促凝劑及小分子表面活性劑對(duì)大豆分離蛋白乳狀液凝膠性質(zhì)的影響

王革新 ， 徐 捷 ， 何志勇 ， 曾茂茂 ， 秦 昉 ， 陳 潔 *，

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

大豆分離蛋白 （Soybean Protein Isolate，SPI）由于其具有良好的乳化性、填充性以及凝膠性等性質(zhì)，在食品中應(yīng)用廣泛。SPI在肉制品中一般以乳狀液性質(zhì)添加，其凝膠能力和持水性能對(duì)肉制品品質(zhì)影響巨大[1]。在豆制品等其他制品中，SPI凝膠性也是最受重視的性質(zhì)之一[2]。

SPI的凝膠影響因素已經(jīng)有相當(dāng)充分的研究，SPI可以通過(guò)熱誘導(dǎo)、加促凝劑、酶法凝膠和利用交聯(lián)劑凝膠等[3]，影響因素包括蛋白質(zhì)組成、溫度、pH、離子強(qiáng)度等[4-6]。然而關(guān)于SPI乳狀液的凝膠，相對(duì)研究較少。Chuan-He Tang等[7]研究顯示，在乳化后對(duì)SPI乳狀液進(jìn)行預(yù)熱處理，導(dǎo)致葡萄糖酸內(nèi)脂（GDL）和CaCl2誘導(dǎo)的凝膠強(qiáng)度增加，TGase誘導(dǎo)的凝膠強(qiáng)度減弱。而Xingyun Peng等[8]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)乳狀液進(jìn)行預(yù)熱處理會(huì)導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度減弱。Fu Liu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，乳狀液穩(wěn)定性好的凝膠強(qiáng)度也要高于穩(wěn)定性差的。上述研究顯示，促凝劑、SPI乳狀液的穩(wěn)定性、乳狀液中小分子表明活性劑的種類和用量、大豆蛋白質(zhì)本身的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)等都對(duì)SPI乳狀液凝膠性質(zhì)有影響，但影響SPI乳狀液凝膠的因素和機(jī)制尚未透徹。

作者以SPI乳狀液的凝膠性為主要研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定凝膠強(qiáng)度、持水性、彈性模量（G′）和粘性模量（G"）以及乳狀液凝膠的微觀結(jié)構(gòu)等，來(lái)確定促凝劑、乳狀液穩(wěn)定性以及小分子表面活性劑對(duì)SPI乳狀液凝膠性質(zhì)的影響，以期為大豆蛋白在豆制品、肉制品以及其他相關(guān)體系中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白：南通光合生物技術(shù)有限公司；金龍魚(yú)大豆油；蔗糖、硫酸鈣、大豆卵磷脂、吐溫20、二甲基硅油：均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（中國(guó)，上海）；葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯（GDL）：Sigma公司。

TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀：美國(guó)Beckman公司；MARAⅢ流變儀：Haaker公司；NS1001 L2K高壓均質(zhì)機(jī)：意大利尼魯索爾維公司；KMO-2basic磁力攪拌器：廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；S3500激光粒度分析儀：美國(guó)Microtrac公司；3K15離心機(jī)：Sigma公司；601循環(huán)水浴鍋：金壇市新航儀器廠；AL系列分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；JB5374-91電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SPI乳狀液制備 將SPI溶于水，制成8 g/dL的溶液，pH 7.0，加入4 g/dL的蔗糖，使用循環(huán)水浴鍋將大豆蛋白溶液加熱至90℃，保溫10 min后加入體積分?jǐn)?shù)4%的大豆油，經(jīng)過(guò)乳化、均質(zhì)（二步均質(zhì) 40～10 MPa），制作成 SPI乳狀液。

1.2.2 SPI乳狀液凝膠的制備 將樣品放入相同規(guī)格的容器（4.3 cm×4.3 cm×4.2 cm）中，在 80℃加熱30 min，之后將凝膠置于冰水浴，迅速冷卻至室溫，并在4℃冰箱放置過(guò)夜，用于凝膠性質(zhì)的測(cè)定。

