落新婦苷對抑郁癥小鼠腦內(nèi)單胺遞質(zhì)多巴胺和5-羥色胺水平的影響

馬麗娟，趙 媛，關(guān)圓圓，賈 杰，劉巨源

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

近年來，隨著對天然黃酮類化合物研究的逐漸加深，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物在保護(hù)神經(jīng)功能領(lǐng)域中表現(xiàn)出巨大的研究價值與前景[1]。菝葜屬植物中含有豐富的落新婦苷(astilbin，AST)，屬于天然黃酮類化合物，抗抑郁中藥貫葉金絲桃中也檢測出該成分[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)，AST在利尿、抗氧化、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、緩解心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷、抗腫瘤等方面具有顯著的作用[3-6]。而對AST抗抑郁的療效報道甚少，本研究旨在探討AST對抑郁癥小鼠的抗抑郁作用，并分析其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物雄性成年C57BL/6J小鼠72只，體質(zhì)量18～22 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，飼養(yǎng)籠規(guī)格為320 cm×180 cm×160 cm，每籠喂養(yǎng)6只小鼠，飼養(yǎng)期間光照周期為12 h，光照時間為 07：00～19：00，溫度23 ℃，實(shí)驗(yàn)前正常飲食、水，進(jìn)行為期1周的環(huán)境適應(yīng)性訓(xùn)練。所有動物實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守國際動物實(shí)驗(yàn)保護(hù)準(zhǔn)則，盡量避免引起強(qiáng)烈的不適，減少實(shí)驗(yàn)誤差。

1.2主要試劑與儀器AST (>98%)購自美國Bellancom Chemistry公司。5-羥色胺(5-hydrox ytryptamine,5-HT)標(biāo)準(zhǔn)品、丙米嗪(imipramine，IMI)、多巴胺(dopamine,DA)標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司。Prostar 210高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)儀購自美國Varian 公司；TGL-16G-A高速冷凍離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；-40 ℃ DW-FL270超低恒溫冷凍儲存箱購自中科美菱低溫科技公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動物分組與處理AST先用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，作為本次AST標(biāo)準(zhǔn)品的儲備液，使用前儲備液均采用醫(yī)用生理鹽水注射液稀釋至所需濃度，濃度控制為本實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)濃度。采用隨機(jī)數(shù)字表法將動物分成6組，每組12只。對照組小鼠不給予刺激，常規(guī)飼養(yǎng)，其他5組小鼠每天給予慢性不可預(yù)見性應(yīng)激(chronic unexpected mild stress,CUMS)，連續(xù)3周，制備抑郁癥小鼠模型，具體包括：(1)禁食24 h；(2)禁水24 h；(3)傾斜鼠籠30° 24 h；(4) 小鼠尾根部1 cm夾尾1 min；(5) 采用9.5 cm×3 cm固定器束縛2 h；(6) 17 ℃冷水連續(xù)浸泡5 min；(7) 40 ℃熱水浸泡5 min；(8)晝夜交替。連續(xù)2 d不采用同種刺激，保證動物對刺激無預(yù)料性[7]。模型組小鼠每天按10 mL·kg-1的劑量腹腔注射生理鹽水且進(jìn)行CUMS刺激；IMI組小鼠每天按10 mL·kg-1的劑量腹腔注射IMI，同時進(jìn)行CUMS刺激；AST低、中、高劑量組小鼠每天分別按10、20、40 mL·kg-1的劑量腹腔注射AST，同時進(jìn)行CUMS刺激；連續(xù)3周。IMI、AST腹腔注射的給藥濃度參照文獻(xiàn)[8-9]。干預(yù)期間，各組小鼠每天給予敞箱實(shí)驗(yàn)(open field test,OFT)，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test,FST)，小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspension test,TST)，連續(xù)3周。

1.3.2OFT整個實(shí)驗(yàn)操作每天完成于早上 8：30～11：30，全程保證安靜，且通過盲法測試。參照XIONG等[10]的研究并改進(jìn)后進(jìn)行敞箱實(shí)驗(yàn)。本次均為規(guī)格相同的木箱，規(guī)格為1 000 mm ×1 000 mm×400 mm，底部為25個正方形，上蓋黑色木板，確保全程處于黑暗條件，并采用紅色燈泡(50 W)照明，木箱中央方格內(nèi)分別放入實(shí)驗(yàn)小鼠，保證活動自如。詳細(xì)觀察小鼠5 min內(nèi)三爪以上跨入方格的水平運(yùn)動次數(shù)及兩前肢脫離地面超過 1 cm 的垂直運(yùn)動次數(shù)。

