骨碎補(bǔ)總黃酮的實(shí)驗(yàn)及臨床研究概況

李晉玉 趙學(xué)千 孫旗 鄭晨穎 白春曉 劉楚吟 李亞芳 賈育松

北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院骨1科，北京 100700

骨碎補(bǔ)為水龍骨科植物槲蕨的干燥根莖，是一味常用的傳統(tǒng)中藥。中醫(yī)認(rèn)為骨碎補(bǔ)性溫，味苦，歸肝、腎經(jīng)，具有強(qiáng)骨補(bǔ)腎、止痛續(xù)傷之功效，臨床用于筋骨折傷、腎虛腰痛、跌撲閃挫、耳鳴耳聾、牙齒松動(dòng)的治療，外治白癜風(fēng)、斑禿[1]。骨碎補(bǔ)的主要生物活性成分是黃酮類化合物，因其潛在的藥用價(jià)值而備受關(guān)注，在基礎(chǔ)及臨床研究中廣泛應(yīng)用。在基礎(chǔ)研究方面，可以總結(jié)為促進(jìn)成骨、抑制骨溶解、促進(jìn)血管再生、類雌激素性作用、抑制炎癥反應(yīng)等不同作用。在臨床研究方面，可以治療多種骨科疾病，如骨質(zhì)疏松癥、骨折、骨缺損、膝骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死、骨牽張技術(shù)等?，F(xiàn)將其目前在基礎(chǔ)及臨床的研究情況總結(jié)如下。

1 在骨質(zhì)疏松的研究概況

1.1 骨質(zhì)疏松癥的基礎(chǔ)研究

1.1.1在分子信號(hào)通路水平：骨碎補(bǔ)總黃酮在治療骨質(zhì)疏松癥中的分子信號(hào)通路包括兩種類型。(1)促進(jìn)骨形成。就目前的研究發(fā)現(xiàn)，主要有BMP-Smads信號(hào)通路、Wnt/β-catenin 通路及MAPK信號(hào)通路等信號(hào)通路參與調(diào)控骨形成，而促進(jìn)骨形成的相關(guān)信號(hào)蛋白的合成與釋放在其中起到了至關(guān)重要的作用。(2)抑制骨吸收。抑制骨吸收的相關(guān)信號(hào)通路被廣泛的研究，這其中主要有CTSK信號(hào)通路、OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路。通過(guò)抑制骨吸收，減少骨量流失，進(jìn)而避免骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。正常骨質(zhì)在骨形成及骨吸收之間保持著代謝平衡，大部分藥物都是通過(guò)調(diào)節(jié)骨吸收或者骨合成從而發(fā)揮作用，而骨碎補(bǔ)總黃酮在骨吸收與合成中均可發(fā)生作用。此外，骨碎補(bǔ)總黃酮還可以通過(guò)雌激素通路、谷氨酸通路、IHH通路等調(diào)節(jié)骨代謝平衡。最近又發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮改善骨質(zhì)疏松可能與抑制 Notch信號(hào)通路相關(guān)。

1.1.1.1骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)BMP-Smads信號(hào)通路的調(diào)控：骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)屬于TGF-β家族中多功能的生長(zhǎng)相關(guān)因子[2]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白主要分布于骨的基質(zhì)中，當(dāng)它的含量升高時(shí)，可以對(duì)骨形成產(chǎn)生影響，從而使骨密度增高，實(shí)現(xiàn)治療骨質(zhì)疏松癥的目的。BMP可以通過(guò)調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和激活Smads蛋白信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮成骨作用，Smads具有多種亞型，其中Smad1、Smad5、Smad8是BMP主要的效應(yīng)分子。BMP-Smads信號(hào)通路在成骨細(xì)胞分化、成熟的整個(gè)生命周期中起著重要的作用，從最開(kāi)始的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)向成骨細(xì)胞的分化到成骨細(xì)胞的增殖和形成骨細(xì)胞的礦化，都發(fā)揮重要作用。

