)根據(jù)蛋白分子量的大小和參照Marker進(jìn)行切膠，鋪膜，然后在電壓100 V下轉(zhuǎn)膜80 min。

4)轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，根據(jù)蛋白分子量的大小和參照Marker進(jìn)行剪膜，然后進(jìn)行封閉2 h，封閉結(jié)束后用雜交膜清洗液清洗3次。

5)加入一抗在冰上進(jìn)行孵育12～16 h，結(jié)束后用雜交膜清洗液清洗3次。

6)加入二抗在搖床上孵育2 h，用雜交膜清洗液清洗3次后再用雙色紅外激光成像系統(tǒng)對膜進(jìn)行掃描、成像，最后利用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，然后根據(jù)目的蛋白與GAPDH比值進(jìn)行結(jié)果計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計算[13]，用Excel 2007進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)處理，采用IBM SPSS Statistics 21.0單因素方差分析(ANOVA)，LSD法多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿黃酮對脂多糖刺激下細(xì)胞活性的影響

從圖1中可知，細(xì)胞培養(yǎng)12 h時，L組的細(xì)胞相對活性極顯著低于其他各組(P<0.01)；培養(yǎng)24 h時，F(xiàn)組的細(xì)胞相對活性極顯著低于對照組(P<0.01)，而顯著高于其他兩組(P<0.05)。結(jié)果表明，苜蓿黃酮能夠抑制LPS刺激12 h細(xì)胞活性的下降。

2.2 苜蓿黃酮對脂多糖刺激下細(xì)胞ROS的影響

從圖2中可知，與對照組相比，其他各組的ROS濃度極顯著升高(P<0.01)；而與L組相比，L+F組和F組的ROS濃度顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明，苜蓿黃酮能夠降低LPS刺激下細(xì)胞內(nèi)ROS濃度。

圖1 苜蓿黃酮對LPS刺激12和24 h下奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of alfalfa flavonoids on cell viability of BMECs induced by LPS for 12 and 24 h

圖2 苜蓿黃酮對LPS刺激下細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.2 Effect of alfalfa flavonoids on the level of ROS in BMECs induced by LPS

Con為對照組、L為脂多糖組、L+F為脂多糖加苜蓿黃酮組、F為苜蓿黃酮組。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。Con is the control group, L is the LPS group, L+F is the LPS and alfalfa flavonoids group, F is the alfalfa flavonoids group. Values with different lowercase letters mean significant difference (P<0.05),values with different capital letters mean highly significant difference (P<0.01) and the same letter mean no significant difference (P>0.05).The same below.

2.3 苜蓿黃酮對脂多糖刺激下細(xì)胞炎癥因子基因表達(dá)的影響

從表2中可知，與對照組相比，L組IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR2、TLR4和MyD88的表達(dá)均極顯著升高(P<0.01)，而F組無顯著性差異；與L組相比，L+F組IL-1β(P<0.01)、IL-6(P<0.05)、TNF-α(P<0.01)和TLR2(P<0.01)的表達(dá)顯著降低。結(jié)果表明，苜蓿黃酮能夠下調(diào)LPS刺激下細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，提高細(xì)胞的抗炎癥作用。

表2 苜蓿黃酮對LPS刺激下細(xì)胞炎癥因子基因表達(dá)的影響Table 2 Effect of alfalfa flavonoids on gene expression of inflammatory factors in cells stimulated by LPS

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

Note: In the same row, values with different lowercase letters mean significant difference (P<0.05),values with different capital letters mean highly significant difference (P<0.01) and the same letter mean no significant difference (P>0.05).The same below.

2.4 苜蓿黃酮對脂多糖刺激下細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

圖3 Western blot 結(jié)果Fig.3 The results of Western blot

利用軟件對圖3的條帶進(jìn)行計算，結(jié)果見表3。與對照組相比，在LPS刺激下，p53(P<0.01)、Caspase3(P<0.01)、p38(P<0.05)和P-p38(P<0.01)蛋白的表達(dá)顯著升高，而添加苜蓿黃酮能夠顯著降低p53和p38蛋白的表達(dá)(P<0.05)。與對照組相比，在沒有LPS刺激下，添加苜蓿黃酮顯著升高了Caspase3蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，LPS能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，而苜蓿黃酮能夠下調(diào)LPS刺激下細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。

表3 苜蓿黃酮對LPS刺激下細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響Table 3 Effect of alfalfa flavonoids on expression of apoptosis protein in cells stimulated by LPS

3 討論

脂多糖能夠降低細(xì)胞的存活率，抑制細(xì)胞增殖。劉立新等[14]研究發(fā)現(xiàn)，LPS能夠抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。王亨等[15]發(fā)現(xiàn)，添加100 mg·L-1的LPS能夠顯著抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。本試驗得到相似結(jié)果。之前的研究發(fā)現(xiàn)[10-11]，在正常培養(yǎng)和熱應(yīng)激下，添加苜蓿黃酮能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性。之前有報道稱，奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性隨LPS濃度的升高呈下降趨勢，且隨著培養(yǎng)時間的延長，活性也呈下降趨勢[2]。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度雌激素能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖，并可以提高SOD活性來發(fā)揮抗氧化作用，而高濃度則抑制細(xì)胞增殖和降低抗氧化能力，引起細(xì)胞損傷[16]。而紫花苜蓿黃酮以木犀草素、槲皮素、染料木黃酮等黃酮類物質(zhì)為主，而這些物質(zhì)均能發(fā)揮植物雌激素的作用[17]，在本試驗中，苜蓿黃酮能夠提高LPS刺激12 h奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活性，而對刺激24 h的效果不明顯?？赡苁且驗長PS作用時間太長對細(xì)胞損傷較大，而且苜蓿黃酮隨著培養(yǎng)時間的延長可能發(fā)揮類雌激素作用，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。說明苜蓿黃酮能夠減緩LPS對細(xì)胞的損傷，而且可能存在時間依賴性。LPS能夠?qū)е履膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞的GSH-Px、SOD和CAT活性降低，而升高M(jìn)DA含量[2]。而之前試驗發(fā)現(xiàn)[10-11]，苜蓿黃酮能夠提高細(xì)胞抗氧化酶類的活性，因此，苜蓿黃酮提高細(xì)胞活性可能與其提高細(xì)胞抗氧化能力有關(guān)。

