二甲雙胍聯(lián)合膈下逐瘀湯對多囊卵巢綜合征胰島素抵抗大鼠TLR4/NF-κB信號通路的影響*

姜曉琳， 張立德， 滕 飛， 馬賢德， 呂美君， 王 瑩， 褚春莉

(遼寧中醫(yī)藥大學 1醫(yī)院管理處門診部， 2中醫(yī)臟象理論及應用教育部重點實驗室， 遼寧 沈陽 110032； 3遼寧省中醫(yī)研究院， 遼寧 沈陽 110034)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)的臨床表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂、肥胖，多毛和痤瘡等癥狀。PCOS患者激素的長期紊亂可導致胰島素抵抗(insulin resistance， IR)，誘發(fā)糖尿病[1]。育齡期婦女PCOS的發(fā)病率為5%～10%，胰島素抵抗和高雄激素血癥是其發(fā)生相關并發(fā)癥及臨床表現(xiàn)的核心因素，近年來的深入研究還表明， PCOS存在慢性炎癥反應，且慢性炎癥是相關并發(fā)癥的始動因素，其能誘發(fā)胰島素抵抗、卵巢多囊樣改變和雄激素分泌升高等癥狀[2]。長時間的臨床治療經(jīng)驗積累顯示，對該類患者進行藥物干預治療能很好地改善激素水平紊亂狀態(tài)并緩解炎性反應等[3]。在慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者中的研究表明， Toll樣受體4(Toll-like receptor-4，TLR-4)是一種天然免疫受體，被革蘭陰性菌外膜脂多糖等刺激活化后，經(jīng)過一系列磷酸化促進作用，它可激活核因子κB(nucler factor-κB，NF-κB)信號通路，從而調(diào)節(jié)各種炎癥因子的表達[4]，而PCOS的啟動因素恰恰是慢性炎癥的長時間刺激[2]。在祖國醫(yī)學中，PCOS多從腎虛血瘀來辯證，而化瘀是治療PCOS必不可少的環(huán)節(jié)。膈下逐瘀湯(Ge Xia Zhu Yu decoction)為清代王清任《醫(yī)林改錯》中的藥方，是活血化瘀的經(jīng)典方劑。有報道顯示，膈下逐瘀湯有改善微循環(huán)和盆腔環(huán)境、緩解盆腔組織粘連、抗炎止痛及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的作用[5]；膈下逐瘀湯聯(lián)合炔雌醇環(huán)丙孕酮片達英-35可以提高治療多囊卵巢綜合征的療效[6]，但是沒有對二甲雙胍(metformin， Met)聯(lián)合膈下逐瘀湯治療PCOS的機制進行研究。本研究通過建立PCOS大鼠模型，進一步明確膈下逐瘀湯治療PCOS的作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物、試劑和儀器

1.1實驗動物 選用160只近交系健康性成熟的Wistar雌性大鼠[遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證編號為SYZX(遼)-2015-0001；8～10 周齡， 210～230 g]構(gòu)建PCOS大鼠模型，其中成功造模130只。造模成功的130只大鼠當晚禁食，次晨于尾緣靜脈取血做空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)檢測，計算胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index, IRI)。IRI=FBG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5[7]。以IRI>2.8[8]作為PCOS胰島素抵抗動物模型建立成功的標志，共有130只大鼠造模成功。將130只大鼠隨機分成模型(model)組(40只)、二甲雙胍(Met)組(45只)及二甲雙胍聯(lián)合膈下逐瘀湯(combination)組(45只)，最后順利完成研究的大鼠共110只(模型組30只，二甲雙胍組40只，二甲雙胍聯(lián)合膈下逐瘀湯組40只)。各組大鼠的基線資料間差異無統(tǒng)計學顯著性，見表 1、2。