朱慧鋒等[3]在研究骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮能夠明顯升高骨髓微環(huán)境中Smad1mRNA、Smad5 mRNA的表達(dá)水平，從而促進(jìn)骨形成、修復(fù)骨的損傷。Zhu等[4]研究骨碎補(bǔ)總黃酮在晚期糖基化終末產(chǎn)物作用下對(duì)成骨細(xì)胞的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮可以增加堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、I型膠原蛋白和鈣化結(jié)節(jié)的表達(dá)，可提高成骨細(xì)胞p38和Smad1、Smad5和Smad8蛋白磷酸化水平。姜自偉等[5]研究在骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)牽張成骨的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮可以使BMP-2與Smad-1的表達(dá)量增高。骨碎補(bǔ)總黃酮是骨碎補(bǔ)中黃酮類的總稱，而柚皮苷是其主要成分，柚皮苷作用于成骨細(xì)胞后，可以增強(qiáng)ALP的活性，當(dāng)它的活性增高時(shí)，說(shuō)明成骨細(xì)胞的分化旺盛。另外，骨碎補(bǔ)總黃酮還可以促進(jìn)骨鈣素、BNP-2的表達(dá)，表明骨碎補(bǔ)在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化的過(guò)程中有BNP的參與[6]。Wu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷通過(guò) Akt的磷酸化和AP-1的組件c-fos和c-jun的激活而使BMP-2的表達(dá)增加，從而發(fā)揮成骨作用。黃松等[8]在用骨碎補(bǔ)總黃酮處理去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠模型上發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮通過(guò)上調(diào)股骨組織中BMP-2蛋白和血清中的骨鈣素水平，進(jìn)而促進(jìn)骨組織的形成，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的目的。通過(guò)以上研究結(jié)果，可以得出骨碎補(bǔ)總黃酮治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制與激活BMP-Smads通路有關(guān)，而且骨碎補(bǔ)總黃酮不是作用于該通路的一個(gè)蛋白位點(diǎn)，而是多靶向的治療，甚至包括該通路的上游蛋白，如Akt，AP-1等。

1.1.1.2骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控：經(jīng)典的Wnt信號(hào)途徑是目前研究骨代謝相關(guān)疾病的熱點(diǎn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)骨重建的影響不僅表現(xiàn)在對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和分化產(chǎn)生影響[9]，同時(shí)也可以對(duì)成骨細(xì)胞的活性和功能產(chǎn)生影響[10]。該通路蛋白主要有細(xì)胞外因子Wnt蛋白、跨膜受體Fz、細(xì)胞膜上共受體LRP5/6、胞質(zhì)內(nèi)散亂蛋白(dishevelled，Dsh)、β-catenin、糖原合成激酶-3β(glycogen synthasekinase-3β， GSK-3β)、支架蛋白Axin(axisinhibition)、APC蛋白(adenomatous polyposis coli)、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF、下游靶基因(如cylinD1、c-myc、Runx2、Osx)等[11]。β-catenin作為成骨細(xì)胞分化和成骨的關(guān)鍵觸發(fā)因子，在Wnt/β-catenin通路上發(fā)揮著極為重要的作用。成骨細(xì)胞的分化是以Runx2基因的表達(dá)為標(biāo)志，該基因?qū)儆赪nt/β-catenin信號(hào)通路下游的表達(dá)結(jié)果，由此可以得出Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活直接影響著Runx2的活性及表達(dá)，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的分化[12]。Runx2基因的表達(dá)與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活呈正相關(guān)，由此可以得出成骨細(xì)胞的分化與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)系密切[13]。