1.3.3FST每天注射藥物30 min后，將所有實(shí)驗(yàn)小鼠逐個放入直徑20 cm，高15 cm玻璃圓筒內(nèi)，水溫24 ℃，強(qiáng)迫浸泡 6 min，記錄小鼠2 min后持續(xù)不動時間。判斷標(biāo)準(zhǔn)：小鼠僅將頭部露出水面，漂浮狀態(tài)(四肢靜止)，或動作緩慢保證不溺水為不動狀態(tài)。2次實(shí)驗(yàn)期間及時換水，保證水溫適當(dāng)，測試之后每只小鼠均用干毛巾擦干，原籠返回。

1.3.4TST實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[11]。所有操作均在暗箱內(nèi)進(jìn)行，將小鼠頭部朝下，保持倒立，將其距離尾巴尖端1 cm處通過膠帶固定于距地平面 35 cm 的橫桿，維持6 min，適應(yīng)1 min后記錄各組小鼠的持續(xù)不動時間。判斷標(biāo)準(zhǔn)：小鼠停止掙扎活動，除胡須輕微的晃動以及呼吸運(yùn)動外，全程呈絕望狀態(tài)[12]。

1.3.5SPT實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[13]。各組小鼠在實(shí)驗(yàn)前均單籠喂養(yǎng)，正常進(jìn)食2 d，自由飲水，均給予0.03 mol·L-1蔗糖溶液及普通純凈水，飼喂期間每天2次調(diào)整水瓶位置，防止小鼠習(xí)慣性采食。然后各組小鼠均禁食、水24 h。次日上午09：00將0.03 mol·L-1蔗糖溶液100 mL 及相同規(guī)格的純凈水瓶放回原籠，所有小鼠自由飲水1 h后取下，測量2瓶液體的消耗量，糖水偏嗜度計(jì)算方法：糖水偏嗜度(%)=糖水消耗/總液體消耗×100%。

1.3.6HPLC法測各組小鼠前額葉皮層中5-HT和DA的水平參照MOSTALAC-PRECIADO等[14]方法，樣品溶液置于-80 ℃的恒溫冰箱保存，頸椎脫臼法處死小鼠取出前額葉皮層并測質(zhì)量，添加為前額葉皮層腦質(zhì)量3倍的0.1 mol·L-1高氯酸溶液，在冰上研磨成勻漿，將其勻漿提取液0 ℃ 10 000 r·min-1離心30 min，通過0.45 μm的水系濾膜對上清液過濾。標(biāo)準(zhǔn)溶液：配制含有高氯酸溶液(0.1 mol·L-1)及偏重亞硫酸鈉(0.004 mol·L-1)的DA和5-HT的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。采用等濃度梯度方法配制標(biāo)準(zhǔn)品，DA標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5 mg·L-1；5-HT標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 2 mg·L-1。將5-HT和DA標(biāo)準(zhǔn)溶液按濃度由高到低依次混合取樣，檢測5-HT (0.5 mg·L-1)和DA (1.0 mg·L-1)混合標(biāo)準(zhǔn)的HPLC色譜圖。各組小鼠樣品依次進(jìn)樣，檢測各組小鼠前額葉皮層HPLC色譜圖。進(jìn)樣量：體積：20 μL，色譜柱：4.6 mm × 250 mm，5 μm的Varian C18柱，流動相：含1-辛烷磺酸鈉(0.005 mol·L-1)的磷酸二氫鈉(0.02 mol·L-1)溶液，采用pH 3.3的磷酸，再加上甲醇(34%)與純凈水按152的比例配制成的溶液，過濾、脫氣用有機(jī)系濾膜厚度為0.45 μm，流速設(shè)置為1 mL·min-1，進(jìn)行梯度洗脫。熒光檢測器發(fā)射波長λem為360 nm、激發(fā)波長λex為280 nm，柱溫保持26 ℃。最后以峰面積Y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣濃度X為橫坐標(biāo)(mg·L-1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用線性回歸分析計(jì)算各組小鼠前額葉皮層中DA和5-HT水平。

2 結(jié)果

2.1AST對小鼠自發(fā)活動的影響結(jié)果見表1。持續(xù)3周給藥后，對照組、模型組、IMI組及AST低、中、高劑量組小鼠的水平運(yùn)動次數(shù)和垂直運(yùn)動次數(shù)兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。

表1AST對敞箱實(shí)驗(yàn)中小鼠自主活動的影響

2.2各組小鼠FST、TST及SPT結(jié)果比較結(jié)果見表2。與對照組比較，模型組小鼠FST和TST持續(xù)不動時間顯著增加，糖水偏嗜度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組小鼠，AST低、中、高劑量組和IMI組小鼠FST和TST持續(xù)不動時間顯著減少，糖水偏嗜度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AST低、中、高劑量組小鼠FST和TST持續(xù)不動時間及糖水偏嗜度兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AST低、中、高劑量組小鼠FST和TST持續(xù)不動時間及糖水偏嗜度與IMI組和對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2各組小鼠FST和TST持續(xù)不動時間及糖水偏嗜度比較

