龍眼核多酚提取工藝優(yōu)化及降膽固醇作用

李 妍， 曾亞麗， 曹珂珂， 黃世瑜， 王 娣

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是屬于無(wú)患子科龍眼屬植物，是一種典型的亞熱帶果樹[1]，其果實(shí)俗稱桂圓.近年來(lái)，相關(guān)研究表明，龍眼核多酚具有良好的抗氧化、抑菌及降血糖等生物活性[2]，并且在防治心血管疾病、降低膽固醇等方面也具有一定的作用[3].當(dāng)前對(duì)龍眼核的研究重點(diǎn)僅著重于對(duì)龍眼淀粉、棕色素、多糖的提取測(cè)定及研究等方面，而關(guān)于龍眼核多酚的研究相對(duì)不足[4].通過(guò)大量研究結(jié)果證實(shí)，多酚多種生物活性表現(xiàn)在抗癌、抗菌、抗氧化和預(yù)防心腦血管疾病等方面[5].本文把龍眼核作為原料，對(duì)其中的多酚類化合物采用微波輔助萃取法提取，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)構(gòu)建關(guān)于多酚的提取率和提取條件的數(shù)學(xué)模型，由此得出優(yōu)化的提取工藝條件并測(cè)試其體外降血脂作用，以便進(jìn)一步龍眼核的利用率，為龍眼核進(jìn)一步深加工做準(zhǔn)備[6-10].

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

龍眼（品種靈龍，產(chǎn)地廣西靈山縣），龍眼核干燥粉碎過(guò)60目篩密閉保存于棕色瓶中.

膽固醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；沒(méi)食子酸（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；鎢酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；鉬酸鈉（無(wú)錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司）；硫酸鋰（天津博迪化工股份有限公司）；石油醚（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；液溴（天津市大茂化學(xué)試劑）.

1.2 儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科學(xué)儀器有限公司）；XFB-200高速中藥粉碎機(jī)（吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠）；電子天平AB323（上海海康電子儀器廠）；JK-800DB型數(shù)控超聲清洗器（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-1（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)流程

龍眼核烘干、粉碎→提取→抽濾→處理濾液→測(cè)吸光度→計(jì)算提取率

2.2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取100 mg的沒(méi)食子酸，溶解于1 000 mL的容量瓶中，定容，搖勻，得到標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0.1 mg/mL.再分別吸取上述沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于25 mL的棕色容量瓶中.分別加入FC試劑，搖勻.在0.5-8 min內(nèi)，加入10%Na2CO312 mL，充分混合后，蒸餾水定容.室溫下避光放置2 h.在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度[11].每個(gè)樣品設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取其平均值.把沒(méi)食子酸溶液的濃度作為橫坐標(biāo)，把所測(cè)的吸光度作為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以得到線性回歸方程：y=0.10397x-0.00838，R2=0.9958.

2.3 計(jì)算公式

式中：C為樣品的濃度（根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出），mg/mL；

V為樣品稀釋后的體積，mL；

n為稀釋的倍數(shù)；

m為粗提取物質(zhì)量，mg.

式中：A0為空白溶液膽固醇濃度，mg/mL；

A1為樣品溶液膽固醇濃度，mg/mL.

2.4 微波輔助提取龍眼核多酚的單因素試驗(yàn)

2.4.1 料液比對(duì)提取率的影響

稱取2 g的龍眼核粉，取80%的乙醇濃度，時(shí)間3 min，分別在料液比 1：20、1：30、1：40、1：50、1：60 條件下提取，再按“2.2”項(xiàng)測(cè)定其吸光度，三次平行，提取率可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和提取率的計(jì)算公式算出.

2.4.2 時(shí)間對(duì)提取率的影響

稱取2 g的龍眼核粉，取80%的乙醇濃度，1：50的料液比，分別在提取時(shí)間為 1、2、3、4、5 min條件下提取，按“2.2”項(xiàng)測(cè)定吸光度，三次平行，提取率可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和提取率的計(jì)算公式算出.

2.4.3 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

稱取2 g龍眼核粉，料液比1：30，乙醇濃度40%、50%、60%、70%、80%下提取 4 min，按“2.2”項(xiàng)測(cè)定吸光度，三次平行，提取率可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和提取率的計(jì)算公式算出.

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件

料液比、提取時(shí)間和乙醇濃度三個(gè)因素分別對(duì)提取率的影響可通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看出.從每個(gè)因素中選取三個(gè)水平，通過(guò)Box-Benhnken設(shè)計(jì)，目標(biāo)為龍眼核多酚的提取率，實(shí)驗(yàn)變量取料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度三個(gè)因素，在此之上做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，得到優(yōu)化的提取條件.實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表如下表1.

表1 分析因子與水平編碼

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

從響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)中分析得到的結(jié)果，由此確定最佳提取條件.為與預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，需在最佳的提取條件下做三組平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出各組提取率，取其平均值.