李佩芳等[14]發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮誘導(dǎo)大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化時(shí)，在分化早期骨碎補(bǔ)總黃酮可以提高β-catenin、淋巴增強(qiáng)因子1(LEF-1)、細(xì)胞周期蛋白 D(cyclin D)mRNA的表達(dá)，分化晚期抑制其表達(dá)，由此可以得出骨碎補(bǔ)總黃酮發(fā)揮促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用主要是在分化早期。Liu等[15]通過(guò)柚皮苷對(duì)人羊水干細(xì)胞(hAFSCs)的有效誘導(dǎo)成骨分化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，骨橋蛋白(osteopontin，OPN)和I型膠原等標(biāo)記基因的劑量依賴性上調(diào)證實(shí)了柚皮苷對(duì)hAFSCs成骨分化的增強(qiáng)作用。骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)表達(dá)增加，核因子-κB配體(RANKL)受體激活劑表達(dá)減少，提示柚皮苷對(duì)hAFSCs破骨細(xì)胞的形成也有抑制作用。此外，骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、生長(zhǎng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)、β-catenin和細(xì)胞周期蛋白D1的基因表達(dá)也顯著增加，說(shuō)明柚皮苷通過(guò)BMP和β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)了hAFSCs的成骨。Lv等[16]研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷通過(guò)增加骨膜蛋白的表達(dá)，減少硬化蛋白的表達(dá)，以及活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的分化及增殖，從而發(fā)揮預(yù)防大鼠廢用性骨質(zhì)疏松癥的作用。柚皮苷促進(jìn)了UMR-106細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)，提高了β-連環(huán)蛋白的Ser552磷酸化水平，從而激活了淋巴增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子(T-cell factor，TCF)轉(zhuǎn)錄因子。在對(duì)去卵巢(OVX)小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，柚皮苷通過(guò)調(diào)節(jié)Akt和AMPK蛋白，激活β-連環(huán)蛋白，從而提高了骨強(qiáng)度[17]。通過(guò)以上研究，可以得出骨碎補(bǔ)總黃酮通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路從而激活成骨細(xì)胞的增殖、分化，得以實(shí)現(xiàn)治療骨質(zhì)疏松癥。

1.1.1.3骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)MAPK信號(hào)通路的調(diào)控：MAPK信號(hào)通路是成骨細(xì)胞分化、礦化的重要細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，是通過(guò)執(zhí)行三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的，最終激活MAPK而發(fā)揮作用。MAPK信號(hào)通路又包含以下3條信號(hào)通路：ERK通路、p38通路、JNK通路。激活ERK信號(hào)通路能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，提高成骨細(xì)胞ALP活性和礦化結(jié)節(jié)數(shù)量，而且可以上調(diào)ERα、p-ERK和Osterix蛋白的表達(dá)[18]。p38信號(hào)通路對(duì)于成骨細(xì)胞的分化是不可缺少的，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化和ALP、BMP-2表達(dá)，從而促進(jìn)骨的形成[19]。在成骨細(xì)胞分化的后期，JNK相關(guān)蛋白失活，骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)和OPN的表達(dá)隨之明顯降低，表明JNK信號(hào)通路發(fā)揮作用主要是在成骨細(xì)胞分化的后期[20]。

尹文哲等[21]研究發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮可以激活ERK通路，提高ALP的水平，從而可以提高成骨細(xì)胞的增殖和分化。張力等[22]研究發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮可以提高核結(jié)合因子a1和堿性磷酸酶mRNA的表達(dá)水平，表明骨碎補(bǔ)總黃酮可以促進(jìn)成肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，核結(jié)合因子a1和ALP作為p38 MAPK信號(hào)通路的主要因子，由此可以得出骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)p38 MAPK信號(hào)通路的影響。鄧傳超等[23]研究表明JNK通路可以抑制細(xì)胞分化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而骨碎補(bǔ)總黃酮可以通過(guò)抑制JNK通路相關(guān)蛋白的磷酸化，進(jìn)而減少模擬失重狀態(tài)下成骨細(xì)胞的凋亡。由以上研究可以發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮通過(guò)激活p38 MAPK信號(hào)通路及ERK通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化；抑制JNK通路，減少細(xì)胞凋亡。從而使成骨細(xì)胞的總數(shù)增加，提高骨密度。由此也可以說(shuō)明骨碎補(bǔ)總黃酮促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化及抑制成骨細(xì)胞凋亡可能與MAPK 信號(hào)通路相關(guān)。

1.1.1.4骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路的調(diào)控：OPG和核因子-κB配體受體激活劑(RANKL)被鑒定為破骨細(xì)胞形成的主要和最終介質(zhì)[24-25]。破骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的分化祖細(xì)胞受NF-κB配體受體激活劑的作用控制，由成骨細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)[26]。此外，成骨細(xì)胞還分泌骨保護(hù)素，一種可溶性RANKL誘餌受體，通過(guò)阻止其與破骨細(xì)胞及其前體上存在的其同源等級(jí)受體結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞的增殖、分化，促進(jìn)其凋亡。OPG水平升高或OPG /RANKL比值增加均可以降低破骨細(xì)胞的活性，抑制破骨細(xì)胞的分化成熟[27]。因此，相對(duì)OPG /RANKL比率決定了骨質(zhì)量和強(qiáng)度，并且具有高OPG水平保護(hù)過(guò)度破骨細(xì)胞骨吸收。