LPS是一種重要的炎癥反應(yīng)因子，能夠誘導(dǎo)TNF-ɑ、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)。Chanput等[18]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素、楊梅酮、圣草酚、柚皮素、蘆丁和芹黃素均能夠降低單核細(xì)胞炎癥因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-8和IL-10基因的表達(dá)。另外，黃芪總黃酮、染料木黃酮和芫花總黃酮均能夠抑制RAW264.7細(xì)胞TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的分泌，從而發(fā)揮抗炎[8,19-20]。本試驗結(jié)果與其相似，表明苜蓿黃酮亦發(fā)揮了抗炎癥的作用。Toll樣受體家族(TLRs)能夠與不同病原體相關(guān)分子模式結(jié)合，導(dǎo)致下游目的基因的活化，進(jìn)而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的發(fā)生。在此過程中存在兩種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，即依賴MyD88和非依賴MyD88。除TLR3為非依賴MyD88，其他均為依賴MyD88[21]。Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)，芒果苷能夠抑制LPS誘導(dǎo)口腔上皮細(xì)胞TLR2和TLR4的過表達(dá)，抑制NF-κB、p38和JNK的表達(dá)。Feng等[23]發(fā)現(xiàn)，大豆黃酮能夠抑制LPS誘導(dǎo)小鼠肺組織的TLR4、MyD88的過表達(dá)和NF-κB活性。Sun等[24]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可能通過抑制TLR2和TLR4/MyD88/p38/NF-κB信號來達(dá)到抗炎作用。另外，山姜素可能通過抑制TLR4調(diào)節(jié)NF-κB信號通路來發(fā)揮抗炎作用，從而抑制LPS誘導(dǎo)小鼠發(fā)生乳房炎[25]。從本試驗的結(jié)果來看，苜蓿黃酮降低了TLR2和MyD88基因表達(dá)和p38蛋白表達(dá)。結(jié)果說明，苜蓿黃酮可能通過抑制TLR2/MyD88/p38信號，降低炎癥因子的表達(dá)，從而達(dá)到抗炎癥的作用。

張宸豪等[26]研究發(fā)現(xiàn)，隨著LPS濃度增加，RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS的水平也增加。本試驗也發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激下，細(xì)胞內(nèi)的ROS濃度升高。鄧偉等[27]研究發(fā)現(xiàn)，橙皮素能夠抑制LPS誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生，說明黃酮類物質(zhì)具有降低細(xì)胞ROS濃度的功能。從本試驗結(jié)果來看，在LPS刺激下，苜蓿黃酮發(fā)揮抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的作用，這可能與其提高細(xì)胞抗氧化酶類活性有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)的ROS能夠與細(xì)胞膜的雙磷脂分子層及膜蛋白相結(jié)合，增加細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致DNA受損，進(jìn)而促使細(xì)胞凋亡和死亡。Caspases家族中的大多數(shù)成員是開啟細(xì)胞凋亡的效應(yīng)子，其中Caspase 3被認(rèn)為是凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，其一旦被激活，細(xì)胞凋亡就不可避免。從本試驗結(jié)果看，在LPS刺激下，苜蓿黃酮雖降低細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)，但未達(dá)到顯著性差異，說明苜蓿黃酮對Caspase-3蛋白的表達(dá)影響不大。然而，在正常培養(yǎng)下，苜蓿黃酮顯著提高了細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)，原因可能是苜蓿黃酮發(fā)揮了類雌激素作用，導(dǎo)致細(xì)胞氧化，提高ROS濃度所致。p53是一種抑癌基因，其主要功能是通過促進(jìn)DNA修復(fù)蛋白的轉(zhuǎn)錄合成來完成DNA損傷的修復(fù)。當(dāng)該修復(fù)無法完成時，p53會促使凋亡相關(guān)蛋白如Fas、Apaf-1、Bax等的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另外，p53能夠與Bcl-xL、Bcl-2的結(jié)合或者直接結(jié)合并激活Bak，誘導(dǎo)Bak寡聚，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)的ROS濃度增加，會促使p53基因表達(dá)升高，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[28]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)是絲氨酸/蘇氨酸激酶高度相關(guān)的蛋白激酶超家族，其是細(xì)胞內(nèi)一種重要的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，能夠被LPS所激活。p38MAPK能夠通過提高c-myc表達(dá)、磷酸化p53、參與Fas/Fasl介導(dǎo)的凋亡、誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位和增強(qiáng)TNF-α表達(dá)等來促進(jìn)細(xì)胞凋亡[29]。從本試驗發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激下，p53和p38蛋白的表達(dá)升高，而添加苜蓿黃酮能夠抑制它們的表達(dá)。說明在LPS刺激下，苜蓿黃酮可能通過降低細(xì)胞內(nèi)的ROS濃度，抑制p53和p38蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡。

在LPS刺激下，苜蓿黃酮能夠降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)ROS的濃度，抑制p53和p38等凋亡蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活性。另外，苜蓿黃酮可能通過抑制TLR2/MyD88/p38信號，進(jìn)而降低TNF-ɑ、IL-1β和IL-6等炎癥因子基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎癥的作用。

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