帕金森病患者外周血中骨髓來(lái)源抑制性細(xì)胞的檢測(cè)及臨床意義*

楊 毅， 張曉玲， 官俏兵， 郭 麗， 張 慧， 韓晨陽(yáng)， 王琰萍

(嘉興市第二醫(yī)院， 浙江 嘉興 314001)

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種由大腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元減少及腦區(qū)域α-突觸核蛋白沉淀引起的神經(jīng)退化性疾病，黑質(zhì)神經(jīng)元減少導(dǎo)致紋狀體多巴胺的減少并出現(xiàn)一系列運(yùn)動(dòng)障礙是帕金森病發(fā)病的重要表現(xiàn)之一[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)免疫炎癥反應(yīng)和氧化損傷在帕金森病的發(fā)生發(fā)展中有著重要的意義[2-3]，就免疫炎癥反應(yīng)而言，免疫抑制性調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)于其促進(jìn)和發(fā)展的作用是直接且巨大的。有研究表明[4]，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在帕金森小鼠中顯著增高，在帕金森患者外周血中亦增高。而骨髓來(lái)源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)同樣具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，但是其在帕金森病中的作用報(bào)道較少，且其中重要的2組亞型CD14+CD11b+和CD14-CD11b+的差異尚未見(jiàn)報(bào)道。本文主要研究帕金森病患者外周血中CD14+CD11b+和CD14-CD11b+骨髓來(lái)源抑制性細(xì)胞與Hoehn-Yahr分期的關(guān)系，以及相關(guān)免疫抑制因子精氨酸酶1(arginase 1，ARG1)、白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)和環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)的表達(dá)水平。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

選擇2016年1月～2017年3月于我院收治并確診為PD的患者80人，其中男性48人，女性32人，年齡在58～86歲，平均年齡(69.5±5.7)歲，病程1～7年。按照Hoehn-Yahr法將80名患者進(jìn)行分期，其中I級(jí)22人，II級(jí)24人，III級(jí)20人，IV級(jí)14人，V級(jí)0人。健康志愿者20人，其中男性10人，女性10人，年齡在25～45歲，平均年齡(31.5±6.7)歲，身體健康情況良好?；颊呷朐壕炇鹬橥鈺?shū)。

2 方法

2.1外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 所有受試的患者及健康志愿者均禁食12 h后抽取肘靜脈外周血5 mL，置于EDTA抗凝管，1 h內(nèi)分離提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood monouclear cells，PBMC)，具體方法如下，在無(wú)菌條件下將外周血進(jìn)行1 500 r/min離心15 min，棄去上層血清，于血細(xì)胞沉淀中加入生理鹽水15 mL，均勻吹打后加入10 mL的淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科有限公司)，3 000 r/min離心30 min，小心吸取中間的單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至干凈的無(wú)菌管中，1 500 r/min離心10 min，棄去上清液后用PBS洗2次，最后得到的細(xì)胞加入PBS均勻吹打制備成為混懸液，待檢測(cè)。

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD14+CD11b+和CD14-CD11b+細(xì)胞 將上述制備得到的PBMC混懸細(xì)胞分為2份，轉(zhuǎn)入無(wú)菌的離心管中，分別加入抗細(xì)胞表面膜蛋白抗體(anti-CD3、anti-CD11b、anti-CD14、antiCD4、antiCD8、anti-CTLA-4和anti-Tim3抗體，均購(gòu)于BD)，避光反應(yīng)20 min后用PBS洗2次，之后加入0.5 mL PBS重懸，上機(jī)檢測(cè)。

2.3磁珠分選CD14+CD11b+和CD14-CD11b+細(xì)胞及總RNA的提取 將上述得到的PBMC加入Washing Buffer重懸，吹打均勻后按照1×107細(xì)胞加入15 μL CD14磁珠，混勻后避光孵育20 min，再加入0.5 mL的Washing Buffer后離心，利用MS柱在磁場(chǎng)條件下分選收集CD14陰性的細(xì)胞，后取下柱子加入1.5 mL的Washing Buffer，在外界活塞壓力下得到CD14陽(yáng)性的細(xì)胞，得到的CD14陽(yáng)性細(xì)胞按照上述方法在CD11b磁珠下分選，最終得到CD14+CD11b+和CD14-CD11b+2群MDSCs，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。