1.2主要試劑 二甲雙胍(原料藥)由Bristol-Myers Squibb Company提供；注射用脫氫表雄酮為武漢華美科技集團有限公司產(chǎn)品；膈下逐瘀湯(桃仁9 g、紅花9 g、當歸9 g、川芎6 g、赤芍6g、香附4.5 g、枳殼45 g、烏藥9 g、五靈脂6 g、元胡 3 g、丹皮6 g、甘草9 g)為遼寧中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院產(chǎn)品，中藥飲片加入10倍量水，浸泡 2 h，煎沸 30 min，過濾取煎液，藥渣加入8倍量水，煎沸 30 min，合并2次煎煮液后過濾，濾液濃縮至含生藥 5.75 g/L，按人與大鼠藥物劑量換算的等效劑量(34.5 mg·kg-1·d-1)給藥[9-12]，濃縮水煎液， 4 ℃保存?zhèn)溆?；注射用油劑為武漢頂輝化工有限公司產(chǎn)品；大鼠白細胞介素6(interleukin-6， IL-6) ELISA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α， TNF-α) ELISA試劑盒和胰島素ELISA試劑盒為武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司產(chǎn)品；大鼠C反應蛋白(C-reactive protein， CRP) ELISA試劑盒和葡萄糖測試盒為上海浩然生物科技有限公司產(chǎn)品；免疫組織化學試劑盒為中杉金橋公司產(chǎn)品；RT-PCR試劑盒為TaKaRa產(chǎn)品；Trizol試劑為Invitrogen產(chǎn)品

表1 造模成功后進入研究的3組大鼠基線資料分析

2hPBG： 2-hour postprandial blood glucose.

表2 完成研究的3組大鼠造模前基線資料分析

1.3主要儀器 iMark酶標儀(BioTek)；RM2245型石蠟切片機(Leica)；7500 Real-Time PCR儀(Applied Biosystems)；BioSpec-nano型紫外可見分光光度計(島津公司)；冷凍離心機(Thermo)；光學顯微鏡(Leica)；FA2004精密天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；ASD-310S型低溫離心機和ASD-310S型低溫離心機(Sigma)；PCR儀(Biometra)。

2 實驗方法

2.1PCOS大鼠動物模型的建立 將160只Wistar雌性大鼠適應性飼養(yǎng)2 周，每籠5只，人工控溫(20～26 ℃)，12 h光照，12 h黑暗，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水進食；根據(jù)大鼠的體重將脫氫表雄酮按照0.6 mg/kg進行配制并注射，每日注射前用注射油劑將其稀釋為0.2 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配；將配制好的脫氫表雄酮注射液注射于大鼠頸背部皮下，每天注射一次，連續(xù)注射20 d[8], 后在光學顯微鏡下觀察大鼠一個動情周期(連續(xù)4 d)的陰道涂片，以出現(xiàn)陰道上皮持續(xù)角化并失去完整的動情周期代表PCOS造模成功[8]。將造模成功的PCOS模型鼠當晚禁食，次晨于尾緣靜脈取血做FBG和FINS檢測， 計算IRI。

2.2PCOS大鼠的分組及處理 將130只造模成功的大鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型(model)組(40只)、二甲雙胍(Met)組(45只)和二甲雙胍聯(lián)合膈下逐瘀湯(combination)組(45只)；根據(jù)人與大鼠體重比進行換算得出大鼠給藥劑量， 模型組給予生理鹽水灌胃；二甲雙胍組給予二甲雙胍粉末(270 mg·kg-1·d-1)灌胃(依據(jù)體重決定液體灌胃混懸液體積，灌胃前用0.9%氯化鈉注射液配成30 g/L的混懸液)；二甲雙胍聯(lián)合膈下逐瘀湯組大鼠在給予二甲雙胍基礎上，再給予膈下逐淤湯(34.5 mg·kg-1·d-1)灌胃[9-12]，連續(xù)給藥28 d(相當于7個動情期)。

2.3測定血清IL-6、CRP和TNF-α含量及FBG和餐后2 h血糖(2-hour postprandial blood glucose， 2hPBG)水平 干預結(jié)束后，將各組大鼠禁食24 h，次日清晨抽取腹腔靜脈血檢測FBG，抽取后立即給予2.5 g/kg的葡糖糖灌胃，120 min后再次抽取尾緣靜脈血檢測2hPBG。抽血后腹腔注射20%氨基甲酸乙酯溶液(0.05 mL/kg)麻醉，腹主動脈取血,離心取血清，用ELISA法測定各組大鼠血清中IL-6、CRP和TNF-α的含量，按照試劑盒說明書進行操作。