1.2.3 不同促凝劑對(duì)SPI乳狀液凝膠性影響 取40 mL SPI乳狀液，加入0.175 g/dL CaSO4與0.25 g/dL GDL或者 0.35 g/dL CaSO4或者 0.5 g/dL GDL，按1.2.2制成凝膠，用于凝膠性質(zhì)測(cè)定。

1.2.4 SPI乳狀液穩(wěn)定性對(duì)凝膠性質(zhì)的影響 取1.2.1 乳化后的溶液分別進(jìn)行 20、30、40、50 MPa 均質(zhì)，分別測(cè)定0 h和24 h后的乳狀液粒徑。SPI乳狀液的粒徑分布使用激光粒度分析儀進(jìn)行表征，測(cè)量其體積平均粒徑（d43），每組樣品平行測(cè)定3次。

取40 mL SPI乳狀液，加入0.175 g/dL CaSO4與0.25 g/dL GDL，按1.2.2制成凝膠，用于凝膠性質(zhì)測(cè)定。

1.2.5 大豆卵磷脂、吐溫20對(duì)SPI乳狀液凝膠性質(zhì)影響 分別取體積分?jǐn)?shù)0.2%、0.4%、0.6%（v/v）的吐溫20，加入SPI溶液中，按1.2.1的方法制成SPI乳狀液。

分別取 0.2、0.3、0.4、0.5 g/dL 的大豆軟磷脂溶于4%、10%的大豆油中，再加入SPI溶液中，按1.2.1的方法制成SPI乳狀液。

取40 mL SPI乳狀液，加入0.175 g/dL CaSO4與0.25 g/dL GDL，按1.2.2制成凝膠，用于凝膠性質(zhì)測(cè)定。

1.2.6 SPI乳狀液凝膠強(qiáng)度測(cè)定 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定參考王嬋秋[9]的方法。將制備好的凝膠取出，室溫下平衡30 min，其凝膠強(qiáng)度通過(guò)質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定。測(cè)試條件為：探頭類型P/0.5，測(cè)前和測(cè)試速度均為1 mm/s，測(cè)后速度10 mm/s，觸發(fā)力5 g，觸發(fā)類型為自動(dòng)，下壓距離為10 cm，數(shù)據(jù)采集速率220 pps。凝膠強(qiáng)度用探頭下壓過(guò)程中的最大感應(yīng)力（單位g）來(lái)表示。每組樣品平行測(cè)定3次。

1.2.7 SPI乳狀液凝膠持水性測(cè)定 測(cè)定方法依據(jù)Xiong等[10]，略有改動(dòng)。將凝膠樣品放置到50 mL的離心管中，4℃、10 000 r/min離心10 min。每組樣品平行測(cè)定3次。持水性（WHC）公式如下：

WHC（%）=（Wt-Wr）/Wt×100%

式中，Wt為離心前凝膠體質(zhì)量 （g），Wr為離心后凝膠溢出水的質(zhì)量（g）。

1.2.8 SPI乳狀液凝膠的彈性模量（G′）與粘性模量（G"）測(cè)定 利用流變儀，對(duì)大豆分離蛋白乳狀液凝膠進(jìn)行溫度掃描。主要參數(shù)為：平板夾具直徑35 mm，最大應(yīng)變力為0.01，單頻頻率為0.1 Hz，間隙1 mm，以5℃/min的速率從25℃升至80℃，80℃保溫30 min，再以5℃/min的速率從80℃下降到25℃。測(cè)量過(guò)程中G′和G"隨溫度變化而變化。

1.2.9 SPI乳狀液凝膠的激光共聚焦測(cè)定 測(cè)定方法依據(jù)Chuan-He Tang等[7]，略有改動(dòng)。取5 mL的SPI乳狀液，加入體積分?jǐn)?shù)0.1%的羅蘭明B和體積分?jǐn)?shù)0.1%的尼羅紅，分別染蛋白質(zhì)和油相，混合均勻。加入促凝劑后取20 uL于單凹載玻片上，按1.2.2方法制成凝膠，用于測(cè)定。

