PCR技術(shù)在布魯氏菌檢測與鑒別中的應(yīng)用

秦立得，南文龍，陳義平

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

布魯氏菌病（Brucellosis，以下簡稱布病）是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種人獸共患病。布魯氏菌分為10個種型：6種經(jīng)典型菌種，即羊種、牛種、豬種、綿羊附睪種、沙林鼠種和犬種；4種新發(fā)現(xiàn)種型，即B.microti、B.ceti、B.inopinata和B.pinnipedialis[1-2]。它們可感染豬、牛、犬、羊、鼠、駱駝等多種哺乳動物，其中羊種、牛種和豬種可感染人。

常用的布魯氏菌病原檢測方法包括布魯氏菌分離培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法[3]。布魯氏菌分離培養(yǎng)是布魯氏菌檢測和種型區(qū)分的金標(biāo)方法，但該方法耗時長，并需要在生物安全三級實驗室中進(jìn)行[4]。分子生物學(xué)病原檢測技術(shù)具有安全可靠、靈敏度高、特異性強、操作簡便等特點，已開始在布魯氏菌檢測中推廣應(yīng)用[5-6]，其中研究最多的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法。PCR方法已廣泛應(yīng)用于布病診斷、環(huán)境及動物產(chǎn)品的布魯氏菌檢測、布魯氏菌分型等方面，能從全血、血清、組織、體液等多種樣品，以及牛奶、奶酪、生肉等食品中檢出布魯氏菌，而且能從患病初期血清學(xué)陰性樣品中檢出病原，從而彌補了血清學(xué)檢測方法的不足[7]。

1 通用型布魯氏菌PCR檢測方法

通用型布魯氏菌PCR檢測方法包括普通PCR、巢式PCR和熒光定量PCR等。1990年，F(xiàn)ekete等[8]首先開發(fā)出檢測布魯氏菌的PCR方法，證明PCR方法具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點。通用型布魯氏菌PCR檢測方法常檢測的保守基因包括16S-23S rRNA基因[9]、omp2基因[10]、bcsp31基因[11]、IS6501（IS711）重復(fù)序列[12]和per基因[13]等。大量的比對驗證表明，這些基因檢測結(jié)果的敏感性存在差異。

2007年，Manal等[14]使用bcsp31基因引物（B4/B5）、omp2基因引物（JPF/JPR）和16S-23S rRNA基因引物（F4/R2），檢測147份陽性血清和50份陰性血清。結(jié)果顯示，這3對引物檢測結(jié)果的特異性強，但敏感性存在差異。其中：B4/B5引物敏感性最高為98%（144/147），最低檢出限為700 CFU/mL；JPF/JPR引物敏感性為88.4%（130/147），最低檢出限為7×105CFU/mL；F4/R2引物敏感性為53.1%（78/147），最低檢出限為7×107CFU/mL。

2009年，Bounaadja等[15]根據(jù)IS711、bcsp31和 per基因，建立了3種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法，并與檢測相同基因的普通PCR和巢式PCR方法進(jìn)行了比對試驗。結(jié)果顯示，上述熒光定量PCR方法較普通PCR和巢式PCR方法靈敏度提高了50～500倍，IS711、bcsp31和 per基因熒光定量PCR方法最低檢出限分別為0.2、2和2 fg布魯氏菌基因組，但這3種方法在檢測不同種型布魯氏菌時存在敏感性差異。

2 不同種型布魯氏菌PCR檢測鑒別方法

2.1 多重PCR

多重PCR是布魯氏菌種型檢測與鑒定的常用方法。1994年，Bricker等[16]根據(jù)高度保守的IS711重復(fù)序列在不同種型布魯氏菌基因組中的數(shù)量和分布特點，設(shè)計了通用型IS711引物和不同種型布魯氏菌引物，建立了能同時檢測1型、2型和4型牛種布魯氏菌，羊種布魯氏菌，綿羊附睪種布魯氏菌和1型豬種布魯氏菌的多重PCR（AMOS PCR）。隨后Bricker等[17]又在上述方法中增加了兩對引物，使該方法能夠區(qū)分牛種布魯氏菌疫苗株S19株和RB51株。2000年，Ewalt等[18]使用AMOS PCR方法檢測經(jīng)分離培養(yǎng)確定為牛種布魯氏菌的231份樣品，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果與布魯氏菌分離培養(yǎng)鑒別結(jié)果一致。目前，AMOS PCR已得到廣泛認(rèn)可，并在布魯氏菌檢測、種型鑒別和流行病學(xué)調(diào)查中得到廣泛應(yīng)用。

