姜黃素對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞caspase-3、caspase-8和caspase-9表達的影響

商 華， 任憲輝， 楊紅欣， 徐 鳳△

(牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 1老年病科， 2檢驗科， 黑龍江 牡丹江 157010； 3鐵北社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心， 黑龍江 牡丹江 157011)

姜黃素(curcumin)是從傳統(tǒng)中藥姜黃和郁金等姜黃屬植物的根莖中提取出的一種低分子量酚類化合物，因其具有毒副作用小和生物學(xué)活性廣泛等優(yōu)勢而受到廣泛關(guān)注，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和神經(jīng)保護等多種藥理作用[1]。近年來，國內(nèi)外關(guān)于姜黃素用于阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)治療的研究報道較多，提示其在預(yù)防和治療AD方面具有潛在的療效[2-4]。AD是臨床上常見的好發(fā)于老年人群的腦神經(jīng)退行性疾病，也稱為老年性癡呆癥，其特征表現(xiàn)為進行性記憶喪失和(或)認知能力受損[5]。AD的主要病理特征包括β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)聚集成老年斑、突觸受損、小膠質(zhì)細胞活化、氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙等[6]。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ沉積引發(fā)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)在AD病程中起核心作用，最終導(dǎo)致突觸和神經(jīng)元的損害[7]?，F(xiàn)階段，對于AD的治療方法十分有限，隨著對AD研究的深入，天然藥物在預(yù)防和治療AD的作用日益受到重視[8-9]。但是，有關(guān)姜黃素治療AD的作用是否與線粒體凋亡途徑有關(guān)則鮮見報道。本研究利用β-淀粉樣蛋白25-35(Aβ25-35)誘導(dǎo)大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞，觀察姜黃素對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞存活率、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放率和細胞凋亡的影響，以及凋亡相關(guān)酶胱天蛋白酶(caspase)-3、caspase-8和caspase-9活性和表達的變化，探討caspase-3、caspase-8和caspase-9在姜黃素抗Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡過程中的可能作用。

材 料 和 方 法

1 細胞株

PC12細胞購自上海中國科學(xué)院細胞庫，置于含10%胎牛血清和1%抗生素(青霉素和鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下過夜培養(yǎng)。次日以無糖DMEM培養(yǎng)基更換高糖DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。當細胞融合度達70%～80%時傳代，貼壁后細胞呈梭型，并有較長的突觸，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

2 藥物和試劑

姜黃素、Aβ25-35、AnnexinV-FITC/PI試劑盒和生物素標記的山羊抗兔IgG II 抗(Sigma)；DMSO(AltochemLacq)；DMEM培養(yǎng)基(HyClone Thermo)；胎牛血清(Gibco)；MTT(Amresco)；LDH檢測試劑盒(南京建成)；兔抗人caspase-3、caspase-8和caspase-9單克隆抗體(Santa Cruz)；其它試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

3 儀器

HERAcell 240i CO2培養(yǎng)箱(Thermofisher Scientific)；GS-15R低溫高速離心機(Beckman Coulter)；RT-6100酶標儀(Rayto)；PowerPac HV電泳儀(Bio-Rad)；FACScan流式細胞儀(BD)。

4 方法

4.1姜黃素的配制 將姜黃素溶于0.1% DMSO中，配制成40 μmol/L溶液，-20 ℃保存。臨用時以0.1% DMSO稀釋到所需濃度。

4.2Aβ25-35的配制 將Aβ25-35凍干粉溶于DMEM培養(yǎng)基，配制成200 μmol/L儲備液，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育7 d，使之老化，過濾分裝，-20 ℃保存。臨用時以DMEM培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

4.3MTT實驗檢測細胞活力 將對數(shù)生長期的PC12細胞按照5×107/L的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h。參照文獻[10]及預(yù)實驗結(jié)果，每孔分別加入0[空白對照(blank control)組，加入與姜黃素等體積的DMEM培養(yǎng)基]、1.25、2.5、5、10、20和40 μmol/L的姜黃素，另設(shè)模型(model)組(加入與姜黃素等體積的DMEM培養(yǎng)基)，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)2 h后，除空白對照組外每孔分別加入40 μmol/L Aβ25-35，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS洗滌1次，每孔再分別加入0.5 g/L的MTT溶液，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)1 h，吸取上清液。每孔分別加入100 μL DMSO以溶解紫色沉淀，室溫搖床10 min，待完全溶解紫色沉淀后，于RT-6100酶標儀測定450 nm波長處吸光度(A)，GraphPad Prism 5.0計算細胞存活率。每個劑量組設(shè)6個平行孔，取6孔平均值。