在上述細(xì)胞中加入1 mL的Trizol液(TaKaRa)，孵育20 min后加入0.5 mL氯仿，振蕩2 min，在4 ℃下12 000 r/min離心15 min，上層水層為RNA，吸取RNA轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的離心管中，加入0.5 mL異丙醇震蕩2 min后靜置。離心后加入75%乙醇，混勻后12 000 r/min離心。取沉淀加入無(wú)酶的雙蒸水10 μL，檢測(cè)A260/A280比值(1.8～2.0)。保存在-80 ℃下備用。

2.4qPCR檢測(cè)ARG1、IL-10和COX-2的mRNA表達(dá) 按照SYBR-qPCR-Kit(TaKaRa)試劑盒操作，設(shè)計(jì)qPCR的引物，序列見(jiàn)表1。在無(wú)RNA酶的PCR管中加入總RNA 1.0 μg，加水定容至12 μL，吹打均勻后在85 ℃保溫5 min，使RNA變性，隨后在冰盒中放置10～15 min冷卻。在上述的PCR管中加入Oligo 0.5 μL、Random Primer 0.5 μL、10 mmol/L的dNTP 0.5 μL、核酸酶抑制劑0.5 μL、 5×Buffer 4.0 μL和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL，總體積為20.0 μL，將上述反應(yīng)溶液于30 ℃保溫10 min、42 ℃保溫50 min，85 ℃反應(yīng)10 min后迅速冷卻，在-20 ℃條件下保存cDNA。在qPCR實(shí)驗(yàn)前將cDNA用滅菌純水按照1∶10稀釋?zhuān)渲品磻?yīng)體系為滅菌純水4 μL、SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、上游引物 0.5 μL(10 μmol/L)和下游引物 0.5 μL(10 μmol/L)，總體積 15 μL，上機(jī)檢測(cè)。循環(huán)反應(yīng)為： 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 15 s， 40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以2-ΔΔCt法計(jì)算并分析mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qPCR的引物序列

F: forward； R: reverse.

2.5Western blot檢測(cè)MDSCs表面膜蛋白CD14和CD11b以及ARG1、IL-10和COX-2的表達(dá) 將經(jīng)磁珠分選的細(xì)胞分別提取后，以2 mL PBS分別清洗，加入500 μL的裂解液和5 μL的PMSF，冰上裂解完全后在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，上清液在-20 ℃下保存。經(jīng)過(guò)BCA試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行蛋白定量后，用常規(guī)方法進(jìn)行Western blot檢測(cè)(CD14、CD11b、ARG1、IL-10和COX-2的 I 抗和 II 抗購(gòu)于Abcam)。

2.6ELISA檢測(cè)ARG1、IL-10和COX-2的含量 在上述提取的總蛋白上清液中取一半，按照ELISA試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)的操作步驟檢測(cè)ARG1、IL-10和COX-2的含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)帕金森病患者與健康志愿者PBMC 中CD14+CD11b+和CD14-CD11b+細(xì)胞比例的差異

PD組PBMC中CD14+CD11b+細(xì)胞的比例與control組相比無(wú)明顯變化，而CD14-CD11b+細(xì)胞的比例與control組相比顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)表2。Western blot結(jié)果顯示，2組細(xì)胞CD11b表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而PD組的CD14表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

表2健康志愿者與帕金森病患者外周血2種MDSCs比例的比較

Table 2. The proportions of two kinds of MDSCs in control and PD groups (%. Mean±SD)

GroupnCD14+CD11b+CD14-CD11b+Control2034.25±2.1527.12±2.54PD8033.51±4.2148.51±5.74*

*P<0.05vscontrol group.