注：與對照組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.01。

2.3各組小鼠前額葉皮層5-HT及DA水平比較結(jié)果見表3。與對照組比較，模型組小鼠前額葉皮層DA和5-HT水平顯著降低(P<0.01)。AST低、中、高劑量組和IMI組小鼠前額葉皮層DA水平均顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。AST中、高劑量組和IMI組小鼠前額葉皮層5-HT水平均顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，AST低劑量組小鼠前額葉皮層5-HT水平與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3各組小鼠前額葉皮層內(nèi)DA和5-HT水平比較

注：與對照組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.01。

3 討論

醫(yī)學(xué)研究中嚙齒類動物CUMS抑郁模型運(yùn)用廣泛，這一模型與人類抑郁癥患者主要癥狀具有極高的相似性。本實(shí)驗(yàn)建立抑郁癥小鼠模型，連續(xù)干預(yù)3周，結(jié)果表明，AST可拮抗慢性應(yīng)激所致的小鼠FST、TST持續(xù)不動時間延長和糖水偏嗜度的降低，作用與IMI相似。

動物實(shí)驗(yàn)中，評價動物對新環(huán)境的探索能力以及自主活動程度常用敞箱實(shí)驗(yàn)，對動物的好奇心與興奮性研究具有十分重要的作用。實(shí)驗(yàn)表明，部分中樞興奮藥對動物在敞箱實(shí)驗(yàn)中垂直移動、水平移動具有增強(qiáng)作用，也降低強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動的時間，但這類藥物對抑郁癥無明顯療效[15]。為了減少實(shí)驗(yàn)的干擾因素，本研究敞箱實(shí)驗(yàn)測試還包含了對照組小鼠，結(jié)果顯示，AST各劑量組和IMI組小鼠水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動次數(shù)與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)AST對小鼠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中未表現(xiàn)出興奮作用。

FST和TST常作為評價藥物潛在抗抑郁活性的經(jīng)典行為學(xué)指標(biāo)[16-17]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠在FST和TST實(shí)驗(yàn)中的持續(xù)不動時間明顯延長，這表明動物模型建立成功。而對抑郁癥模型小鼠為期3周干預(yù)發(fā)現(xiàn)，在FST、TST實(shí)驗(yàn)中，AST能降低抑郁癥小鼠持續(xù)不動時間，作用與IMI作用相似，這更加證明了AST具有抗抑郁活性。

小鼠經(jīng)CUMS誘導(dǎo)能出現(xiàn)與人類相似的快感缺失癥狀[18]。抑郁癥模型小鼠連續(xù)給藥3周后各組小鼠的快感缺失狀態(tài)可利用SPT檢測，具有嚴(yán)密的科學(xué)根據(jù)，是學(xué)術(shù)界認(rèn)可的衡量快感缺失的指標(biāo)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)CUMS誘導(dǎo)對糖水的偏嗜度降低，與以往研究結(jié)果[19]保持一致，而由低到高劑量注射AST后對這一癥狀具有逆轉(zhuǎn)作用，但劑量依賴關(guān)系尚不明顯，因此，還需進(jìn)一步研究探討。小鼠降低了對糖水的偏嗜度也能證明小鼠經(jīng)CUMS誘導(dǎo)能出現(xiàn)抑郁樣癥狀，進(jìn)一步證實(shí)了AST具有潛在的抗抑郁效應(yīng)。

有研究認(rèn)為，調(diào)控突觸間單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是多種抗抑郁藥的基本機(jī)制，包括臨床常用的氟西汀及IMI等[20]。近來有報道認(rèn)為，增加突觸內(nèi)DA和5-HT水平可通過黃酮類化合物抑制單胺氧化酶的活性以及生物胺的重吸收完成，以達(dá)到發(fā)揮抗抑郁作用的目的[21-22]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，AST低、中、高劑量組小鼠前額葉皮層DA水平顯著升高；且20、40 mg·kg-1AST亦可提高小鼠前額葉皮層5-HT水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，抑郁癥小鼠使用AST能增加前額葉皮層中DA和5-HT水平，但其影響5-HT、DA等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生抗抑郁作用的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚。

綜上所述，AST對抑郁癥模型小鼠具有顯著的抗抑郁作用，上調(diào)前額葉皮層內(nèi)DA和5-HT水平可能是其作用機(jī)制之一。

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