甘農(nóng)三號紫花苜蓿種帶細(xì)菌的生物功能分析及鑒定

張振粉，師尚禮

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

內(nèi)生細(xì)菌與宿主植物在長期共同進(jìn)化過程中形成互惠互利關(guān)系，在自然界中廣泛存在，現(xiàn)已從多種植物根、莖、葉、花、果實(shí)和種子中分離到[1-3]。植物內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的功能多樣性，可分泌吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)[4-6]、細(xì)胞分裂素(cytokinin, CTK)[7]，這有助于植物種子更早和更好的萌發(fā)。大部分內(nèi)生細(xì)菌被證明它們可以固氮(nitrate fixtion)[4，8-10]，溶磷(phosphate solubilizing)[11-12]，分解纖維素(cellulose dissolving)[13-14]，幫助寄主植物更能適應(yīng)貧瘠的土壤或生長環(huán)境；研究結(jié)果表明，內(nèi)生細(xì)菌和寄主植物共生體提高了植物的抗寒、旱、鹽和重金屬的脅迫能力[15-16]；共生體的這種耐貧瘠和抗逆境脅迫能力，使其種群在自然生態(tài)系統(tǒng)中具有更強(qiáng)的生存和競爭優(yōu)勢。內(nèi)生細(xì)菌還可以防治植物病害并誘導(dǎo)植物抗病性，使寄主植物種群得到更好的保護(hù)和健康的繁衍[1]。植物內(nèi)生細(xì)菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有廣泛的應(yīng)用潛力，是潛力巨大且尚待開發(fā)的微生物新資源[4]。

毋庸置疑，種帶內(nèi)生菌同種帶病原一樣，可通過儲存在時(shí)間上進(jìn)行延續(xù)和通過商業(yè)、生產(chǎn)和科技交流等活動在空間上進(jìn)行傳播[17]。種帶細(xì)菌可以在紫花苜蓿(Medicagosativa)種子存活達(dá)十年及以上，并具有活力[8，18]。大多數(shù)有花植物通過有性生殖和產(chǎn)生種子繁衍后代，植物種群的繁衍和生存與種子活力的保持和成功萌發(fā)成苗關(guān)系密切[19]，并決定植物進(jìn)入自然和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的時(shí)間，直接影響作物的產(chǎn)量[20-21]。

甘農(nóng)三號紫花苜蓿(Medicagosativacv. Gannong No.3)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)育成，經(jīng)1995 年全國牧草品種審定委員會評審?fù)ㄟ^、登記注冊。它是通過引種國內(nèi)外豐產(chǎn)品種，選擇優(yōu)良單株，扦插成無性系，經(jīng)過多元雜交和配合力測驗(yàn)，由7個(gè)優(yōu)良的無性繁殖系合成的綜合品種[22]。該品種耐瘠薄、抗旱、耐寒。春季返青較早，生長速度較快，再生能力較強(qiáng)，秋季休眠早?？沟狗芰σ话恪Ｊ钱?dāng)前我國甘肅、青海、寧夏、新疆灌區(qū)主要推廣的品種。

本試驗(yàn)采用稀釋平板法從表面消毒的甘農(nóng)三號紫花苜蓿種子中分離種帶細(xì)菌，采用稀釋平板法從表面消毒的甘農(nóng)三號紫花苜蓿種子中分離細(xì)菌，測定其產(chǎn)IAA、溶磷、固氮和分解纖維素生物學(xué)功能，并通過表型特征和16S rDNA基因序列分析鑒定其分類地位。本研究擬從甘農(nóng)三號紫花苜蓿分離鑒定種帶功能細(xì)菌，為進(jìn)一步開發(fā)利用生防制劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的甘農(nóng)三號紫花苜蓿品種種樣于2014年7月從酒泉苜蓿種植區(qū)采集，并帶回甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草種質(zhì)資源實(shí)驗(yàn)室(蘭州)常溫保藏，于2015年9月開始種帶細(xì)菌分離試驗(yàn)。