DRTF能刺激OPG的表達(dá)，抑制RANKL的表達(dá)提高OPG/RANKL在大鼠體內(nèi)的表達(dá)率，通過(guò)調(diào)節(jié)抑制破骨細(xì)胞的形成OPG/RANKL系統(tǒng)在成骨細(xì)胞中的表達(dá)[28]。Xu等[29]發(fā)現(xiàn)柚皮苷能協(xié)同增強(qiáng)1α，25 -二羥基維生素D3促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌OPG的作用。此外，柚皮苷還可影響破骨細(xì)胞的生成，進(jìn)而影響器官培養(yǎng)過(guò)程中的骨丟失。Song等[30]研究表明，DRTF對(duì)去卵巢大鼠具有骨保護(hù)作用，包括降低骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物水平、增強(qiáng)股骨生物力學(xué)強(qiáng)度和防止骨小梁微結(jié)構(gòu)退化。體外實(shí)驗(yàn)表明，骨碎補(bǔ)總黃酮調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性的作用是通過(guò)雌激素受體依賴性途徑實(shí)現(xiàn)的。而骨碎補(bǔ)總黃酮通過(guò)上調(diào)骨保護(hù)素和下調(diào)NF-κB配體受體激活劑(RANKL)的表達(dá)抑制破骨細(xì)胞的形成。劉康等[31]研究表明骨碎補(bǔ)總黃酮上調(diào)表達(dá)OPG mRNA，同時(shí)下調(diào)表達(dá)RANKL mRNA和RANK mRNA，使RANKL/OPG的比值下降，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的增殖、分化。朱振標(biāo)等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在用骨碎補(bǔ)總黃酮治療骨質(zhì)疏松模型大鼠12周后，大鼠血清中OPG的表達(dá)增高，RANKL的表達(dá)減少，RANKL/OPG的比值降低，骨碎補(bǔ)總黃酮可能是通過(guò)減小RANKL/OPG的比值，發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞成熟、分化及活化的作用，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收，從而起到治療骨質(zhì)疏松的作用。通過(guò)以上研究結(jié)果可以說(shuō)明OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路是骨碎補(bǔ)防治骨質(zhì)疏松癥的重要途徑之一。

1.1.1.5骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)CTSK信號(hào)通路的調(diào)控：CTSK是一種主要存在于破骨細(xì)胞中的蛋白水解酶，通過(guò)促進(jìn)骨膠原纖維的降解來(lái)促進(jìn)骨吸收，主要參與I型膠原蛋白(Collagen I)、OPN、骨連接蛋白等的降解[33]。因此認(rèn)為抑制CTSK信號(hào)通路可以抑制骨組織降解的作用，進(jìn)而可抑制骨吸收作用，從而達(dá)到改善骨質(zhì)疏松癥的目的。

倪力剛等[34]研究表明骨碎補(bǔ)總黃酮通過(guò)降低骨組織中Cathepsin K mRNA表達(dá)量來(lái)提高模型大鼠股骨骨礦含量，從而實(shí)現(xiàn)治療骨質(zhì)疏松的目的。史曉林等[35]在研究骨碎補(bǔ)總黃酮作用于去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥模型中，發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮可以降低血清中CTSK含量和脛骨中的CTSK基因的表達(dá)，從而改善骨質(zhì)疏松的癥狀。由此推斷，骨碎補(bǔ)總黃酮可能通過(guò) CTSK 信號(hào)通路來(lái)抑制破骨細(xì)胞的增殖分化，抑制骨吸收，從而發(fā)揮其骨保護(hù)的作用。

1.1.1.6骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)Notch信號(hào)通路的調(diào)控：Yu等[36]研究表明，柚皮苷可提高成骨基因mRNA水平和notch 1表達(dá)，而降低PPARγ2 mRNA水平。提示柚皮苷的成骨作用部分涉及Notch信號(hào)通路。韓亞力等[37]研究發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮可以下調(diào)骨質(zhì)疏松大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞 Notch-1、Hes-1 mRNA和蛋白水平升高。同樣得出骨碎補(bǔ)總黃酮可改善骨質(zhì)疏松癥，且其機(jī)制可能與抑制Notch信號(hào)通路相關(guān)。兩者得出相反的結(jié)論，需進(jìn)一步驗(yàn)證得出更為準(zhǔn)確的結(jié)論。