2.7 降膽固醇試驗(yàn)

2.7.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制相關(guān)文獻(xiàn)方法進(jìn)行，略有改動(dòng)[12].具體方法為：準(zhǔn)確吸取膽固醇工作液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL分別置于10 mL試管內(nèi)，加入冰乙酸，定容到4 mL，之后沿管壁加2 mL鐵礬顯色液，混勻，在15-90 min內(nèi)，560 nm下測(cè)吸光度.每組平行三次，取其平均值.橫坐標(biāo)為膽固醇溶液濃度，縱坐標(biāo)為吸光度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=0.00979x-0.001，R2=0.9984.

2.7.2 降膽固醇試驗(yàn)

采用實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取條件提取龍眼核多酚，分別吸取1 mL不同濃度的龍眼核多酚溶液于10 mL試管內(nèi)，再依次加入（1 mL 100μg/mL膽固醇溶液+3 mL冰乙酸+2 mL鐵礬顯色液），測(cè)定吸光度，計(jì)算不同時(shí)間溶液中膽固醇的清除率[13-15].

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 提取時(shí)間對(duì)龍眼核多酚的影響

在料液比為1：50，乙醇濃度為80%的微波提取條件下，得到龍眼核多酚提取率隨時(shí)間長(zhǎng)短變化如圖1所示，在提取時(shí)間4 min之前提取率隨著時(shí)間增大而增大，之后提取率開始下降，因此在提取時(shí)間中選擇3、4、5 min三個(gè)水平.

3.1.2 料液比對(duì)龍眼核多酚的影響

微波提取條件為乙醇濃度80%，時(shí)間3 min，得出龍眼核多酚提取率隨不同料液比的變化如圖2所示，龍眼核多酚提取率在料液比1：40之前呈上升趨勢(shì)，隨后下降.因此，在料液比選擇 1：30、1：40、1：50 三個(gè)水平.3.1.3 乙醇濃度對(duì)龍眼核多酚的影響

圖1 提取時(shí)間對(duì)龍眼核多酚的影響

圖2 料液比對(duì)龍眼核多酚的影響

微波提取條件為時(shí)間3 min，料液比1：40，得出龍眼核多酚提取率隨不同乙醇濃度變化如圖3所示，龍眼核多酚提取率先一直呈上升趨勢(shì)，之后逐漸趨于變緩.因此，在乙醇濃度上選擇60%、70%、80%三個(gè)水平.

圖3 乙醇濃度對(duì)龍眼核多酚的影響

3.2 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)及結(jié)果

3.2.1 響應(yīng)值結(jié)果及其擬合模型

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案得到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如下表2所示.

通過(guò)Design-expert試驗(yàn)設(shè)計(jì)，把料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度作為響應(yīng)變量，提取率作為響應(yīng)值，對(duì)表2進(jìn)行回歸擬合的分析后得到擬合方程如下：Y=5.50+0.67A+0.30B+0.21C-0.073AB-0.074AC+0.044BC-0.34A2-0.43 B2-0.34C2試驗(yàn)方差分析如下表3所示.

由表3顯示，模型的F值為18.53，得出因變量與自變量之間的線性關(guān)系較明顯，模型的失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明模型與試驗(yàn)的擬合情況良好.之后用Box-Behnken繼續(xù)分析并結(jié)合實(shí)際操作得到料液比1：40，乙醇濃度65%，提取時(shí)間3 min為最佳提取條件，得出龍眼核多酚預(yù)測(cè)提取率為6.09%.

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

3.2.2 等高線圖和響應(yīng)曲面圖分析

當(dāng)3min作為提取時(shí)間固定時(shí)，通過(guò)圖4并結(jié)合上面的分析得出的最佳條件可以發(fā)現(xiàn)，料液比在1：30-1：37.53，乙醇濃度在60%-68.61%所形成的區(qū)域內(nèi)，隨著乙醇濃度的增大和料液比的升高提取率有所增加，但增幅趨勢(shì)有所減緩，當(dāng)乙醇濃度升到68.61%，料液比升至1：37.53 時(shí)，達(dá)到最大.

圖4 乙醇濃度和料液比對(duì)龍眼核多酚的影響

圖5 時(shí)間和乙醇濃度對(duì)龍眼核多酚的影響

圖6 料液比和時(shí)間對(duì)龍眼核多酚的影響

當(dāng)料液比1：40固定時(shí)，由圖5并結(jié)合上述分析最佳條件可以看出，時(shí)間在2-2.76 min，乙醇濃度由60%-68.61%所形成的區(qū)域內(nèi)，隨著乙醇濃度的增大和時(shí)間的增長(zhǎng)，提取率一直增大，增幅趨勢(shì)逐漸減緩，當(dāng)時(shí)間達(dá)到2.76 min，乙醇濃度增至68.61%時(shí)，達(dá)到最大.

