枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究

饒犇 周榮華 閔勇 廖先清 劉芳 陳偉 張光陽(yáng)

摘要：為了得到枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基，應(yīng)用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法對(duì)影響枯草芽孢桿菌芽孢形成的關(guān)鍵因子進(jìn)行篩選，并進(jìn)一步采用響應(yīng)面分析法對(duì)影響芽孢產(chǎn)量的關(guān)鍵因素進(jìn)行研究。結(jié)果表明，影響枯草芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量的關(guān)鍵因素為玉米淀粉和豆粕的濃度。通過(guò)響應(yīng)面分析法的擬合和推算，得到玉米淀粉和豆粕濃度分別為2.48、4.90 g/mL時(shí)，此時(shí)模型預(yù)測(cè)發(fā)酵最佳產(chǎn)量為105億/mL，驗(yàn)證值為110億/mL，預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證值之間吻合較好，比優(yōu)化前實(shí)際產(chǎn)量（80億/mL）提高了37%。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）;Plackett-Burman設(shè)計(jì)法;響應(yīng)面分析法

中圖分類號(hào)：Q813.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）21-0127-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.033? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimizing on Fermentation Conditions of Bacillus subtilis by Response Surface Analysis Methodology

RAO Ben，ZHOU Rong-hua，MIN Yong，LIAO Xian-qing，LIU Fang，CHEN Wei，ZHANG Guang-yang

（National Biopesticide Engineering Technology Research Center，Wuhan 430064，China）

Abstract： In order to obtain the optimal medium composition for Bacillus subtilis production，the Plackett-Burman design method was used to evaluate the effects of five variables，and the optimum levels of key factors affecting spore production were conducted by response surface analysis methodology. The results showed that，the optimal values of the two parameters determined by response surface analysis methodology were corn starch 2.48 g/mL and corn-soybean 4.90 g/mL. The predicted spore production was 1.05×1010 CFU/mL，and the actual experimental result was 1.10×1010 CFU/mL，they were in agreement and it is 1.37 folds of the production before optimization （8×109 CFU/mL）.

Key words： Bacillus subtilis; Plackett-Burman design method; response surface analysis methodology

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種常用的微生物源生物農(nóng)藥?？莶菅挎邨U菌在防治水稻、小麥、花生、番茄、辣椒、大豆、玉米等作物的病害上有較好的效果，特別是針對(duì)小麥白粉病、赤霉病、紋枯病等病害的防治效果更佳，田間增產(chǎn)率達(dá)到了10%～50%[1-4]。

枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)能力以及氧氣競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì);定殖、繁殖速度很快，迅速抑制其他病原微生物生存，起到保護(hù)植物、確保植物健康生長(zhǎng)的作用。此外，枯草芽孢桿菌對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害、不污染環(huán)境、對(duì)作物安全;能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力;還能分泌促進(jìn)作物生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，使植株葉片濃綠肥厚，提高作物免疫力，增產(chǎn)提質(zhì)效果顯著，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生多種氨基酸，對(duì)作物有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的作用[5-9]。

枯草芽孢桿菌主要是以3種方式起作用，一是競(jìng)爭(zhēng)作用：拌種或灌根后，枯草芽孢桿菌能夠在作物周圍、根表面、根內(nèi)部以及通過(guò)植物導(dǎo)管傳導(dǎo)到地上部分而在作物根表、根內(nèi)、莖部、葉部等位點(diǎn)定殖和繁殖，保護(hù)作物根部不受病菌侵染和抑制作物體內(nèi)病原菌擴(kuò)散，從而達(dá)到防病作用。二是殺菌作用：枯草芽孢桿菌在作物根表、根內(nèi)、莖部、葉部等位點(diǎn)定殖和繁殖過(guò)程中，能產(chǎn)生脂肽類和蛋白類等殺菌物質(zhì)，從而殺死作物病原菌，達(dá)到防病效果。三是促生作用：枯草芽孢桿菌具有解磷作用，可以將土壤中無(wú)效磷轉(zhuǎn)化為能被作物吸收的有效磷，促進(jìn)作物根系及植株生長(zhǎng)，提高了作物的抗病性。

本研究以實(shí)驗(yàn)室自行分離得到的枯草芽孢桿菌NBF-809菌株為研究對(duì)象，對(duì)其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行Plackett—Buman試驗(yàn)，篩選顯著的影響因子，然后通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)，擬合數(shù)學(xué)模型方程，從而找到最優(yōu)條件組合，并對(duì)其試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，以期初步篩選比較合適的培養(yǎng)基配方。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

1.1.1? 菌種? 實(shí)驗(yàn)室自行分離，鑒定為枯草芽孢桿菌，編號(hào)為NBF-809。

1.1.2? 培養(yǎng)基? 固體培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基配方：淀粉10.0 g/L， 酵母浸粉5.0 g/L，磷酸氫二鈉0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基初始配方：淀粉15.0 g/L，豆粕20.0 g/L，磷酸二氫鉀 1.0 g/L，磷酸氫二鈉0.5 g/L，碳酸鈣0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.2 g/L。后期采用優(yōu)化后配方。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 發(fā)酵培養(yǎng)條件? 接種體積分?jǐn)?shù)2%，發(fā)酵溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵48 h。

1.2.2? Plackett-Burman試驗(yàn)? 采用Minitab的Plackett-Burman兩水平法對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行考察，篩選影響枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)的重要因素，確定最佳配方。設(shè)計(jì)水平和排列方式見(jiàn)表1。