1.1.1.7骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)IHH信號(hào)通路的調(diào)控：IHH途徑已被證明與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化密切相關(guān)[38]。柚皮苷通過(guò)IHH信號(hào)通路上調(diào)Foxc2的表達(dá)，從而發(fā)揮促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化的作用[39]。

1.1.1.8骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)谷氨酸通路的調(diào)控：在骨內(nèi)Glu信號(hào)通路中，TFRD可顯著提高代謝型受體mGluR5的表達(dá)[40]。骨碎補(bǔ)總黃酮干預(yù)后能夠降低大鼠血清谷氨酸脫羧酶水平、減少股骨GABA和GABABR1的表達(dá)及GABABR1 mRNA表達(dá)，從而防止骨質(zhì)疏松癥[41]。由此可以得出谷氨酸通路可能是骨碎補(bǔ)總黃酮防治骨質(zhì)疏松癥的通路之一。

1.1.2骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)雌激素水平的調(diào)控：Nakamura等[42]選擇性地敲除破骨細(xì)胞的雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)，發(fā)現(xiàn)可延長(zhǎng)破骨細(xì)胞的存活時(shí)間，減少其凋亡，降低骨小梁骨量，結(jié)果表明，雌激素和雌激素受體結(jié)合可影響細(xì)胞周期，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，抑制破骨細(xì)胞活性和分化，最終達(dá)到抑制破骨細(xì)胞骨吸收和預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用。骨碎補(bǔ)通過(guò)抑制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥骨轉(zhuǎn)換的增加，在維持正常小梁結(jié)構(gòu)和連接方面具有與雌激素相似的作用。Guo等[43]研究表明柚皮苷和柚皮素具有雙向調(diào)節(jié)雌激素和抗雌激素活性的作用。兩者在低濃度或缺乏內(nèi)源性雌激素時(shí)均表現(xiàn)出雌激素激動(dòng)劑活性。另一方面，它們?cè)诟邼舛然蜻^(guò)多的內(nèi)源性雌激素下也起雌激素拮抗劑的作用。它們主要通過(guò)選擇性結(jié)合雌激素受體β產(chǎn)生雌激素和抗雌激素作用，通過(guò)雌激素受體激動(dòng)機(jī)制防治骨質(zhì)疏松癥。

1.1.3骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)細(xì)胞的影響：Zhang等[44]在用骨碎補(bǔ)總黃酮體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮具有促進(jìn)增殖、分化、增加S期細(xì)胞、降低細(xì)胞凋亡率的作用，具有抗骨質(zhì)疏松活性。Zhang等[45]將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與不同濃度的柚皮苷溶液共培養(yǎng)，分析其成骨分化標(biāo)志和增殖能力。結(jié)果顯示適合比例的柚皮苷溶液可以促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自我增殖和向成骨細(xì)胞的分化。Li等[46]研究表明柚皮苷對(duì)骨密度、骨小梁厚度、骨礦化、力學(xué)強(qiáng)度均有明顯的增強(qiáng)作用，且呈劑量依賴性。柚皮苷下調(diào)BCL-2 mRNA表達(dá)水平，上調(diào)BAX、caspase-3和細(xì)胞色素C的表達(dá)，并顯著降低骨吸收面積。提示柚皮苷通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑的活性，促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡，預(yù)防OVX誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松。上述研究表明，骨碎補(bǔ)總黃酮通過(guò)對(duì)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及增殖和促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。