近年來多重PCR方法在AMOS PCR的基礎(chǔ)上又有了進(jìn)一步發(fā)展。2006年，García-Yoldi等[19]開發(fā)出能區(qū)分經(jīng)典型布魯氏菌種型和亞種，牛種布魯氏菌疫苗株S19和RB51，以及羊種布魯氏菌疫苗株Rev1的多重PCR。2009 年，Huber等[20]開發(fā)出不僅能實現(xiàn)之前此類多重PCR檢測的效能，并能區(qū)分牛種布魯氏菌1、2、4型與 3、5、6、9型，豬種布魯氏菌1、3、4型與2、5型的多重PCR。2010年，Mayer-Scholl等[21]進(jìn)一步完善了該方法，設(shè)計了能檢測區(qū)分包括B.microti、B.inopinata、B. ceti和B.pinnipedialis在內(nèi)的目前已知的所有種型布魯氏菌多重PCR方法。

2.2 不同種型熒光定量PCR

最初建立的布魯氏菌不同種型檢測與鑒別熒光定量PCR方法的目的基因，往往選擇經(jīng)多重PCR方法確認(rèn)的相應(yīng)序列，由此開發(fā)出了牛種、豬種和羊種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法。2007年，Ai Dahouk等[22]對比了2種羊種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法、3種牛種布魯氏菌和1種豬種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法，檢測了248份已知樣品（包括各型布魯氏菌菌株、臨床分離布魯氏菌菌株和68株其他菌株）。檢測結(jié)果表明：這些方法特異性強，與檢測同種布魯氏菌的熒光定量PCR方法靈敏度相同，其中羊種布魯氏菌基因組最低檢出限為16 fg，豬種為100 fg，牛種為18 fg；檢測敏感性存在差異，羊種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法可檢測所有種型羊種布魯氏菌樣。Redkar等[23]開發(fā)的牛種和豬種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法只能單獨檢測1型、2型、4型和部分6型牛種布魯氏菌和1型豬種布魯氏菌。

隨著對布魯氏菌全基因序列的深入研究，布魯氏菌的不同種型和生物型的特異性核酸多態(tài)性位點或特異性序列相繼被發(fā)現(xiàn)，并依此開發(fā)了相應(yīng)的熒光定量PCR檢測鑒別方法。

2008年，Hini?等[24]根據(jù)不同種型布魯氏菌特異性序列，建立了通用型布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法，羊種、豬種、牛種、綿羊附睪種、沙林鼠種和犬種6種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法，通過樣品檢測發(fā)現(xiàn)，只有豬種、沙林鼠種和綿羊附睪種布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法特異性強。

2010年，Winchell等[25]分析總結(jié)出7種布魯氏菌的特異性單核氨酸多態(tài)性位點，建立了能檢測區(qū)分羊種、豬種、綿羊附睪種、沙林鼠種、犬種和感染海洋生物的布魯氏菌（B.ceti和B.pinnipedialis）的熒光定量PCR方法，證明以上方法的最低檢測限分別為100、1、100、10、100和10 fg布魯氏菌基因組；使用以上方法檢測153份樣品，證明這些方法具有良好的特異性和敏感性。

2015年，Vahhab等[26]根據(jù)牛種和羊種布魯氏菌的種特異性核酸位點，建立了能檢測區(qū)分牛種和羊種布魯氏菌的熒光定量PCR方法，發(fā)現(xiàn)該方法對牛種和羊種布魯氏菌基因組最低檢出限均為1.5 pg；使用該方法檢測160份臨床樣品和17株非布魯氏菌菌株，證明其具有良好的特異性和敏感性。

2016年，Kim等[27]發(fā)現(xiàn)牛種布魯氏菌基因組種特異性突變位點，建立了能檢測并區(qū)分牛種布魯氏菌的熒光定量PCR方法，發(fā)現(xiàn)該方法最低檢出限為20 fg或4 CFU牛種布魯氏菌基因組；使用該方法檢測296株已知布魯氏菌菌株和8株非布魯氏菌菌株，結(jié)果檢測出了所有牛種布魯氏菌菌株。

2017年，Kaden等[28]發(fā)現(xiàn)羊種布魯氏菌基因中存在種特異性核酸缺失，以此建立了能檢測區(qū)分羊種布魯氏菌的熒光定量PCR方法，發(fā)現(xiàn)該方法最低檢測限約為6.25個布魯氏菌基因組；使用該方法檢測120份人類臨床分離羊種布魯氏菌、37株布魯氏菌代表型菌株和45株非布魯氏菌菌株，證明其具有良好的特異性和敏感性。

