兒童型脊髓性肌萎縮癥治療研究進展

趙淼 陸瑛倩 王檸 陳萬金

脊髓性肌萎縮癥（SMA）是嬰幼兒期最常見的致死性神經(jīng)遺傳性疾病，其特征性病理改變?yōu)榧顾枨敖铅吝\動神經(jīng)元選擇性變性，臨床主要表現(xiàn)為肢體近端進行性、對稱性肌無力和肌萎縮［1］。根據(jù)發(fā)病年齡可分為兒童型和成人型，其中，兒童型脊髓性肌萎縮癥呈常染色體隱性遺傳，其人群發(fā)病率為1/10 000～ 1/6000，人群攜帶者發(fā)生率為1/60～1/40［2］；成人型脊髓性肌萎縮癥多于20～30歲以上發(fā)病，可呈常染色體隱性、顯性和X連鎖隱性遺傳等遺傳方式，人群發(fā)病率約為0.32/10 000［3］。兒童型脊髓性肌萎縮癥是因位于染色體5q13區(qū)域的運動神經(jīng)元存活1（SMN1）基因突變所致，其中95%為純合缺失突變，少數(shù)為微小突變［4］。染色體5q13區(qū)域還存在1個與SMN1基因高度同源的拷貝，即SMN2基因，可以部分代償SMN1基因功能。目前臨床尚無有效治療方法，但近年來脊髓性肌萎縮癥治療研究取得較大進展，主要包括小分子化合物、反義寡核苷酸（ASO）、基因增補和干細胞移植治療等［5］，本文擬就兒童型脊髓性肌萎縮癥的治療研究進展進行綜述。

一、小分子化合物

SMN1基因與SMN2基因高度同源，二者主要存在5個堿基差異，但SMN1基因主要編碼產(chǎn)生全長SMN蛋白，而SMN2基因僅編碼產(chǎn)生極少量（約10%）全長SMN蛋白，主要是由于SMN2基因外顯子7在剪接過程中被跳躍，編碼產(chǎn)生外顯子7缺失的轉(zhuǎn)錄本和截短蛋白，這種截短蛋白極不穩(wěn)定，易降解。對于大部分脊髓性肌萎縮癥患者而言，SMN2基因編碼產(chǎn)生的極少量全長SMN蛋白不足以彌補SMN1基因缺失導(dǎo)致的SMN蛋白缺乏，從而導(dǎo)致脊髓前角運動神經(jīng)元變性。因此，如何升高全長SMN蛋白表達水平，成為主要治療策略［6］。研究顯示，多種小分子化合物可以調(diào)節(jié)SMN基因外顯子7的剪接，這些小分子化合物大致分為2種類型，一種是以組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi）為主的傳統(tǒng)小分子化合物［7］，一種是新型小分子化合物［8］。

1.傳統(tǒng)小分子化合物 組蛋白去乙?；福℉DAC）與DNA緊密結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄和翻譯，而增強SMN2基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，DNA解螺旋十分重要。2001年，Chang等［9］發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c對脊髓性肌萎縮癥模型小鼠治療有效；亦證實丁酸鈉衍生物苯丁酸鈉也可以顯著提高脊髓性肌萎縮癥患者纖維母細胞全長SMN基因轉(zhuǎn)錄水平。自此，組蛋白去乙?；敢种苿┲饾u成為治療脊髓性肌萎縮癥的熱門藥物，其中丙戊酸鈉最受關(guān)注［10］。Sumner等［11］研究顯示，丙戊酸鈉可以升高Ⅰ型脊髓性肌萎縮癥患者纖維母細胞全長SMN蛋白表達水平。Tsai等［12］采用丙戊酸鈉治療Ⅲ型脊髓性肌萎縮癥模型小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠脊髓全長SMN蛋白表達水平升高，形態(tài)完整的神經(jīng)?肌肉接頭數(shù)目增多，肌萎縮癥狀緩解。然而遺憾的是，Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗并未顯示出丙戊酸鈉可以改善脊髓性肌萎縮癥患者肌力［13］。除組蛋白去乙酰化酶抑制劑外，其他小分子化合物也受到關(guān)注。2002年，Kinali等［14］提出一種非組蛋白去乙?；敢种苿扯“反?，可以顯著改善脊髓性肌萎縮癥患者肌力、用力肺活量（FVC）和體重。隨后Ⅱ期臨床試驗亦顯示，沙丁胺醇可以顯著改善Ⅱ型脊髓性肌萎縮癥患者肌力、肌容積和運動功能［15］。2008年的一項臨床研究證實，另一種小分子化合物羥基脲亦可以輕度改善脊髓性肌萎縮癥患者肌力［16］，但臨床試驗并未顯示出其可以顯著改善患者肌力和運動功能［17］?？傊鲜鰝鹘y(tǒng)小分子化合物雖然在細胞和動物實驗中顯示出部分療效，但除沙丁胺醇外，其余臨床療效均尚未明確，缺乏臨床應(yīng)用前景［18］。