供試培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(nutrient agar，NA)用于種帶細(xì)菌的活化和保存，肉汁凍培養(yǎng)液(nutrient broth，NB)用于菌懸液的制備，金氏培養(yǎng)基B (King’s medium B，KB)用于菌株產(chǎn)IAA的測定[23]。Pikovaskaia培養(yǎng)基(PKO)用于菌株溶解無機(jī)磷的測定，蒙金娜培養(yǎng)基用于測定菌株溶解有機(jī)磷的能力，阿須貝無氮培養(yǎng)基用于固氮能力定性測定，纖維素剛果紅培養(yǎng)基用于分解纖維素能力的測定[14]。

供試標(biāo)準(zhǔn)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，ACCC 10243)菌株購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC: Agricultural Culture Collection of China)。

1.2 種帶細(xì)菌的分離

將制備好的NA平板培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中1～2 d后檢查，確認(rèn)沒有污染方可使用。然后采用稀釋法分離培養(yǎng)。即分別稱取紫花苜蓿種樣1 g (約450粒)備用，將種子先用75%的乙醇浸泡2 min，后轉(zhuǎn)入1%的NaClO消毒5 min[24]，用無菌水沖洗3～4次轉(zhuǎn)至盛有10 mL無菌水和少量滅菌后的石英砂的研缽中研磨，靜置10 min后取上清液梯度稀釋到濃度為1～10-3，取4個(gè)稀釋度的菌懸液各200 μL涂布于 NA平板上；無菌蒸餾水接種為對照組；試驗(yàn)重復(fù)3次。涂板后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，根據(jù)菌落和產(chǎn)色素等形態(tài)特征分類劃線純化，觀察并描述菌落的形態(tài)、大小、光澤、質(zhì)地、邊緣特征、表面特征、隆起形狀、透明度、菌落及培養(yǎng)基的顏色等特征[23]，于背景布自然日光條件下拍照(Canon A720)；將純化后的菌種4 ℃短暫保存于NA斜面上。

1.3 種帶細(xì)菌的生物功能測定

1.3.1產(chǎn)IAA 能力 標(biāo)準(zhǔn)曲線采用純3-IAA制作。將經(jīng) KB培養(yǎng)液培養(yǎng)12 d的菌懸浮液和空白對照離心(4 ℃，10000 r·min-1，10 min)， 取上清液4 mL加等量比色液，在黑暗中靜置30 min，立即測定OD530 nm值，重復(fù)測3次，以加比色液的空白對照調(diào)0[25]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出內(nèi)生細(xì)菌分泌IAA的量。

1.3.2溶磷能力 將內(nèi)生細(xì)菌接于PKO或蒙金娜培養(yǎng)基平板上，每皿接5點(diǎn)， 重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察并測量菌株在培養(yǎng)基平板上形成的溶磷圈大小[26]。根據(jù)溶磷圈直徑/菌落直徑(D/d值)確定內(nèi)生細(xì)菌的溶磷能力。

1.3.3固氮能力 經(jīng)活化的供試菌株用無菌生理鹽水配制菌懸液，以200 μL分別涂板接種于阿須貝無氮固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基內(nèi)，3次重復(fù)，以接種無菌水為對照，28 ℃培養(yǎng)(150 r·min-1)，在第3和7天目測其生長狀況，平板上生長菌落和三角瓶內(nèi)培養(yǎng)基變渾濁者為陽性[25]。

1.3.4分解纖維素能力 將活化培養(yǎng)48 h的菌株點(diǎn)接于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。在菌株的觀察過程中記錄透明圈的直徑大小(D)和菌落的直徑大小(d)，計(jì)算酶相對活性(A)=D/d[27]。

1.4 細(xì)菌鑒定

1.4.1生理生化特征 參照文獻(xiàn)[28-30]，進(jìn)行部分菌株的革蘭氏染色、產(chǎn)芽孢、需厭氧生長、硝酸鹽還原、最大耐鹽性和利用碳源產(chǎn)酸等生理生化特征測定。

1.4.216S rDNA基因序列分析鑒定 種帶細(xì)菌16S rDNA基因序列擴(kuò)增引物為通用引物27F/1492R，由武漢金開瑞生物工程有限公司合成；擴(kuò)增和檢測方法等具體參考文獻(xiàn)[31]，與GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih-gov/blast.cgi)中序列相似性比較，并用Clustal (1.8)軟件進(jìn)行多重序列比較和用Mega (4.0)軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 種帶細(xì)菌多樣性