2.3 不同生物型熒光定量PCR

2015年，H?nsel等[29]發(fā)現(xiàn)豬種布魯氏菌1～4型有特異性重復(fù)序列，而后建立了能檢測豬種布魯氏菌1～4型熒光定量PCR方法，發(fā)現(xiàn)該方法最低檢測限為12.5 fg布魯氏菌基因組DNA；使用該方法檢測25份各種型布魯氏菌基因組樣品、75份已知豬種布魯氏菌分離株樣品和30株非布魯氏菌樣品，發(fā)現(xiàn)該方法特異性強，對布魯氏菌1～4生物型檢出率為95%。

2.4 其他PCR方法

1996年，Ouahrani-Bettache等[30]根據(jù)IS711序列在不同種型布魯氏菌基因組中分布的多態(tài)性，建立了能區(qū)分多種布魯氏菌和疫苗株B19的錨定PCR方法。2012年，Mirnejad等[31]設(shè)計能同時檢測區(qū)分牛種和羊種布魯氏菌的PCR方法（RFLPPCR），通過對PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，可進(jìn)一步分析結(jié)果。此外，將限制性片段長度多態(tài)性分析、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析、隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)、芯片技術(shù)等與PCR技術(shù)相融合并應(yīng)用于布魯氏菌種型或菌株的檢測與鑒別，都取得了理想的效果。

3 布魯氏菌疫苗菌株P(guān)CR檢測鑒別方法

接種弱毒疫苗是控制布病的有效方法。常見的疫苗包括牛種布魯氏菌19（S19）、4520（4520）疫苗，羊種布魯氏菌Rev.1疫苗，豬種布魯氏菌S2疫苗，粗糙型牛種布魯氏菌株51（RB51）疫苗等。目前，多種布魯氏菌弱毒疫苗在我國布病防控中發(fā)揮了積極作用，但也出現(xiàn)了干擾診斷等問題，而PCR方法可區(qū)分弱毒疫苗株與野生型菌株。

3.1 普通PCR

1994 年，Sangari等[32]發(fā)現(xiàn)牛種布魯氏菌弱毒疫苗株 B19存在702 bp的基因缺失，并依此設(shè)計了檢測B19弱毒疫苗株的PCR方法。1999 年，Vemulapalli等[33]發(fā)現(xiàn)牛種布魯氏菌弱毒疫苗株RB51存在特異性的IS711基因插入，因此建立了能檢測弱毒疫苗株RB51的PCR方法。2002 年，Cloeckaert等[34]發(fā)現(xiàn)羊種布魯氏菌弱毒疫苗株Rev.1存在特異性基因突變，設(shè)計了能檢測Rev.1弱毒疫苗株的PCR方法。此外，還將上述布魯氏菌疫苗菌株普通PCR檢測方法有效整合于布魯氏菌快速檢測和分型的多重PCR方法中[18-21]。

2014年，Nan等[35]建立能檢測區(qū)分豬種布魯氏菌弱毒疫苗株S2的雙重PCR方法，發(fā)現(xiàn)檢測豬種布魯氏菌1型時產(chǎn)生285 bp條帶，檢測S2時產(chǎn)生285和497 bp兩條帶。該方法最低檢出限為27 fg豬種布魯氏菌1型菌株基因組和60 pg S2弱毒疫苗株基因組。

3.2 熒光定量PCR

2016年，Nan等[36]發(fā)現(xiàn)牛種布魯氏菌弱毒疫苗株A19菌株存在特異性位點，以此設(shè)計了能檢測區(qū)分A19疫苗株的熒光定量PCR方法，發(fā)現(xiàn)該方法最低檢出限為7.6 fg A19疫苗株布魯氏菌基因組；使用該方法檢測79株已知布魯氏菌菌株、125份陽性血清樣品和4株非布魯氏菌菌株，證明其具有良好的特異性和敏感性；2018年，Nan等[37]還發(fā)現(xiàn)牛種布魯氏菌弱毒疫苗株104M存在特異性的基因突變，以此設(shè)計了能檢測區(qū)分104M疫苗株的熒光定量PCR方法，發(fā)現(xiàn)該方法最低檢出限為220 fg 104M疫苗株基因組。

4 結(jié)語

布魯氏菌PCR方法與傳統(tǒng)的血清學(xué)和細(xì)菌學(xué)檢測方法相比具有簡便快捷、特異性強、靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點，其檢測結(jié)果得到了廣泛接受和認(rèn)可。目前多重PCR和熒光定量PCR在布魯氏菌檢測、布魯氏菌菌種鑒別、疫苗株與野毒株區(qū)分等方面得到了廣泛應(yīng)用，滿足了檢驗檢疫、流行病學(xué)調(diào)查、人和動物布病診斷等多方面的需求。目前，PCR技術(shù)又實現(xiàn)了與芯片技術(shù)、微流體技術(shù)等新技術(shù)的融合，可進(jìn)行大量樣品中多種病原的快速同步檢測和分析，有效提高了檢測效率，將更有助于布魯氏菌的快速檢測和分型。