4.4LDH 釋放實驗 按方法4.3分組培養(yǎng)細胞，參考LDH檢測試劑盒說明書，測定姜黃素對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞LDH釋放率的影響。每個劑量組設(shè)6個平行孔，取6孔平均值。

4.5Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)分析細胞凋亡 將對數(shù)生長期的PC12細胞按照5×107/L的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h。參照MTT和LDH釋放實驗的檢測結(jié)果，將PC12細胞隨機分為空白對照(blank control)組(每孔加入與姜黃素等體積DMEM培養(yǎng)基)、模型(model)組(每孔加入與姜黃素等體積的DMEM培養(yǎng)基)、姜黃素10 μmol/L組(每孔加入10 μmol/L姜黃素)和姜黃素20 μmol/L組(每孔加入20 μmol/L姜黃素)。各組均于37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)2 h，除空白對照組外每孔分別加入40 μmol/L Aβ25-35，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。1 200 r/min離心5 min，收集細胞，1 mL PBS沖洗2次，結(jié)合緩沖液中重懸成單細胞懸液；最后加入50 mg/L的Annexin V-FITC和PI液各5 μL，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)60 min，用流式細胞術(shù)檢測凋亡情況。每個劑量組設(shè)6個平行孔，取6孔平均值。

4.6凋亡相關(guān)酶活性的檢測 按方法4.5分組培養(yǎng)細胞。嚴格按照caspase-3、caspase-8和caspase-9活性測定試劑盒說明進行檢測，以酶標儀于波長405 nm處的吸光度(A)表示活性變化。每份樣品檢測6次，取平均值。

4.7Western blot檢測凋亡相關(guān)酶的表達 收集分組培養(yǎng)的細胞，加入含有25 mmol/L HEPES、1% Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA、1 mmol/L PMSF和1 mg/L亮肽素的冰冷裂解緩沖液(pH 7.4)，10 000 r/min、 4 ℃離心10 min，棄沉渣，收集上清液，BCA法測定總蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣后，進行10% SDS-PAGE。當電泳完成后，電轉(zhuǎn)至0.45 μm的PVDF膜上，5%脫脂奶粉PBST (含25 mmol/L pH 7.5的Tris、150 mmol/L NaCl和0.1% Tween 20) 4 ℃封閉2 h。然后加入兔抗人caspase-3、caspase-8和caspase-9單克隆抗體(均以1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。PBST洗滌后，加入生物素標記的山羊抗兔 II 抗(1∶500稀釋)室溫孵育2 h。PBST洗滌3次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對各組條帶進行計值及統(tǒng)計分析。以β-actin為內(nèi)參照，抗體孵育方法與上述方法相同，蛋白的相對表達水平=目標蛋白表達水平/β-actin蛋白表達水平。每份樣品檢測6次，取平均值。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 姜黃素對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞存活率的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞存活率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，預(yù)先加入10 μmol/L和20 μmol/L姜黃素可顯著提高細胞存活率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見圖1。

2 姜黃素對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞LDH釋放率的影響

與空白對照組比較，模型組Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞LDH釋放率顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，預(yù)先加入10 μmol/L和20 μmol/L姜黃素可顯著降低LDH釋放率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見圖2。

Figure 1. The effects of curcumin at different concentrations on the viability of the PC12 cells induced by Aβ25-35.Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖1不同濃度姜黃素對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞存活率的影響

Figure 2. The effects of curcumin at different concentrations on the LDH release rates of the PC12 cells induced by Aβ25-35.Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖2不同濃度姜黃素對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞LDH釋放率的影響

3 姜黃素對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡率顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素10 μmol/L組和姜黃素20 μmol/L組細胞凋亡率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見圖3。

4 姜黃素對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡相關(guān)酶活性的影響

比色分析結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞caspase-3、caspase-8和caspase-9的酶活性顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素10 μmol/L組和姜黃素20 μmol/L組細胞的caspase-3、caspase-8和caspase-9酶活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見表1。

Figure 3. The results of flow cytometry analysis for determining the effects of curcumin on the apoptotic rates of the PC12 cells induced by Aβ25-35. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖3姜黃素對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的影響

表1姜黃素對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞caspase-3、caspase-8和caspase-9酶活性的影響

Table 1. The effects of curcumin on the activity of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 in the PC12 cells induced by Aβ25-35(Mean±SD.n=6)