2.4RT-PCR測定NF-κB、TLR-4和氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein， ox-LDL)的mRNA表達 將留取的卵巢組織勻漿并按Trizol試劑盒說明書提取出總RNA。鑒定RNA純度與完整性后按試劑盒說明以(oligo)dT為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以2 μL的cDNA為模板按試劑盒說明進行PCR擴增，反應條件為： 94 ℃ 1 min；Tm(根據(jù)不同模板而確定的退火溫度)50 s， 72 ℃ 90 s，進行40個循環(huán)。擴增產(chǎn)物20 g/L瓊脂糖凝膠電泳40 min，紫外燈(260 nm)下進行檢測。用Quantity One軟件分析各目的基因的條帶密度，以管家基因GAPDH為內(nèi)參照計算各個樣本的基因條帶密度的相對值，半定量后用均數(shù)和標準差形式表示。Marker由小到大依次是100、250、500、750、1 000和2 000 bp。各引物均由TaKaRa合成，GAPDH的上游引物序列為5’-CAAGGTCATCCATGCAAACTTTG-3’，下游引物序列為5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’(496 bp)；NF-κB的上游引物序列為5’-AACGCAAA AGGACCTACGAGA-3’,下游引物序列為5’-GGATGTTGAAAAGGCATAGGG-3’ (161 bp)；TLR-4的上游引物序列為5’-GCCATTGCCAACATCATCC-3’，下游引物序列為5’-ACAATTCCACCTGCTGCCTCAG-3’(208 bp)；ox-LDL的上游引物序列為5’-CAACCAACCTGCAATCCTTT-3’，下游引物序列為5’-TGCAGCAACAGAAGGCATAC-3’(106 bp)。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，計數(shù)資料結(jié)果用百分數(shù)形式表示。計量資料組間均數(shù)比較采用方差分析；計數(shù)資料組間率的比較采用卡方檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 造模成功后的大鼠完成實驗率及其退出研究原因分析

模型組、二甲雙胍組和二甲雙胍聯(lián)合膈下逐瘀湯組完成率分別為75.00%、88.89%和88.89%，3組大鼠完成率差異無統(tǒng)計學顯著性(χ2=4.104，P=0.129)，見表 2。其中，模型組治療造模過程中5只(12.50%)大鼠因皮下感染導致死亡(長期注射導致背部皮下發(fā)生感染)，5只(12.50%)大鼠因灌胃導致食管損傷而導致死亡(進食差而出現(xiàn)死亡)；二甲雙胍組大鼠2只(4.44%)大鼠因皮下感染導致死亡(長期注射導致背部皮下發(fā)生感染)，3只(6.67%)大鼠因灌胃導致食管損傷而導致死亡(進食差而出現(xiàn)死亡)；聯(lián)合用藥組大鼠3只(6.67%)大鼠因皮下感染導致死亡(長期注射導致背部皮下發(fā)生感染)，2只(4.44%)大鼠因灌胃導致食管損傷而導致死亡(進食差而出現(xiàn)死亡)。

2 造模前后陰道脫落細胞學觀察(動情期變化)

造模前大鼠動情周期穩(wěn)定，光學顯微鏡下陰道涂片觀察可見成熟的角化脫落上皮，到動情前期出現(xiàn)有核上皮；造模成功后大鼠陰道角化和有核上皮數(shù)量均顯著減少，以角化上皮減少為主，動情期間和動情期后白細胞增加，角化上皮脫落減少，動情期縮短，動情間期延長。

3 FBG、2hPBG及血清IL-6、CRP和TNF-α含量的變化

ELISA結(jié)果示， 干預結(jié)束后二甲雙胍組和聯(lián)合用藥組兩組大鼠FPG、2hPBG及血清IL-6、TNF-α和CRP濃度均低于模型組(P<0.05)，且聯(lián)合用藥組大鼠上述指標均低于二甲雙胍組(P<0.05)，見表 3。

表33組大鼠干預后外周血糖、胰島素及血清炎性因子水平比較

Table 3. Comparison of peripheral blood glucose, insulin and serum inflammatory factors in the 3 groups of rats after intervention (Mean±SD)

GroupnFBG(mmol/L) 2hPBG(mmol/L)IRIFINS(mU/L)IL-6(ng/L)TNF-α(ng/L)CRP(mg/L)Model305.54±0.737.34±1.313.87±0.4314.56±2.1234.42±8.6734.32±7.541.82±0.21Met404.86±1.12*5.41±1.12*3.23±0.73*13.21±1.56*28.57±7.21*18.32±2.54*1.31±0.24*Combination404.63±0.81*#5.22±0.72*#3.11±0.63*#12.11±1.78*#23.54±6.32*#13.54±3.21*#1.17±0.21*#

*P<0.05vsmodel group;#P<0.05vsMet group.