2.新型小分子化合物 近年來，美國Pfizer公司、瑞士Roche公司和瑞士Novartis公司等知名醫(yī)藥企業(yè)均致力于脊髓性肌萎縮癥新型小分子化合物的研發(fā)。美國Pfizer公司生產(chǎn)的喹唑啉及其衍生物可以增強SMN2基因啟動子活性，抑制清道夫脫帽酶（Dcps），從而升高全長 SMN 蛋白表達水平［19］。Butchbach等［20］予SMNΔ7模型小鼠（輕型脊髓性肌萎縮癥模型小鼠名稱，Δ7指SMA基因外顯子7缺失）口服喹唑啉，結(jié)果顯示，小鼠神經(jīng)系統(tǒng)全長SMN蛋白水平升高，運動神經(jīng)元缺失減少，存活期延長21% ～ 30%。Van Meerbeke等［21］予 SMNΔ7模型小鼠靜脈注射喹唑啉衍生物RG3039，結(jié)果顯示，小鼠體內(nèi)DcpS水平被抑制20%以上，神經(jīng)系統(tǒng)全長SMN蛋白水平升高30%～40%，囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運體1（vGluT1）數(shù)目增加50%，下后鋸肌和最長肌神經(jīng)?肌肉接頭數(shù)目增加20%，中位存活期延長66%。Gogliotti等［19］采用 RG3039 對 2B/?SMA 模型小鼠（雜合子小鼠模型）進行早期干預(yù)，中位存活期延長6倍（＞112天）。目前，RG3039已進入Ⅰ期臨床試驗階段。2014年，瑞士Roche公司與美國PTC公司合作，從人胚腎細胞（HEK）293H中篩選出3種可以改善SMN2基因外顯子7剪接功能的藥物，分別命名為SMN?C1、SMN?C2和SMN?C3，并證實在脊髓性肌萎縮癥患者纖維母細胞和誘導(dǎo)型多能干細胞（iPSCs）水平，這3種化合物可以選擇性上調(diào)全長SMN2 mRNA 表達［8］。Naryshkin 等［8］予 SMNΔ7 模型小鼠腹腔注射 SMN?C1、SMN?C2和 SMN?C3，結(jié)果顯示，小鼠大腦和股四頭肌全長SMN蛋白水平分別升高為150%和90%，尤其是SMN?C3，口服即可使平均存活期延長超過150天。2015年，瑞士Novartis公司研究顯示，SMN2基因編碼產(chǎn)生不穩(wěn)定SMN蛋白的作用機制是SMN2基因前體mRNA和U1小核核糖核酸蛋白結(jié)合不緊密，并證實新型噠嗪類化合物使二者緊密結(jié)合，從而升高全長SMN蛋白表達水平［22］。此類新型噠嗪類化合物優(yōu)勢在于可口服給藥，目前已進入臨床試驗階段。