從表面消毒的甘農(nóng)三號紫花苜蓿種子中分離得到8種細(xì)菌分離物(ZSR9～16)，NA平板上48 h后的菌落形態(tài)特征詳見圖1。8種細(xì)菌分離物的菌落形態(tài)和產(chǎn)色素均有一定的差異，表明甘農(nóng)三號紫花苜蓿種帶可培養(yǎng)細(xì)菌具有多樣性。

圖1 甘農(nóng)三號紫花苜蓿種帶細(xì)菌分離物ZSR9～16的菌落形態(tài)Fig.1 The colony shape of seed-borne bacterial strains on NA medium of lucerne cultivar Gannong No.3

ZSR9：菌落乳頭狀凸起，近圓形，肉色，稍有光澤，表面褶皺，邊緣不整齊，不透明，略有粘度，直徑2～4 mm；ZSR10：菌落具有中凹的隆起，圓形或近圓形，乳白色，稍有光澤，邊緣不整齊，半透明，略有粘度，直徑2～3 mm；ZSR11：菌落稍凸起的，圓形或近圓形，白色，略顯米黃，稍有光澤，邊緣不整齊，不透明，略有粘度，直徑2～6 mm；ZSR12：菌落凸起的，圓形或近圓形，肉色，有光澤，邊緣整齊，半透明，有粘度，直徑1～5 mm；ZSR13：菌落稍凸起的，圓形或近圓形，黃色，有光澤，邊緣整齊，半透明，有粘度，直徑1～4 mm；ZSR14：菌落凸起的，圓形或近圓形，奶白色，有光澤，邊緣整齊，半透明，有粘度，直徑2～4 mm；ZSR15：菌落凸起的，不規(guī)則形，表面有褶皺，灰褐色，有光澤，邊緣不整齊，半透明，有粘度，直徑2～4 mm；ZSR16：菌落平展，圓形或近圓形，白色，有光澤，邊緣整齊，半透明，有粘度，直徑2～4 mm。

2.2 種帶細(xì)菌功能多樣性

對種帶細(xì)菌進(jìn)行產(chǎn)IAA、溶磷、固氮和分解纖維素能力測定結(jié)果表明(表1)，8個(gè)菌株均具有產(chǎn)IAA的能力，最強(qiáng)的是ZSR9，在添加色氨酸的培養(yǎng)基上分泌IAA的量達(dá)4.26 mg·L-1；有7個(gè)菌株具有分解纖維素的能力，占總株數(shù)的87.5%，ZSR9的能力最強(qiáng)；有7個(gè)菌株具有固氮能力，占總株數(shù)的87.5%；7個(gè)菌株具有同時(shí)溶解有機(jī)磷和無機(jī)磷的能力，占總株數(shù)的87.5%，且它們?nèi)芙鉄o機(jī)磷均強(qiáng)于溶解有機(jī)磷的能力；其中ZSR9菌株對兩種磷溶解能力最強(qiáng)。在已測得的8株種帶細(xì)菌都具有生物功能，其中7株細(xì)菌：ZSR9～12、ZSR14～16同時(shí)具有分泌IAA、溶磷、固氮和分解纖維素的能力，ZSR9各個(gè)生物功能的能力顯著(P<0.05)高于其他7種菌。

-：無功能Without biological function；+：有功能With biological function；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different letters in the same column denote significant difference (P<0.05).