激光共聚焦具體參數(shù)：使用40倍鏡，掃描模式像素：1 024×1 024，掃描速度：200 Hz，尼羅紅的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，羅蘭明B的激發(fā)波長(zhǎng)為552 nm。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)分析 所用數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值；采用Statistix軟件中LSD方法進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性差異分析，圖中標(biāo)有相同字母表示數(shù)據(jù)間存在不顯著差異（P＞0.05），標(biāo)有不同字母表示有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI乳狀液穩(wěn)定性對(duì)凝膠性質(zhì)的影響

從表1可以看出，隨著均質(zhì)的壓力增加，乳狀液粒徑逐漸減小。K.R.Kuhn等[11]研究高壓均質(zhì)壓力與均質(zhì)次數(shù)對(duì)乳清蛋白乳狀液穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明，在少于3次均質(zhì)時(shí)，乳狀液粒徑隨著壓力的增加而減小，然而在較高壓力與多次均質(zhì)下，乳狀液會(huì)形成高相對(duì)分子質(zhì)量聚集，使得乳化能力、穩(wěn)定性下降。本研究結(jié)論與其一致，而40 MPa均質(zhì)的乳狀液穩(wěn)定性最好。

表1 不同高壓均質(zhì)SPI乳狀液的平均粒徑Table 1 Average particle sizes of SPI emulsionsunder different high-pressure homogenization

從圖1-2可知，40 MPa均質(zhì)的乳狀液凝膠強(qiáng)度與持水性要優(yōu)于其他均質(zhì)條件的凝膠，這一結(jié)果與Fu Liu等[5]的研究結(jié)果一致，即乳狀液穩(wěn)定性好的其凝膠強(qiáng)度、持水性都要優(yōu)于穩(wěn)定性弱的。

圖1 均質(zhì)壓力對(duì)SPI乳狀液凝膠強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of high-pressure homogenization on gel hardness of SPI emulsion gels

圖2 均質(zhì)壓力對(duì)SPI乳狀液凝膠持水性的影響Fig.2 Effect of high-pressure homogenization on waterholding capacity of SPI emulsion gels

2.2 不同促凝劑對(duì)SPI乳狀液凝膠性質(zhì)的影響

由圖3-4可知，混合誘導(dǎo)的凝膠強(qiáng)度要明顯高于GDL和CaSO4凝膠強(qiáng)度?；旌夏z的持水性要高于CaSO4凝膠，GDL的持水性介于兩者之間，并沒(méi)有顯著差別?？赡苁怯捎贑aSO4誘導(dǎo)凝膠的主導(dǎo)作用力是疏水作用和靜電作用，氫鍵起輔助作用[12]，而GDL誘導(dǎo)凝膠促使體系pH降低，在酸化凝膠過(guò)程形成共價(jià)二硫鍵，使得三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[13]。但是也有文章報(bào)道過(guò)高濃度的GDL會(huì)引起過(guò)度酸化[14]，同時(shí)也會(huì)對(duì)風(fēng)味產(chǎn)生不好的影響。

圖3 促凝劑對(duì)SPI乳狀液凝膠強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of different coagulants on gelhardness of SPI emulsion gels

圖4 促凝劑對(duì)SPI乳狀液凝膠持水性的影響Fig.4 Effect of different coagulants on water-holding capacity of SPI emulsion gels

圖5為3種不同促凝方式的彈性模量（G′）（G"趨勢(shì)與G′一致，故未列出）。由圖5可知，混合凝膠的G′要略高于GDL的，與CaSO4促凝的有顯著的差異。一般定義G′值上升速率大于0.5 Pa/℃或者G′和G"值相交叉時(shí)的溫度為蛋白質(zhì)的凝膠形成溫度[15]。根據(jù)定義GDL、硫酸鈣、混合凝膠3種凝膠形成溫度分別為56、69、43℃，混合凝膠相對(duì)其他兩者降低了凝膠溫度。

3種不同凝膠方式的激光共聚焦圖見(jiàn)圖6（綠色為油滴）?？梢钥闯觯珻aSO4成膠體系的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對(duì)于GDL誘導(dǎo)和混合誘導(dǎo)的凝膠結(jié)構(gòu)而言，有較大的空隙，這也有與凝膠強(qiáng)度、持水性相對(duì)較弱符合。