1.2.3? 最陡爬坡試驗(yàn)? 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)得出的擬合方程安排最陡爬坡試驗(yàn)來(lái)確定因素取值中心點(diǎn)。擬合方程中各變量系數(shù)確定爬坡方向和變化步長(zhǎng)，另外步長(zhǎng)確定亦與試驗(yàn)條件相關(guān)。

1.2.4? 中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析? 對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)確定的因素，以最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理安排響應(yīng)面試驗(yàn)獲得重要因素的最佳配方水平。根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)結(jié)果來(lái)擬合數(shù)據(jù)，得到描述響應(yīng)值和自變量之間關(guān)系的二階模型，即：

其中，Y是產(chǎn)物能力測(cè)量值，b0是截距，bi是關(guān)鍵因素線性效果的系數(shù)，bii是關(guān)鍵因素的二次效應(yīng)系數(shù)，bij是關(guān)鍵因素間交互作用的系數(shù)。

根據(jù)擬合的數(shù)學(xué)模型以及方差分析的結(jié)果，可以評(píng)價(jià)每個(gè)因子及其交互作用對(duì)過(guò)程的影響程度，利用響應(yīng)面圖和等高線圖直觀地描繪其結(jié)果，同時(shí)利用擬合的數(shù)學(xué)方程求解最優(yōu)結(jié)果。

1.2.5? 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證試驗(yàn)? 用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中的菌絲重量。

2? 結(jié)果與分析

2.1? Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

據(jù)前期研究結(jié)果，確定以玉米淀粉和葡萄糖為碳源，以蛋白胨、玉米漿和豆粕為氮源，共5種因素（X1玉米淀粉、X2葡萄糖、X3蛋白胨、X4玉米漿、X5豆粕）一起進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由t檢驗(yàn)結(jié)果可知，玉米淀粉和豆粕對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和芽孢形成具有顯著影響，可信度在95%以上，且兩者對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)影響是正效應(yīng)。

由上述Plackett-Burman試驗(yàn)得到的回歸方程為Y=75+5.67X1+0.83X2+0.5X3-X4+11X5，方程擬合的相關(guān)性為R2=98.01%，表明此多項(xiàng)式方程很好地模擬和解釋了Plackett-Burman的試驗(yàn)結(jié)果。

2.2? 最速爬坡試驗(yàn)結(jié)果

找到對(duì)產(chǎn)物發(fā)酵影響最大的因素后，需要進(jìn)一步對(duì)這些因素進(jìn)行分析。最速上升法以前述Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到的一次方程為基礎(chǔ)，以相應(yīng)因素的系數(shù)比為基準(zhǔn)進(jìn)行步移，直到步移至最高點(diǎn)，然后以最高點(diǎn)附近的范圍作為響應(yīng)面優(yōu)化的相應(yīng)范圍。從Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到方程中玉米淀粉和豆粕的系數(shù)（X1=5.67，X2=11），可以得到這兩個(gè)因素步移的步長(zhǎng)比為1.00∶1.94，即當(dāng)玉米淀粉步移1.00個(gè)單位（0.20 g/L）時(shí)，豆粕也步移1.94個(gè)單位（0.38 g/L）。以Plackett-Burman設(shè)計(jì)中的中心點(diǎn)作為步移的起點(diǎn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。從試驗(yàn)結(jié)果（表2）可以看出，枯草芽孢桿菌芽孢的產(chǎn)量在步移進(jìn)行至第三步時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，之后芽孢產(chǎn)量開始下降。步移最高點(diǎn)時(shí)，玉米淀粉和豆粕的濃度分別為2.40、4.76 g/mL，這一點(diǎn)被用作下一步響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

2.3? 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)以上Plackett-Burman試驗(yàn)可知，影響枯草芽孢桿菌芽孢形成的2個(gè)重要因素分別是玉米淀粉和豆粕。根據(jù)中心優(yōu)化組合方法，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，共13組試驗(yàn)。

以玉米淀粉和豆粕為自變量，以枯草芽孢桿菌的芽孢數(shù)為響應(yīng)值，根據(jù)分析結(jié)果得到的二次多項(xiàng)式回歸方程為Y=103+9.505X1+3.013X2-5.5X12-6.5X22+3X1X2，Y為響應(yīng)值，X1為玉米淀粉，X2為豆粕。利用Minitab軟件響應(yīng)優(yōu)化器進(jìn)行計(jì)算可得，最大值處X1=2.48 g/mL，X2=4.90 g/mL，在此條件下理論預(yù)測(cè)得到的值為105億/mL。

2.4? 最佳培養(yǎng)基的驗(yàn)證

為了確定試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對(duì)上述優(yōu)化條件進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，共做了3組平行試驗(yàn)。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌的芽孢數(shù)為110億/mL，比預(yù)測(cè)值更好一些。

3? 小結(jié)

對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化研究，得到最佳培養(yǎng)基配方，玉米淀粉2.48 g/mL，葡萄糖2.00 g/mL，蛋白胨2.00 g/mL，玉米漿1.00 g/mL，豆粕4.90 g/mL。在此條件下，枯草芽孢桿菌的芽孢數(shù)理論最高產(chǎn)量為105億/mL，驗(yàn)證試驗(yàn)中最高值為110億/mL，與理論預(yù)測(cè)相符，比優(yōu)化前實(shí)際產(chǎn)量（80億/mL）提高了37%。

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