2.3 種帶細(xì)菌的鑒定

2.3.1生理生化測定 部分甘農(nóng)三號紫花苜蓿種帶細(xì)菌分離物(ZSR9～12、ZSR14～15)和標(biāo)準(zhǔn)菌株ACCC 10243的主要細(xì)菌學(xué)特征見表2，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)菌株的生長形態(tài)特征以及部分生理生化指標(biāo)開展對種帶細(xì)菌分離物的表型鑒定。ZSR9與標(biāo)準(zhǔn)菌株ACCC 10243表型特征一致，結(jié)合形態(tài)特征初步確定其為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；ZSR11與標(biāo)準(zhǔn)菌株ACCC 10243非常接近，但是ZSR11能耐受50 ℃高溫，區(qū)別于標(biāo)準(zhǔn)菌株，結(jié)合形態(tài)特征初步確定其為莫海威芽孢桿菌(B.mojavensis)；ZSR10和ZSR14的表型特征比較接近，但在纖維醇、麥芽糖和松二糖中的產(chǎn)酸卻表現(xiàn)不同，它們與標(biāo)準(zhǔn)菌株在明膠水解、硝酸鹽還原、耐鹽性和生長溫度范圍存在差異，結(jié)合形態(tài)特征初步確定ZSR10為沙福芽孢桿菌(B.safensis)；ZSR14為短小芽孢桿菌(B.pumilus)；ZSR12在厭氧生長、利用丙酸鹽、生長溫度范圍、耐鹽性和在松二糖中產(chǎn)酸區(qū)別于標(biāo)準(zhǔn)菌株，結(jié)合形態(tài)特征初步確定其為地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)；ZSR15在NA培養(yǎng)基上產(chǎn)生暗褐色色素、生長溫度范圍、耐鹽性、在纖維醇和松二糖中的產(chǎn)酸特征與ACCC 10243存在差異，結(jié)合形態(tài)特征初步確定其為萎蔫芽孢桿菌(B.atrophaeus)。

表2 甘農(nóng)三號紫花苜蓿種帶細(xì)菌分離物的表型特征Table 2 Phenotypic characteristics of bacterial strains isolated from seeds of lucerne cultivar Gannong No.3

1：BacillussubtilisACCC 10243；2：ZSR9；3：ZSR10；4：ZSR11；5：ZSR12；6：ZSR14；7：ZSR15； +：陽性Positive reaction；-：陰性Negative reaction；DB：暗褐色Dark brown.

2.3.216S rDNA鑒定 8株可培養(yǎng)紫花苜蓿種帶細(xì)菌成功提取其基因組DNA并擴(kuò)增出16S rDNA序列。經(jīng)16S rDNA序列相似性分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析(圖2)，表明甘農(nóng)三號紫花苜蓿種帶細(xì)菌分屬3個(gè)屬，它們分別為芽孢桿菌屬(Bacillus)、土地芽孢桿菌屬(Terribacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter)。8株細(xì)菌分離物在NCBI的BLASTN與其16S rDNA序列同源性高達(dá)99%～100%。ZSR9和ZSR11與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、莫海威芽孢桿菌(B.mojavensis)、特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)和太陽海岸芽孢桿菌(B.axarquiensis)聚為一類；ZSR10與沙福芽孢桿菌(B.safensis)聚為一類；ZSR12與地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)聚為一類；ZSR13與腸桿菌屬(Enterobactersp.)聚為一類；ZSR14與短小芽孢桿菌(B.pumilus)聚為一類；ZSR15與深褐芽孢桿菌(B.atrophaeus)聚為一類；ZSR16與土地芽孢桿菌屬(Terribacillussp.)聚為一類；表明在系統(tǒng)發(fā)育上其親緣關(guān)系較近。

圖2 甘農(nóng)三號紫花苜蓿種帶細(xì)菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 16S rDNA sequence phylogenetic tree of seed-borne bacteria isolated from lucerne of Gannong No.3 括號內(nèi)為 GenBank 登錄號Numbers in parentheses represent the sequences’ accession number in GenBank；分支點(diǎn)上的數(shù)字為自展值百分比The number at each branch point is the percentage supported by bootstrap.

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)首次證實(shí)甘農(nóng)三號紫花苜蓿的種帶細(xì)菌具有多樣性，從甘農(nóng)三號紫花苜蓿種子中分離、純化出8株細(xì)菌(ZSR9～16)，通過對這8株菌的菌體形態(tài)描述、生理生化特征和16S rDNA鑒定，它們分別屬于3個(gè)屬的8種菌。其中芽孢桿菌屬(Bacillus)的有6株：枯草芽孢桿菌(B.subtilis) ZSR9、沙福芽孢桿菌(B.safensis) ZSR10、莫海威芽孢桿菌(B.mojavensis) ZSR11、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis) ZSR12、短小芽孢桿菌(B.pumilus) ZSR14和深褐芽孢桿菌(B.atrophaeus) ZSR15；以及屬于腸桿菌屬(Enterobacter)的ZSR13和屬于土地芽孢桿菌屬(Terribacillus)的ZSR16。芽孢桿菌屬(Bacillussp.)廣泛地存在于自然界，在土壤、水、空氣、極端環(huán)境中和紫花苜蓿種子均存在[18，28]。福芽孢桿菌、莫海威芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌首次于紫花苜蓿種子中分離得到。腸桿菌屬(Enterobactersp.)廣泛存在于自然界中，在人和動物的糞便、水、泥土、紫花苜蓿種子等植物中均可檢出[18，32]。土地芽孢桿菌屬(Terribacillussp.)首次于農(nóng)田土壤中分離得到[33]，又陸續(xù)從動物、西沙野生諾尼和煙草(Nicotianatabacum)等植物檢測出[34-36]。其中土地芽孢桿菌屬是首次分離自紫花苜蓿種子豐富了該屬細(xì)菌的生境分布。