Figure 1. The protein expression of CD14 and CD11b on the cell surface. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1細(xì)胞表面CD14和CD11b蛋白的表達(dá)

2 帕金森病患者外周血中CD14+CD11b+和CD14-CD11b+細(xì)胞的比例與Hoehn-Yahr分期的關(guān)系

按照Hoehn-Yahr法將80名患者進(jìn)行分期，將患者流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中2組間CD14+CD11b+細(xì)胞比例的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，與Hoehn-Yahr分期無(wú)關(guān)，而CD14-CD11b+細(xì)胞的比例隨病情進(jìn)展(分期增高)而增高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3MDSCs的分類(lèi)比例與Hoehn-Yahr分期的關(guān)系

Table 3. The relationship between the proportions of two kinds of MDSCs in control and PD groups and their stages of Hoehn-Yahr (%. Mean±SD)

GroupStagenCD14+CD11b+CD14-CD11b+Control-2034.25±2.1527.12±2.54PDI2235.74±5.1239.21±8.24*II2432.41±4.8446.52±5.43*III2034.85±7.2151.64±6.46*IV1435.19±3.7458.21±5.89*

*P<0.05vscontrol group.

3 兩群細(xì)胞ARG1、IL-10和COX-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較

通過(guò)磁珠分選得到CD14+CD11b+細(xì)胞和CD14-CD11b+細(xì)胞后提取總RNA，利用qPCR技術(shù)檢測(cè)ARG1、IL-10和COX-2的mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)，以及ELISA法驗(yàn)證蛋白含量。結(jié)果顯示，PD組的CD14-CD11b+細(xì)胞和CD14+CD11b+細(xì)胞共同高表達(dá)IL-10和COX-2，且與對(duì)照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而PD組中僅CD14-CD11b+細(xì)胞高表達(dá)ARG1，與CD14+CD11b+細(xì)胞和control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4、圖2及表5。

表42群細(xì)胞ARG1、IL-10和COX-2的mRNA表達(dá)水平

Table 4. The mRNA expression levels of ARG1, IL-10 and COX-2 in the 2 kinds of MDSCs of control and PD groups (Mean±SD.n=3)

GroupSubtypeARG1IL-10COX-2ControlCD14+CD11b+0.023±0.0020.012±0.0020.075±0.001CD14-CD11b+0.012±0.0010.020±0.0020.078±0.001PDCD14+CD11b+0.022±0.0020.032±0.001*0.124±0.005*CD14-CD11b+0.031±0.001*0.051±0.002*0.154±0.004*

*P<0.05vscontrol group.

Figure 2. The protein expression levels of ARG1, IL-10 and COX-2 in 2 groups of cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖22群細(xì)胞ARG1、IL-10和COX-2的蛋白表達(dá)水平

表5ELISA法檢測(cè)2群細(xì)胞ARG1、IL-10和COX-2的蛋白表達(dá)水平

Table 5. The protein levels of ARG1, IL-10 and COX-2 in the 2 kinds of MDSCs of control and PD groups measured by ELISA (ng/L. Mean±SD.n=3)

GroupSubtypeARG1IL-10COX-2ControlCD14+CD11b+8.50±0.4011.21±0.737.63±1.20CD14-CD11b+6.58±0.769.23±0.7310.13±1.23PDCD14+CD11b+8.80±0.8013.52±0.86*9.83±0.73*CD14-CD11b+8.87±1.20*11.85±0.73*14.85±0.93*

*P<0.05vscontrol group.

討 論

傳統(tǒng)意義上人們對(duì)于帕金森病發(fā)病原因的認(rèn)識(shí)集中在中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變形缺失及路易小體形成，導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的減少，臨床表現(xiàn)主要為運(yùn)動(dòng)障礙。而近年來(lái)最新研究發(fā)現(xiàn)，帕金森病患者中樞與外周的免疫失衡與發(fā)病有著重要的關(guān)聯(lián)，其黑質(zhì)紋狀體中MPTP和脂多糖等免疫炎癥指標(biāo)呈現(xiàn)高表達(dá)，且黑質(zhì)區(qū)還有異常聚集的T細(xì)胞，說(shuō)明免疫炎癥反應(yīng)會(huì)引起機(jī)體免疫的失衡[5-6]。而抑制性免疫細(xì)胞作為免疫調(diào)節(jié)的一大家族，近年來(lái)關(guān)注度較高的為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和MDSCs，在以往的文獻(xiàn)報(bào)道中已經(jīng)證實(shí)了前者在帕金森病患者外周血中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，所以免疫的抑制可能與炎癥反應(yīng)的發(fā)生和進(jìn)展有著極大的促進(jìn)作用[7-8]，可以說(shuō)免疫抑制是一種促進(jìn)帕金森病發(fā)病和進(jìn)程的高危因素。