1.1.4骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)骨組織及血管的影響：Song等[47]研究表明，骨碎補(bǔ)總黃酮能顯著提高吊尾大鼠的骨密度和機(jī)械強(qiáng)度。骨碎補(bǔ)總黃酮可減弱吊尾治療后骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的增強(qiáng)。通過(guò)提高骨體積/組織體積、小梁數(shù)目來(lái)防止吊尾引起的骨小梁退化、骨小梁厚度減少及骨小梁的分離，表明了骨碎補(bǔ)總黃酮在治療廢用性骨質(zhì)疏松癥中的潛在應(yīng)用。上官文姬等[48]研究骨碎補(bǔ)總黃酮除了對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致的骨密度下降有明顯抑制作用外，還可以提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的痛閾。這可能與抑制大鼠血清中TNF-α、IL-1、PE2和5-HT的表達(dá)有關(guān)。何偉濤等[49]給去除雙側(cè)卵巢SD大鼠給予骨碎補(bǔ)總黃酮灌胃，結(jié)果顯示骨碎補(bǔ)總黃酮可抑制脛骨干骺端 cathepsin K mRNA 的表達(dá)，從而抑制OC的骨吸收，提高脛骨干的最大彎曲載荷。發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)作用于去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠，能提高其股骨的生物力學(xué)性能和骨密度，并改善骨小梁的顯微結(jié)構(gòu)。骨碎補(bǔ)總黃酮能夠顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠的骨體積分?jǐn)?shù)和骨小梁厚度、節(jié)點(diǎn)數(shù)，增加骨量，改善骨三維結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果表明，骨碎補(bǔ)總黃酮在提高骨密度、骨彎曲載荷等方面對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠有明顯的預(yù)防與治療的作用。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的特征在于骨髓中竇狀毛細(xì)血管和動(dòng)脈毛細(xì)血管的數(shù)量減少和骨灌注減少。因此，骨生成和血管生成在骨質(zhì)疏松形成和骨折愈合過(guò)程中相互耦合。Nan等[50]研究表明，柚皮苷通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF/VEGFR-2信號(hào)通路促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合。上官文姬等[51]也發(fā)現(xiàn)碎補(bǔ)總黃酮骨碎補(bǔ)總黃酮可刺激VEGF和FGF-2的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)局部血管的形成及成骨細(xì)胞的增殖、分化，促進(jìn)骨組織的鈣化，提高骨密度。

1.2 骨質(zhì)疏松癥的臨床研究

2017年由Zhang等[52]進(jìn)行的應(yīng)用骨碎補(bǔ)總黃酮治療骨質(zhì)疏松的Meta分析中，涉及846例患者，結(jié)果顯示骨碎補(bǔ)總黃酮在單獨(dú)或者聯(lián)合應(yīng)用在改善骨密度方面均優(yōu)于常規(guī)治療，無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)。樊繼波等[53]收集120例骨質(zhì)疏松癥患者，應(yīng)用離子導(dǎo)入骨碎補(bǔ)總黃酮治療骨質(zhì)疏松癥對(duì)于緩解骨質(zhì)疏松癥患者腰腿疼痛及提高腰椎骨密度有明顯的療效。周瑞明等[54]選取102例老年原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者，得出強(qiáng)骨膠囊(主要成分為骨碎補(bǔ)總黃酮)聯(lián)合鹿瓜多肽治療老年原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥具有較好的臨床療效，可有效緩解患者骨質(zhì)疏松引起的疼痛，增加骨密度和調(diào)節(jié)骨代謝指標(biāo)。綜上所述，骨碎補(bǔ)總黃酮在臨床中被廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥，與其他療法合用時(shí)，可能有增效作用。

2 在骨折愈合及骨缺損的研究概況

2.1 基礎(chǔ)研究

骨碎補(bǔ)總黃酮與續(xù)斷總皂苷配伍使用可以促進(jìn)骨痂的形成，增強(qiáng)骨強(qiáng)度，能夠顯著促進(jìn)骨折愈合[55]。骨碎補(bǔ)中總黃酮可以明顯降低紅細(xì)胞聚集指數(shù)，而且可明顯抑制大鼠血小板的聚集，從而降低血小板的黏附性，使大鼠血液粘稠度降低。由此說(shuō)明骨碎補(bǔ)總黃酮可以促進(jìn)骨愈合與改善血液循環(huán)有關(guān)[56]。在應(yīng)用可注射骨修復(fù)材料結(jié)合骨碎補(bǔ)總黃酮修復(fù)大鼠顱骨缺損時(shí)，發(fā)現(xiàn)結(jié)合骨碎補(bǔ)總黃酮可促進(jìn)新骨的形成，減少骨缺損的修復(fù)時(shí)間。就其具體機(jī)制，骨碎補(bǔ)總黃酮可明顯促進(jìn)在海藻酸基可注射骨修復(fù)材料上MC3T3-E1的增殖、分化及鈣化[57]。