圖5 促凝劑對(duì)SPI乳狀液凝膠彈性模量G′的影響Fig.5 Effect of different coagulants on storage modulus（G′） of SPI emulsion gels

2.3 小分子表面活性劑對(duì)SPI乳狀液凝膠性質(zhì)的影響

2.3.1 吐溫20對(duì)SPI乳狀液凝膠性質(zhì)的影響Ring等人[16]認(rèn)為乳狀液的凝膠取決于凝膠基質(zhì)和填充粒子的性質(zhì)，并且將填充粒子分為活性和非活性粒子兩大類。Dickinson等人[17]研究發(fā)現(xiàn)，活性填充粒子（乳清蛋白乳狀液）能增強(qiáng)凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而非活性填充粒子（吐溫20）會(huì)弱化凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。如圖7所示，SPI乳狀液的凝膠強(qiáng)度隨著吐溫20濃度的增加而增大，但是與空白組 （不添加吐溫20）相比，在添加量小于0.4%時(shí)，吐溫20的添加使得凝膠強(qiáng)度減弱，這與Dickinson等人研究結(jié)果一致，但在添加量大于0.4%后，吐溫對(duì)SPI乳狀液凝膠強(qiáng)度有增強(qiáng)的作用，這與Dickinson等人結(jié)果相反，可能原因是Dickinson研究時(shí)，吐溫20添加量始終保持在R=15（R為表面活性劑與蛋白質(zhì)的摩爾比）。

圖6 不同促凝劑誘導(dǎo)的SPI乳狀液凝膠的激光共聚焦圖Fig.6 CLSM images of SPI emulsion gels induced by different coagulants

圖7 吐溫20對(duì)SPI乳狀液凝膠強(qiáng)度的影響Fig.7 Effect of Tween 20 on gel hardness of SPI emulsion gels

圖8 吐溫20對(duì)SPI乳狀液凝膠持水率的影響Fig.8 Effect of Tween 20 on water-holding capacity of SPI emulsion gels

圖8為不同吐溫20添加量對(duì)SPI乳狀液凝膠持水性的影響，由圖可知，添加吐溫20導(dǎo)致持水性下降，且與體積分?jǐn)?shù)無(wú)關(guān)。Sven Kerstens等[18]研究吐溫20對(duì)β乳球蛋白熱凝膠時(shí)，發(fā)現(xiàn)吐溫20的添加導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)變得更粗糙。

2.3.2 大豆卵磷脂對(duì)SPI乳狀液凝膠性質(zhì)的影響如圖9所示，在不添加大豆軟磷脂時(shí)，SPI乳狀液凝膠強(qiáng)度隨著油體積分?jǐn)?shù)的增加而增加。Xin Gu等[19]研究不同種類油對(duì)SPI乳狀液凝膠的影響，無(wú)論是固態(tài)油還是液態(tài)油，凝膠強(qiáng)度都隨著油體積分?jǐn)?shù)的增加而增加。

在大豆油體積分?jǐn)?shù)較低（4%）的情況下，大豆卵磷脂對(duì)于SPI乳狀液凝膠強(qiáng)度沒(méi)有明顯作用，且與體積分?jǐn)?shù)也無(wú)關(guān)。但是在大豆油體積分?jǐn)?shù)相對(duì)高（10%）的情況下，大豆卵磷脂會(huì)降低SPI乳狀液的凝膠強(qiáng)度，也與體積分?jǐn)?shù)無(wú)關(guān)。根據(jù)Dickinson等[17]研究表明，可能是因?yàn)樵谟腕w積分?jǐn)?shù)比較低時(shí)，并沒(méi)有起活性填充作用，但是在油體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)，大豆油增強(qiáng)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而大豆軟磷脂的添加會(huì)促使部分油與大豆軟磷脂結(jié)合，減弱填充作用，因此在油體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，添加大豆軟磷脂導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度降低。

大豆卵磷脂對(duì)SPI乳狀液凝膠的持水性有增強(qiáng)的作用。但是在低油（4%）時(shí)，大豆卵磷脂的添加量高于0.4 g/dL才會(huì)有作用，在高油（10%）時(shí)，0.2 g/dL的大豆卵磷脂就有增強(qiáng)持水性的作用，見(jiàn)圖10。可能是由于大豆卵磷脂使得大豆分離蛋白與大豆油形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊致，增強(qiáng)了對(duì)水分的保持作用。