4 NF-κB、TLR-4和ox-LDL的mRNA表達水平的變化

RT-PCR結(jié)果顯示，干預結(jié)束后二甲雙胍組和聯(lián)合用藥組大鼠卵泡上皮NF-κB、TLR-4和ox-LDL的mRNA表達水平均低于模型組(P<0.05)，且聯(lián)合用藥組大鼠卵泡上皮NF-κB、TLR-4和ox-LDL的mRNA表達水平均低于二甲雙胍組(P<0.05)，見圖1、表4。

討 論

在祖國醫(yī)學中，PCOS歸屬于月經(jīng)量少、閉經(jīng)、不孕和癥瘕等疾病范疇，其病機為肝脾腎功能失調(diào)、氣滯血瘀和痰濕阻滯。膈下逐瘀湯中，桃仁、紅花、當歸、川芎和赤芍可活血化瘀，現(xiàn)代藥理研究認為其可以抑制血小板聚集，防止血栓產(chǎn)生；香附、枳殼和烏藥可理氣行滯，現(xiàn)代藥理研究認為其可以抗菌抗炎；香附、五靈脂和元胡可活血止痛，現(xiàn)代藥理研究認為其可以調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，增強機體抵抗力[5]。

Figure 1. The changes of mRNA expression levels of NF-κB, TLR-4 and ox-LDL.

圖1NF-κB、TLR-4和ox-LDLmRNA表達水平的變化

表43組大鼠干預后卵巢組織NF-κB、TLR-4和ox-LDL的mRNA表達水平

Table 4. The mRNA expression levels of NF-κB, TLR-4 and ox-LDL in rat ovarian tissue after intervention (Mean±SD)

GroupnNF-κBTLR-4ox-LDLModel300.68±0.120.73±0.110.51±0.11Met400.43±0.10*0.62±0.10*0.32±0.08*Combination400.22±0.08*#0.42±0.08*#0.26±0.07*#

*P<0.05vsmodel group;#P<0.05vsMet group.

近年來，現(xiàn)代醫(yī)學對PCOS的研究認為其是一種亞臨床炎癥反應，這種亞臨床炎癥反應可損傷胰島β細胞，進而損傷卵巢而導致多囊樣改變及激素分泌異常，因此改善炎癥反應成為治療PCOS的研究熱點[13-15]。有報道顯示，卵巢組織中TLR-4/NF-κB信號通路在PCOS胰島素抵抗的發(fā)病過程中扮演了重要角色[16]。TLRs 是人類先天性免疫識別受體的重要組成部分，是唯一能將細胞外抗原信息向細胞內(nèi)傳遞的跨膜蛋白[17]；ox-LDL 是 TLR-4的內(nèi)源性配體。TLRs 與ox-LDL結(jié)合后，激活NF-κB，產(chǎn)生 IL-6和TNF-α 等炎癥因子。NF-κB 屬轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是主導炎癥發(fā)生、發(fā)展的關鍵因子。因此，抑制NF-κB的活性，降低 TLR-4和ox-LDL 的表達，可能是藥物治療PCOS 的有效途徑。本研究通過建立PCOS大鼠模型進行研究，將二甲雙胍與膈下逐瘀湯聯(lián)合使用進行藥物治療干預，以證實2種藥物聯(lián)合能否通過NF-κB/TLR-4信號通路起到治療PCOS的目的。結(jié)果顯示，治療28 d后，二甲雙胍與膈下逐瘀湯聯(lián)合使用， 能減少NF-κB活化，降低TLR4和ox-LDL的表達，減輕IL-6和TNF-α分泌，與模型對照組和二甲雙胍單用組比較，差異均有統(tǒng)計學意義。因此，膈下逐瘀湯可能是通過減少NF-κB活化入核，降低TLR-4和ox-LDL表達，減輕IL-6和TNF-α的分泌，起到了治療PCOS的作用。此外，通過對炎性因子濃度的監(jiān)測，IL-6和TNF-α濃度的降低，也降低了NF-κB的活化入核，兩者形成的良性循環(huán)，使PCOS的癥狀得到了較好的控制。

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