2.2 臨床研究

2017年進(jìn)行的Meta分析包括3項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，共計(jì)510例患者。Meta分析結(jié)果顯示，強(qiáng)骨膠囊組患者比維生素D組患者的骨折愈合時(shí)間顯著降低，在用強(qiáng)骨膠囊治療骨質(zhì)疏松性骨折過(guò)程中，可以明顯縮短骨折的愈合時(shí)間，增強(qiáng)患者的骨密度[58]。高焱[59]對(duì)69例骨折延遲愈合和骨不連患者采用隨機(jī)對(duì)照研究，得出骨碎補(bǔ)總黃酮配合治療骨折延遲愈合和骨不連，不僅可以縮短骨折愈合時(shí)間，還使患者臨床癥狀消失快，而且無(wú)明顯不良反應(yīng)。馬樹(shù)強(qiáng)等[60]對(duì)65例原發(fā)骨質(zhì)疏松性橈骨遠(yuǎn)端骨折患者進(jìn)行臨床觀察研究，發(fā)現(xiàn)口服強(qiáng)骨膠囊能促進(jìn)骨痂提早形成，提高骨密度，增加骨痂生成的數(shù)量，減少外固定時(shí)間，改善骨結(jié)構(gòu)。以上臨床結(jié)果顯示，骨碎補(bǔ)總黃酮在治療骨折方面應(yīng)用廣泛，能促進(jìn)骨折的愈合，增加骨密度，預(yù)防骨折的再次發(fā)生。

3 在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的研究概況

3.1 基礎(chǔ)研究

龔曉健等[61]研究表明，骨碎補(bǔ)總黃酮可顯著降低Mankin法軟骨評(píng)分，減輕軟骨病變，提示骨碎補(bǔ)總黃酮可能是通過(guò)營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)軟骨而治療膝骨關(guān)節(jié)炎。骨碎補(bǔ)總黃酮可以抑制膝骨關(guān)節(jié)炎兔血清IL-1β、PGE2的表達(dá)，并降低關(guān)節(jié)液中NO量和關(guān)節(jié)軟骨中iNOS的表達(dá)水平，還可以調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1、MMP-3和TIMP-1表達(dá)的平衡，且隨著療程的延長(zhǎng)這種作用愈加明顯，具有明顯改善兔膝關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)，從而能夠達(dá)到預(yù)防、治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎的作用。骨碎補(bǔ)總黃酮可減輕關(guān)節(jié)軟骨退變程度及滑膜炎癥，其可能是通過(guò)降低IL-1β、MMP-3、MMP-13的表達(dá)，從而促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)[62-63]。骨碎補(bǔ)總黃酮可以使膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜及軟骨組織形態(tài)學(xué)改變明顯減輕，滑膜、軟骨組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-3表達(dá)減少[64]。

3.2 臨床研究

周榮魁等[65]對(duì)22例膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行自身前后對(duì)照研究，結(jié)果顯示服用骨碎補(bǔ)總黃酮后，膝關(guān)節(jié)癥狀得到有效改善，關(guān)節(jié)活動(dòng)功能明顯提高。而且用藥后患者血清中IL-1β和PGE2等炎癥指標(biāo)較用藥前下降。王躍輝等[66]采用浮針療法結(jié)合骨碎補(bǔ)總黃酮治療80例膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者，采用KSS評(píng)分評(píng)價(jià)治療效果，結(jié)果顯示療效顯著。

4 在股骨頭壞死的研究概況

4.1 基礎(chǔ)研究

骨碎補(bǔ)總黃酮通過(guò)改善激素性股骨頭壞死對(duì)血磷、血鈣的變化，升高血鈣，降低血磷，改善空骨陷窩率，提示骨碎補(bǔ)可以治療激素性股骨頭壞死[67]。此外，骨碎補(bǔ)總黃酮可以降低骨組織中堿性磷酸酶的活性，促進(jìn)鈣鹽沉積及骨的形成，防止骨質(zhì)丟失和骨結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而防治激素所引起的骨質(zhì)疏松[68]。