圖9 大豆卵磷脂對(duì)SPI乳狀液凝膠強(qiáng)度的影響Fig.9 Effect of soybean lecithin on gel hardness of SPI emulsion gels

圖10 大豆卵磷脂對(duì)SPI乳狀液凝膠持水性的影響Fig.10 Effect of soybean lecithin on water-holding capacity of SPI emulsion gels

圖11 大豆卵磷脂對(duì)SPI乳狀液凝膠的彈性模量（G′）的影響Fig.11 Effect of soybean lecithin on storage modulus（G′）changes of SPI emulsion gels

圖11為不同油-大豆卵磷脂含量對(duì)大豆分離蛋白彈性模量（G′）的影響。在不添加大豆軟磷脂的時(shí)，G′隨著油體積分?jǐn)?shù)的增加而增加。在低油（4%）時(shí)，大豆卵磷脂的添加能提高G′，但是與添加的質(zhì)量濃度無(wú)關(guān)。在高油（10%）時(shí)，大豆軟磷脂的添加使得G′有所降低，同樣與添加質(zhì)量濃度無(wú)關(guān)，這與凝膠強(qiáng)度的結(jié)果相符。根據(jù)凝膠形成溫度定義，含有大豆卵磷脂的大豆分離蛋白乳狀液成膠溫度都在30℃左右，相對(duì)于不含大豆卵磷脂而言，降低了成膠溫度。

由此可知，大豆分離蛋白凝膠強(qiáng)度與大豆油-大豆卵磷脂比例無(wú)關(guān)，無(wú)論是4%還是10%大豆油，只要體系中含有大豆卵磷脂，其凝膠強(qiáng)度基本無(wú)差異。 從激光共聚焦圖（圖 10）可得到證實(shí)，圖 b、c、e、f結(jié)構(gòu)相似（4%油與0.2、0.5 g/dL大豆卵磷脂，10%油與0.3、0.4 g/dL大豆卵磷脂與其他圖相似，故文中未列出）。K.H.Kim等[20]研究油滴粒徑對(duì)水包油乳狀液凝膠脆性的影響，結(jié)果表明凝膠脆性隨著油滴粒徑的增加而減小。而圖a能看到較大的油滴存在，而圖d油滴最小，這與凝膠強(qiáng)度結(jié)果相符。

圖12 不同大豆卵磷脂質(zhì)量濃度的SPI乳狀液凝膠的激光共聚焦圖Fig.12 CLSM images of SPI emulsion gel

3 結(jié) 語(yǔ)

SPI乳狀液穩(wěn)定性對(duì)凝膠強(qiáng)度有促進(jìn)作用，穩(wěn)定性好的乳狀液其凝膠強(qiáng)度、持水性都要高于穩(wěn)定性弱的。GDL和CaSO4混合促凝的SPI乳狀液的凝膠性質(zhì)要優(yōu)于CaSO4促凝的，與GDL促凝沒(méi)有顯著的差別，但是混合凝膠所需的成膠溫度為三者最低。在沒(méi)有添加小分子表面活性劑時(shí)，SPI乳狀液的凝膠強(qiáng)度、持水性都隨著油相比例的增加而增加。吐溫20在低添加量（體積分?jǐn)?shù)小于0.4%）時(shí)，凝膠強(qiáng)度減弱，在高添加量（體積分?jǐn)?shù)大于0.4%）時(shí)，增強(qiáng)其凝膠強(qiáng)度，但是無(wú)論添加量多少，都使得持水性下降。大豆卵磷脂在低油體積分?jǐn)?shù)（4%）時(shí)，對(duì)凝膠強(qiáng)度沒(méi)有顯著影響，在高油體積分?jǐn)?shù)（10%）時(shí)，使得凝膠強(qiáng)度降低。但是無(wú)論低油還是高油，大豆卵磷脂對(duì)于凝膠持水性有促進(jìn)作用。

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