本試驗(yàn)分離得到6種芽孢桿菌(ZSR9～12和ZSR14～15)，它們具有功能多樣性，均能產(chǎn)IAA、溶磷、固氮和分解纖維素，枯草芽孢桿菌ZSR9的所有功能的能力最強(qiáng)，該結(jié)果與已有研究結(jié)果一致[14，37-39]。已有研究表明，芽孢桿菌與自然界物質(zhì)轉(zhuǎn)化、土壤肥力、環(huán)境衛(wèi)生均密切相關(guān)，許多能水解淀粉，分解蛋白質(zhì)、果膠、藻酸鹽等，工業(yè)上用于提取淀粉酶、蛋白酶、果膠酶等[18]；它們有的還可以產(chǎn)生抗菌素，可以抑制病原菌的發(fā)生擴(kuò)展[40-42]，本試驗(yàn)未對此類功能進(jìn)行進(jìn)一步研究，有待深入研究。生理生化指標(biāo)測定顯示，這6種菌具有較強(qiáng)的耐鹽性和較寬的生長溫度范圍，最高能耐受10% NaCl和5～55 ℃，表明分離自甘農(nóng)三號紫花苜蓿的6株芽孢桿菌具有耐瘠薄、耐寒、耐高溫等屬性。芽孢桿菌屬里的大部分細(xì)菌都具有較高的耐鹽性和較寬的生長溫度范圍，本研究結(jié)果與其一致[28]。菌株腸桿菌屬ZSR13具有較弱的產(chǎn)IAA能力；菌株土地芽孢桿菌ZSR16具有功能多樣性，具有較強(qiáng)的產(chǎn)IAA、溶磷、固氮和分解纖維素的能力；表明這兩菌株是對甘農(nóng)三號紫花苜蓿有利的。這些菌種的得到將為下一步將其作為生防菌種資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

甘農(nóng)三號紫花苜蓿與種帶細(xì)菌是互惠互利的共生體，種帶細(xì)菌可以幫助寄主適應(yīng)瘠薄、寒冷等逆境，從而更健康的生長和繁殖；而紫花苜蓿給它提供穩(wěn)定的寄生場所及生長繁殖所需的營養(yǎng)。因此，有益微生物的種類和數(shù)量的多少，是評價(jià)與其共生寄主的品質(zhì)重要指標(biāo)之一。本研究僅利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進(jìn)行種帶細(xì)菌的培養(yǎng)，不能充分展示甘農(nóng)三號紫花苜蓿微生物的多樣性。文獻(xiàn)[43]報(bào)道用分子非培養(yǎng)手段從未感染Clavibactermichiganensissubsp.insidiosus的苜蓿種樣中檢測到其他32種種帶細(xì)菌。因此，有必要探索模擬更接近種帶細(xì)菌其營養(yǎng)需求及真實(shí)的生存環(huán)境，分離培養(yǎng)更豐富的有益細(xì)菌資源，為進(jìn)一步的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。當(dāng)然，許多研究已證實(shí)通過傳統(tǒng)的分離方法鑒定的微生物只占環(huán)境微生物總數(shù)的0.1%～10%，且一部分植物內(nèi)生細(xì)菌由于人工環(huán)境不適宜而不能進(jìn)行繼代培養(yǎng)[4，44]。因此，也有必要利用非培養(yǎng)方法對其組織內(nèi)非可培養(yǎng)其他種帶細(xì)菌進(jìn)行更詳細(xì)的研究，從而更真實(shí)地了解其細(xì)菌多樣性及其功能。

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