二、反義寡核苷酸

SMN2基因外顯子7 C＞T突變使外顯子剪接增強子（ESE）突變?yōu)橥怙@子剪接沉默子（ESS），導(dǎo)致SMN2基因前體RNA在剪接過程中發(fā)生外顯子7跳躍，產(chǎn)生截短mRNA，翻譯產(chǎn)生不穩(wěn)定SMN蛋白；此外，SMN2基因內(nèi)含子7存在與異種核糖核蛋白（hnRNP）A1相關(guān)的內(nèi)含子剪接沉默子（ISS），其中內(nèi)含子剪接沉默子N1（ISS?N1）是重要的反式作用因子，定位于SMN2基因內(nèi)含子7第10～24位堿基，包含2個hnRNP A1/A2結(jié)合位點，是影響剪接功能的另一重要結(jié)構(gòu)［23］。因此，通過靶向設(shè)計針對內(nèi)含子剪接沉默子位點的反義寡核苷酸可以阻止hnRNP A1/A2與內(nèi)含子剪接沉默子結(jié)合，使外顯子7在剪接過程中得以保留，上調(diào)脊髓性肌萎縮癥模型小鼠肝臟全長SMN mRNA表達，從而轉(zhuǎn)錄翻譯為全長SMN蛋白［24］。天然反義寡核苷酸在血清和細胞中不穩(wěn)定，易降解，且利用率較低。為提高反義寡核苷酸的穩(wěn)定性和利用率，應(yīng)對其進行相應(yīng)化學(xué)修飾［25］。目前主要有3種修飾方式：2'OMePS修飾、2'?MOE 修飾和 PMO 修飾［26］。2011 年，Hua 等［27］予脊髓性肌萎縮癥模型小鼠皮下注射大劑量針對SMN2基因 ISS?N1位點的經(jīng) 2'?MOE 修飾的反義寡核苷酸ASO?10?27，以封閉內(nèi)含子剪接沉默子，結(jié)果顯示，Smn?/?和SMN2+/0模型小鼠（重型脊髓性肌萎縮癥模型小鼠名稱，前者系鼠源SMN基因缺失，后者系該基因缺失后再導(dǎo)入2條人源SMN2基因）運動神經(jīng)元SMN蛋白水平升高，Ⅰ型脊髓性肌萎縮癥模型小鼠平均存活期延長至248天。Porensky等［28］予SMAΔ7模型小鼠側(cè)腦室注射經(jīng)2'OMePS修飾的反義寡核苷酸，結(jié)果顯示，模型小鼠存活期延長8倍。Zhou等［29］發(fā)現(xiàn)，靜脈注射經(jīng)PMO修飾的反義寡核苷酸效率更高，可使Ⅰ型脊髓性肌萎縮癥模型小鼠存活期延長25倍。Rigo等［30］予食蟹猴腦脊液注射ASO?10?27，免疫組織化學(xué)檢測未見脊髓前角運動神經(jīng)元變性。目前，經(jīng)2'?MOE修飾的反義寡核苷酸鞘內(nèi)注射已在早發(fā)性脊髓性肌萎縮癥嬰幼兒和遲發(fā)性脊髓性肌萎縮癥兒童中開展Ⅲ期臨床試驗（試驗編號：NCT02193074）。2016年 12月，Nusinersen（商品名：Spinraza）作為一種反義核苷酸成為全球首個獲得美國食品與藥品管理局（FDA）批準的脊髓性肌萎縮癥治療藥物。除ISS?N1位點是公認治療靶點外，Hua等［31］還發(fā)現(xiàn)，體外應(yīng)用經(jīng) 2'?MOE 修飾的反義寡核苷酸對SMN2基因外顯子7剪接沉默子區(qū)域進行封閉，也可以使全長SMN mRNA和蛋白水平升高。內(nèi)含子7還存在另一調(diào)控SMN2基因剪接功能的區(qū)域，即ISS?N2位點（該外顯子后內(nèi)含子的第275～297位堿基），Singh等［32］應(yīng)用反義寡核苷酸對該序列進行封閉，使外顯子7在剪接過程中得以保留。SMN2基因內(nèi)含子6和7分別存在Element 1區(qū)域（該外顯子前內(nèi)含子的第?112～?68位堿基）和Element 2區(qū)域（該外顯子后內(nèi)含子的第59～124位堿基），二者對SMN2基因剪接功能作用重大［33］。2016年，Osman等［33］研究顯示，應(yīng)用經(jīng)改良 PMO 修飾的反義寡核苷酸（E1MOv10和E1MOv11）封閉Element 1區(qū)域，可以使SMNΔ7模型小鼠全長SMN蛋白水平升高，存活期延長，尤其出生后即側(cè)腦室注射E1MOv11的小鼠，存活期可延長至120天以上。Miyaso等［34］發(fā)現(xiàn)，Element 2區(qū)域參與RNA?蛋白復(fù)合體形成，封閉Element 2區(qū)域反式作用因子，可以抑制外顯子7正常剪接，從而降低全長SMN蛋白水平。