4.2 臨床研究

在對(duì)216例成人股骨頭缺血性壞死患者采用口服強(qiáng)骨膠囊治療的研究中發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)骨膠囊對(duì)股骨頭壞死療效顯著[69]。楊成[70]收集84例股骨頭缺血壞死患者，先對(duì)患者采用股骨頭鉆孔減壓技術(shù)治療，隨后分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，試驗(yàn)組口服強(qiáng)骨膠囊，對(duì)照組無(wú)其他處理，研究結(jié)果顯示試驗(yàn)組在疼痛評(píng)分、行走能力、生活能力以及關(guān)節(jié)活動(dòng)度評(píng)分等方面均明顯優(yōu)于對(duì)照組。骨碎補(bǔ)總黃酮在治療股骨頭壞死的過(guò)程中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，既可以應(yīng)用于股骨頭壞死的保守治療，又可以在術(shù)后發(fā)揮促進(jìn)機(jī)體回復(fù)的作用，值得臨床推廣。

5 骨碎補(bǔ)總黃酮在牽張成骨技術(shù)中的研究概況

牽張成骨技術(shù)在臨床中被廣泛應(yīng)用于骨缺損、骨畸形等疾病的治療中，提高牽張區(qū)域的成骨質(zhì)量，縮短牽張時(shí)間是該技術(shù)研究的重點(diǎn)。研究表明骨碎補(bǔ)總黃酮可促進(jìn)牽張區(qū)的骨痂形成、提高局部ALP和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)的含量，能有效促進(jìn)骨牽張中新骨的生成和成熟[71]。另外，有研究[72]表明，BMP-2等蛋白在牽張成骨等待期、牽張期及礦化期均有不同程度的表達(dá)升高，而礦化期的表達(dá)明顯減低，這也說(shuō)明本研究所顯示的牽張期加礦化期用藥在成骨質(zhì)量上無(wú)顯著性差異，可能與礦化期的BMP-2低表達(dá)有關(guān)，建議在牽張?jiān)缙?、全程?yīng)用骨碎補(bǔ)總黃酮，以提高牽張成骨的質(zhì)量及縮短成骨時(shí)間[73]。

6 骨碎補(bǔ)總黃酮在頸椎病的應(yīng)用前景

柚皮苷通過(guò)增加聚集蛋白聚糖、BMP-2和Sox6的表達(dá)，同時(shí)抑制TNF-α和MMP-3的表達(dá)，從而有效促進(jìn)變性髓核細(xì)胞的增殖，以及變性細(xì)胞的恢復(fù)，該研究提示柚皮苷可能是椎間盤(pán)退變的替代治療劑[74]。楊豪等[75]將頸椎病造模的日本大耳白兔隨機(jī)分為強(qiáng)骨膠囊組及對(duì)照組，給予治療后，取椎間盤(pán)及椎旁肌肉做病理學(xué)檢查，結(jié)果顯示強(qiáng)骨膠囊在改善全血黏度以及紅細(xì)胞聚集指數(shù)方面均明顯優(yōu)于對(duì)照組，頸椎X線片表現(xiàn)亦優(yōu)于對(duì)照組。

7 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)圍繞骨碎補(bǔ)總黃酮的基礎(chǔ)研究成為熱點(diǎn)。骨碎補(bǔ)總黃酮通過(guò)作用于相同的分子蛋白通路以治療不同骨科疾病，它可廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥、膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、骨折、股骨頭壞死等骨科疾病的治療，從微觀方面體現(xiàn)了中醫(yī)異病同治的特點(diǎn)。雖然骨碎補(bǔ)總黃酮在基礎(chǔ)研究及臨床治療方面應(yīng)用廣泛，但是其作用機(jī)理仍有待探究，不同分子通路之間的相互作用需要進(jìn)一步明確。另外，骨碎補(bǔ)總黃酮仍然屬于混合成分，其中柚皮苷的作用較為突出，但是并不能完全代替骨碎補(bǔ)總黃酮的作用，需要進(jìn)一步分離提取，更精準(zhǔn)地找到治療不同骨科疾病不同靶點(diǎn)的有效成分。骨碎補(bǔ)總黃酮在以往的研究中多關(guān)注在調(diào)整骨代謝方面，近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)它在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、降低血小板粘稠度以及減少炎癥因子等方面的優(yōu)勢(shì)，這一發(fā)現(xiàn)為組織工程學(xué)的應(yīng)用提供了可行方案，也為骨碎補(bǔ)總黃酮在不同疾病治療中的應(yīng)用提供了光明的前景。