MDSCs可以通過(guò)多種途徑發(fā)揮免疫抑制的作用，主要通過(guò)抑制CD8+T細(xì)胞及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)增來(lái)抑制機(jī)體免疫反應(yīng)[9]，在腫瘤的研究中已經(jīng)明確了其促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，根據(jù)表面標(biāo)志物的不同，可以分為單核系MDSCs(CD14-CD11b+)和粒系MDSCs(CD14+CD11b+)。有研究表明，單核系MDSCs對(duì)于免疫抑制的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于粒系MDSCs[10]；MDSCs的免疫抑制作用是多樣的，它不但可以直接抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖和分泌能力，還能通過(guò)抑制MHCII表達(dá)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，由于MHCII和抗原復(fù)合物可以引起T細(xì)胞的特異性識(shí)別，而T細(xì)胞在識(shí)別表面抗原的同時(shí)還會(huì)釋放淋巴因子刺激巨噬細(xì)胞的吞噬能力，所以MDSCs在抑制MHCII的同時(shí)也間接抑制了巨噬細(xì)胞的吞噬作用[11]。

但是對(duì)于免疫抑制來(lái)說(shuō)，抑制性細(xì)胞的作用不是唯一的，一些關(guān)鍵的抑制性細(xì)胞因子的高表達(dá)同樣可以引起免疫抑制反應(yīng)[12]，其中比較具有代表性的是ARG1、IL-10和COX-2，ARG1作為MDSCs中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)酶，它的表達(dá)越高，L-精氨酸的含量就越低，同時(shí)就會(huì)導(dǎo)致過(guò)氧化物大量的產(chǎn)生，導(dǎo)致免疫炎癥反應(yīng)，而IL-10和COX-2同時(shí)可以參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，是重要的免疫抑制因子[13-14]，尤其是IL-10可以通過(guò)抑制CD28+T細(xì)胞的酪氨酸酶磷酸化來(lái)抑制T細(xì)胞的增殖。

MDSCs目前在帕金森病中的研究還未見(jiàn)專(zhuān)門(mén)報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)，帕金森病患者外周血中2群MDSCs的比例是不同的，其中單核系所占的比例顯著增高，而粒系的比例的差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說(shuō)明在帕金森病患者的發(fā)病中MDSCs確實(shí)起到了免疫抑制的作用，而此作用僅僅與單核系有關(guān)，由于單核系的免疫抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于粒系，所以對(duì)于帕金森病的發(fā)病起到了重要的作用，而深入的研究發(fā)現(xiàn)，單核系MDSCs在不同Hoehn-Yahr分期的患者中的比例是不同的，病情越嚴(yán)重、分期越高的患者，單核系所占的比例越高，組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而粒系不具備此種特點(diǎn)，這說(shuō)明單核系MDSCs促進(jìn)了帕金森病的進(jìn)展，且它所占的比例可以間接反映出帕金森病患者的病情程度，在2群細(xì)胞中我們還檢測(cè)了ARG1、IL-10和COX-2的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)IL-10和COX-2在2群細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)，參考意義不大，而ARG1僅在單核系MDSCs中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，這可以表明ARG1和單核系MDSCs有著密切的關(guān)系，兩者共同作用于帕金森病的發(fā)生和發(fā)展，所以將ARG1和單核系MDSCs作為帕金森病發(fā)生發(fā)展的佐證指標(biāo)是有一定的意義的。

綜上所述，本研究表明單核系MDSCs在帕金森病患者外周血中比例升高，且與Hoehn-Yahr分期密切相關(guān)，同時(shí)單核系MDSCs中ARG1也呈現(xiàn)高表達(dá)，所以可以將兩者結(jié)合作為帕金森病輔助診斷和分期的依據(jù)之一，但是局限于本研究病例數(shù)有限，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大病例來(lái)驗(yàn)證。

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