三、基因增補

根據(jù)脊髓性肌萎縮癥的發(fā)病機制，最本質(zhì)治療策略是升高全長SMN蛋白水平，最直接治療方法是導(dǎo)入正常SMN cDNA，常用基因治療載體是慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒（AAV）和逆轉(zhuǎn)錄病毒等。腺相關(guān)病毒因具有安全性高、免疫原性低、性質(zhì)穩(wěn)定、感染細胞廣譜等優(yōu)點，成為體內(nèi)基因治療的優(yōu)選載體之一。

Passini等［35］分別采用包含完整 SMN cDNA 腺相關(guān)病毒8（AAV8）和自身互補腺相關(guān)病毒9（scAAV9）對脊髓性肌萎縮癥模型小鼠進行側(cè)腦室注射，結(jié)果顯示，scAAV9使小鼠中位存活期延長至157天，而AAV8僅延長至50天。此后，Dominguez等［36］予以出生早期（多為出生后1天）的脊髓性肌萎縮癥模型小鼠靜脈注射scAAV9?SMN，其結(jié)果顯示，小鼠中位存活期延長至199天。Foust等［37］和Valori等［38］的研究也顯示，靜脈注射scAAV9?SMN的脊髓性肌萎縮癥模型小鼠神經(jīng)?肌肉接頭形態(tài)、運動功能和存活期均有不同程度改善。Benkhelifa?Ziyyat等［39］嘗試向脊髓性肌萎縮癥模型小鼠腓腸肌肌肉注射scAAV9?SMN，其結(jié)果顯示，小鼠脊髓運動神經(jīng)元數(shù)目顯著增加，中位存活期提高1倍。除靜脈注射和肌肉注射外，Passini等［40］予脊髓性肌萎縮癥模型小鼠鞘內(nèi)注射5×103顆粒數(shù)的scAAV9?SMN，使全長SMN蛋白水平升高70%～170%，存活期延長至153天。Duque等［41］嘗試在體積更大的哺乳動物體內(nèi)鞘內(nèi)注射包含短發(fā)夾RNA（shRNA）的scAAV9（scAAV9?shRNA），對SMN1基因進行敲減，成功制備脊髓性肌萎縮癥豬模型，予scAAV9?SMN鞘內(nèi)注射改善其臨床癥狀和病理表現(xiàn)，結(jié)果顯示，模型豬復(fù)合肌肉動作電位（CMAP）顯著改善，表明出現(xiàn)癥狀后干預(yù)同樣有效。Meyer等［42］嘗試采用腰椎穿刺在獼猴腦脊液中注入低劑量（劑量僅為靜脈注射的1/10）scAAV9?SMN，結(jié)果顯示，scAAV9?SMN 在腰髓、胸髓和頸髓運動神經(jīng)元的感染率分別為73%、53%和29%，高于脊髓性肌萎縮癥模型小鼠。目前，靜脈注射scAAV9?SMN治療Ⅰ型脊髓性肌萎縮癥正在進行Ⅰ期臨床試驗（試驗編號：NCT02122952），其有效性和安全性尚待進一步評價。