當(dāng)固定乙醇濃度為70%時(shí)，由圖6并結(jié)合上述分析最佳條件可發(fā)現(xiàn)，在提取時(shí)間為2-2.76 min，料液比為1：30-1：37.53所形成的區(qū)域內(nèi)，隨著時(shí)間和料液比的增大，提取率不斷增長(zhǎng)，但是增幅趨勢(shì)有所減緩；當(dāng)時(shí)間增至2.76 min，料液比升至1：37.53時(shí)，達(dá)到最大.

3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

把響應(yīng)面法分析得出的龍眼核多酚提取工藝的最佳提取條件，與實(shí)際可操作條件結(jié)合，選取料液比為1：40，乙醇濃度為65%，提取時(shí)間為3 min條件進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4.所選條件比預(yù)測(cè)條件稍低，得出實(shí)際提取率比預(yù)測(cè)值也稍低，相對(duì)誤差4.92%.

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4 降膽固醇試驗(yàn)

圖7 不同濃度隨時(shí)間對(duì)清除率的影響

由圖7可知，隨著濃度的增加，龍眼核多酚對(duì)于膽固醇的清除率升高，但實(shí)驗(yàn)表明：隨著時(shí)間的增大，多酚中含有多羥基易被氧化，使得其膽固醇清除率緩慢降低.

4 結(jié)論與討論

本研究以時(shí)間、乙醇濃度、料液比作為單因素，選定微波輔助萃取法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得出不同的料液比、時(shí)間、乙醇濃度均對(duì)龍眼核多酚的提取率有影響，其中乙醇濃度的影響最為顯著.之后再通過(guò)三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到時(shí)間2.76 min，料液比1：37.53，乙醇濃度68.61%為最佳微波輔助龍眼核多酚提取工藝的條件，在此條件下，預(yù)測(cè)提取率為6.09%.為便于實(shí)際操作，提取時(shí)間3 min，乙醇濃度65%，料液比1：40的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到提取均值5.79%，比預(yù)測(cè)值稍低，其相對(duì)誤差為4.92%.通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)龍眼核多酚的提取實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛱岣啐堁酆硕喾拥奶崛÷?，同時(shí)也為龍眼的廢料加以回收利用提供了新思路.

[1]黃曉冬.4種龍眼核提取物的總黃酮含量、體外抗菌活性與抗氧化活性[J].食品科學(xué)，2011，11（2）：43-47.

[2]Geogrge K.Skouroumounis，Gordon M.Elsey，Dennis K.Taylor.Microwave-assistance provides very rapid and efficient extraction of grapeseed polyphenols[J].Food Chcmistry，2011，129（30）：570-576.

[3]周凱，胡卓炎，周沫霖，等.龍眼核提取物的體外抗氧化及抑菌活性研究[J].食品與機(jī)械，2015，31（4）：167-171.

[4]范三紅，秦婉寧，李靜，等.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取油松花粉多酚的工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2016，14（7）：215-219.

[5]陳亮，李醫(yī)明，陳凱先，等.植物多酚類成分提取分離研究進(jìn)展[J].中草藥，2013，11（5）：1501-1507.

[6]陳晨，胡文忠，田沛源，等.超聲輔助提取香蕉皮多酚工藝優(yōu)化及其抗氧化性的分析[J].食品科學(xué)，2014，2（8）：12-17.

[7]唐福才，姚敦琛，關(guān)天旺，等.龍眼中多酚提取及抗氧化活性的研究[J].食品研究與開發(fā)，2015，12（2）：5-9.

[8]丁雙華，葉立斌，陳衛(wèi)，等.響應(yīng)面優(yōu)化提取桑葉多酚的研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2012，11（4）：52-58.

[9]陳金玉，曾健，李春美.龍眼核多酚提取工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化及其分離純化與結(jié)構(gòu)表征[J].食品科學(xué)，2015，16（45）：31-37.

[10]唐福才，關(guān)天旺，姚敦琛，等.微波提取龍眼核中多酚及其抗氧化活性的研究[J].廣東化工，2015，42（5）：176-177.

[11]石恩慧，郭凱軍，李紅，等.板栗總苞多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2013，2（4）：406-414.

[12]趙偉.幾種植物多酚抑制肝細(xì)胞脂變及促進(jìn)膽固醇流出機(jī)制研究[D].西安：陜西師范大學(xué)，2014：3-5.

[13]丁苗，劉洋，葛平珍，等.發(fā)酵酸肉中降膽固醇乳酸菌的篩選、鑒定及降膽固醇作用 [J].食品科學(xué)，2014，35（19）：203-207.

[14]王今雨，滿朝新，楊相宜，等.植物乳桿菌NDC 75017的降膽固醇作用[J].食品科學(xué)，2013，34（3）：243-247.

[15]姚余祥，張久亮，何慧，等.鷹嘴豆降膽固醇肽的制備及活性[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2015，30（1）：33-38.