GroupCaspase-3Caspase-8Caspase-9Blankcontrol0.312±0.0290.294±0.0210.163±0.018Model0.656±0.068**0.605±0.064**0.597±0.062**Curcumin10μmol/L0.426±0.032﹟0.418±0.029﹟0.403±0.028﹟Curcumin20μmol/L0.391±0.030##0.355±0.027##0.326±0.026##

**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

5 姜黃素對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡相關(guān)蛋白相對表達的影響

Western blot分析結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞caspase-3、caspase-8和caspase-9蛋白相對表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素10 μmol/L組和姜黃素20 μmol/L組細胞的caspase-3、caspase-8和caspase-9蛋白相對表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見圖4、表2。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可顯著升高Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞的存活率。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，姜黃素可降低Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞LDH釋放率。LDH是一種糖酵解酶，主要存在于機體組織細胞的胞質(zhì)內(nèi)，當細胞凋亡或壞死時，細胞膜結(jié)構(gòu)損害或完全裂解，胞質(zhì)內(nèi)的LDH就會釋放外泄到培養(yǎng)液里[11]。因此，測定LDH釋放率可以間接反映細胞的損傷情況或藥物對細胞的毒性作用[12]。以上結(jié)果提示，姜黃素對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞具有一定的保護作用。

Figure 4. The effects of curcumin on the protein levels of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 determined by Western blot.

圖4Westernblot分析結(jié)果

表2姜黃素對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞caspase-3、caspase-8和caspase-9相對表達水平的影響

Table 2. The effects of curcumin on the relative expression levels of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 in the PC12 cells induced by Aβ25-35(Mean±SD.n=6)

GroupCaspase-3Caspase-8Caspase-9Blankcontrol0.332±0.0460.115±0.0180.067±0.003Model1.431±0.156**0.808±0.129**0.435±0.051**Curcumin10μmol/L0.837±0.120﹟0.574±0.071﹟0.277±0.044﹟Curcumin20μmol/L0.751±0.107##0.216±0.026##0.128±0.016##

**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

本研究中流式細胞術(shù)分析證實，姜黃素亦能抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡。細胞凋亡是指發(fā)生在生理狀態(tài)下的細胞程序性死亡，其特點是不發(fā)生炎癥反應(yīng)，細胞凋亡受分子水平的調(diào)控[13]。為探討姜黃素抗Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12凋亡的可能機制，本研究對凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9進行了檢測。Caspases是一個在細胞凋亡中起關(guān)鍵作用的酶家族，是細胞凋亡的介導(dǎo)者和執(zhí)行者，其激活或超量表達均會引起細胞發(fā)生凋亡，因此又稱凋亡蛋白酶，對凋亡起關(guān)鍵作用[14]。有研究表明，細胞的凋亡是由于caspase逐步發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)引起的[15]。Caspase-3位于caspases級聯(lián)反應(yīng)的下游，被認為是誘導(dǎo)細胞凋亡真正的實施者[16]。經(jīng)典的細胞凋亡途徑分為2條，包括細胞外途徑和細胞內(nèi)凋亡途徑[17]。在細胞外途徑中，死亡配體和相對應(yīng)的受體結(jié)合形成死亡信號，接著再與信號傳導(dǎo)分子相連接，進一步與caspase-8結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物，從而使caspase-8活化，當caspase-8直接與caspase-3發(fā)生作用，caspase-3被激活，進而誘導(dǎo)細胞凋亡[18]；而細胞內(nèi)途徑也稱為線粒體途徑，在此途徑中，凋亡刺激因子與凋亡蛋白酶激活因子1(apopto-tic protease-activating factor 1，APAF1)形成多聚復(fù)合物，然后與胞質(zhì)中的caspase-9前體結(jié)合，形成巨大復(fù)合物，巨大復(fù)合物引起caspase-9前體活化，caspase-9再激活下游的caspase-3，從而發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，最后誘導(dǎo)細胞凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示，姜黃素顯著降低Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性并下調(diào)其表達。以上結(jié)果提示，姜黃素可能通過下調(diào)caspase-3、caspase-8和caspase-9的表達從而抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡。

綜上所述，姜黃素對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞具有明顯的保護作用，抑制其凋亡。姜黃素的抗凋亡機制可能與下調(diào)caspase-3、caspase-8和caspase-9表達有關(guān)。至于其它機制是否參與姜黃素抗Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡，如線粒體凋亡途徑中的細胞色素C，將有待進一步探討。

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