四、干細胞移植治療

干細胞具有分化為多種功能細胞的潛能，為遺傳性疾病的治療提供新的策略。2008年，Corti等［43］從正常小鼠脊髓分離出表達綠色熒光的神經(jīng)干細胞（NSCs）并移植至脊髓性肌萎縮癥模型小鼠脊髓內(nèi)，小鼠存活期延長5.12天，運動障礙延遲8天。脊髓性肌萎縮癥的特征性病理改變是運動神經(jīng)元變性，如果將干細胞定向分化為正常運動神經(jīng)元或其前體細胞并移植至患者脊髓內(nèi)，治療效果可能更加理想。Wyatt等［44］嘗試將人胚胎干細胞（ESCs）分化的人運動神經(jīng)元前體細胞（hMNPs）移植至脊髓性肌萎縮癥模型小鼠脊髓內(nèi)，小鼠運動神經(jīng)元前體細胞成功存活并順利分化為運動神經(jīng)元，并分泌神經(jīng)生長因子（NGF）和神經(jīng)營養(yǎng)因子?3（NT?3）等，促進運動神經(jīng)元生長。2012年，Corti等［45］將脊髓性肌萎縮癥患者皮膚纖維母細胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)型多能干細胞，通過單鏈寡核苷酸基因修復(fù)，使SMN2基因轉(zhuǎn)變?yōu)镾MN1基因，誘導(dǎo)分化為表達SMN蛋白的誘導(dǎo)型多能干細胞，并移植至脊髓性肌萎縮癥模型小鼠脊髓內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小鼠運動神經(jīng)元數(shù)目增加，中位存活期延長7天。目前，干細胞移植治療脊髓性肌萎縮癥的臨床試驗仍在進行中，其有效性和安全性尚待進一步評價。

五、其他

除上述治療方法外，一些神經(jīng)保護劑（如利魯唑、奧利索西）也進入臨床試驗階段（試驗編號：NCT00774423，NCT01302600），但結(jié)果尚未明確。利魯唑可以改善運動神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)，但僅能輕度延長Ⅰ型脊髓性肌萎縮癥患者生存期［46］。奧利索西盡管可以改善脊髓性肌萎縮癥患者運動障礙，但不能延長生存期［47］。胰島素樣生長因子?1（IGF?1）聯(lián)合反式剪接RNA（tsRNA）可以改善脊髓性肌萎縮癥模型小鼠臨床表現(xiàn)［48］。此外，IPLEX是胰島素樣生長因子?1的衍生物，可以減少脊髓性肌萎縮癥模型小鼠運動神經(jīng)元變性，改善運動功能［49］。在反義寡核苷酸治療的啟示下，一類剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸（SSOs）的功能和結(jié)構(gòu)與之類似，易透過血?腦屏障（BBB）［50］。Hammond 等［51］采用經(jīng)改良剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸Pip6a?PMO修飾的肽寡核苷酸，低劑量全身給藥即可顯著延長脊髓性肌萎縮癥模型小鼠平均存活期至456天。近年臨床研究顯示，營養(yǎng)支持和康復(fù)鍛煉也可以改善脊髓性肌萎縮癥患者運動功能和預(yù)后［52］。

六、總結(jié)與展望

小分子化合物、反義寡核苷酸、基因增補、干細胞移植等治療方法均可以不同程度改善脊髓性肌萎縮癥神經(jīng)細胞或模型小鼠的臨床表現(xiàn)，僅部分方法顯示出較好的臨床療效，同時也存在給藥方式困難、價格昂貴等問題，距離臨床推廣應(yīng)用尚有一定時間。因此，關(guān)于兒童型脊髓性肌萎縮癥治療的研究仍有較大的探索空間。目前主要以臨床診斷為基礎(chǔ)，應(yīng)用基因篩查、產(chǎn)前診斷等方法，盡可能做到早期明確診斷，在經(jīng)濟條件允許的情況下予以新型藥物治療，配合積極的康復(fù)鍛煉，控制臨床癥狀、延緩疾病進展。相信在不久的將來，脊髓性肌萎縮癥的治療將取得更大突破。

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