rL-RVG通過拮抗α7煙堿型乙酰膽堿受體影響胃癌細(xì)胞凋亡及增殖

尹超云，嚴(yán)玉蘭，章安偉，張烜烽，步雪峰

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇鎮(zhèn)江212002；3.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江212002）

乙酰膽堿受體在很多腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，如非小細(xì)胞肺癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌等[1]。研究發(fā)現(xiàn)α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7-nAChR）的表達(dá)與激活對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移[2]，血管生成[3]和炎癥反應(yīng)[4]具有重要影響。尼古丁等藥物可通過激活乙酰膽堿受體促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[5]；5-氟尿嘧啶可抑制α7-nAChR表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）是一種以感染禽類為特點(diǎn)的雞瘟病毒[7]，屬于禽副黏病毒科的副黏病毒Ⅰ型[8]。有研究發(fā)現(xiàn)NDV病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腺病毒、狂犬病毒等多種病毒具有溶瘤作用[9－10]。煙堿型乙酰膽堿受體可與狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RVG）結(jié)合[11]，且 RVG的 G蛋白具有與銀環(huán)蛇毒相近的煙堿型乙酰膽堿受體阻斷作用[12]。重組 LaSota株新城疫病毒（recombinant La-Sota strain NDV expressing the rabies virus glycoprotein，rL-RVG）可以穩(wěn)定表達(dá) RVG[13]，關(guān)于 rL-RVG是否可以通過拮抗乙酰膽堿途徑影響胃癌HGC細(xì)胞凋亡及增殖尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用rL-RVG感染HGC細(xì)胞，旨在探索細(xì)胞凋亡及增殖與乙酰膽堿途徑之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（HyClone公司）。人胃癌HGC細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心提供，NDV病毒株及rLRVG病毒株由哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)。Tris緩沖液（0.05 mol/L TBS，pH＝7.35，自制）；羊抗兔 α7-nAChR抗體（南京厚載公司）；羊抗兔pro-caspase 3抗體（ImmunoWay公司）。核熒光染料（Hoechst 33342），Triton X-100、MTT試劑盒（Sigma公司）。HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG（上?？禐槭兰o(jì)公司）。α7-nAChR抑制劑甲基牛扁亭堿為Santa Cruz公司產(chǎn)品，α7-nAChR激動(dòng)劑溴化乙酰膽堿（Sigma公司）；Alexa Flour 488標(biāo)記羊抗鼠IgG、Cy3標(biāo)記羊抗鼠IgG（美國(guó)KLP公司），DFC300 FX熒光顯微鏡（德國(guó)萊卡公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒感染

將NDV、rL-RVG病毒原液用未加血清的1640培養(yǎng)基稀釋1 000倍。用含10%滅活胎牛血清的1640培養(yǎng)基在37℃及5%CO2的飽和濕度下培養(yǎng)HGC細(xì)胞，每隔24 h更換含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中覆蓋率達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳3代后將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞達(dá)到50%～70%融合時(shí)，將其隨機(jī)分為rL-RVG組、NDV組及PBS組，分別加入上述稀釋的rL-RVG、NDV病毒液及PBS 2 mL，培養(yǎng)1 h，再更換含10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 MTT檢測(cè)rL-RVG對(duì)HGC細(xì)胞增殖的影響

用無血清1640培養(yǎng)基分別將rL-RVG及NDV病毒原液稀釋至以下濃度：10－1、10－2、10－3、10－4、10－5mmol/L。將HGC細(xì)胞接種于96孔板（5×104/mL），每孔100μL，培養(yǎng)過夜，次日換含20 mL/L胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在rL-RVG組和NDV組分別加入病毒液，PBS組加入PBS；每組設(shè)5個(gè)平行孔，1640完全培養(yǎng)基為調(diào)零孔。培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μLMTT，培養(yǎng)4 h，每孔加入150μL二甲基亞砜溶解，酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定光密度（D）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞活力值＝（實(shí)驗(yàn)組平均D值/對(duì)照組平均D值）×100%。

1.4 免疫熒光染色觀察HGC細(xì)胞中α7-nAChR的表達(dá)

取rL-RVG、NDV、PBS 3組細(xì)胞，分別使用4%低聚甲醛在室溫下固定20 min，PBS洗3次，PBS稀釋的0.5%Triton X100室溫下處理細(xì)胞30 min，PBS洗3遍，5%的BSA封閉1 h，加入PBS溶解的α7-nAChR抗體（1∶100），4℃孵育過夜。洗3次，5 min/次；Cy3標(biāo)記的兔二抗（1∶200）染色1 h，PBS洗3次，5 min/次；Hoechst 33342染色細(xì)胞核 10 min，PBS洗3次后再置于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 rL-RVG感染后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

將HGC細(xì)胞接種至6孔板培養(yǎng)，分為rL-RVG＋α7-nAChR抑制劑組、NDV＋α7-nAChR抑制劑組、PBS＋α7-nAChR抑制劑組，rL-RVG組、NDV組、PBS組，rL-RVG＋α7-nAChR激動(dòng)劑組、NDV＋α7-nAChR激動(dòng)劑組、PBS＋α7-nAChR激動(dòng)劑組。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～70%密度時(shí)，各抑制劑組加入10－3mmol/L的甲基牛扁亭堿預(yù)處理4 h，各激動(dòng)劑組加入10－3mmol/L的溴化乙酰膽堿預(yù)處理4 h；棄培養(yǎng)基，PBS洗 2遍；然后 rL-RVG組、rL-RVG＋α7-nAChR抑制劑組、rL-RVG＋α7-nAChR激動(dòng)劑組感染rL-RVG；NDV組、NDV＋α7-nAChR抑制劑組、NDV＋α7-nAChR激動(dòng)劑組感染NDV，PBS組、PBS＋α7-nAChR抑制劑組、PBS＋α7-nAChR激動(dòng)劑組直接用PBS處理。倒置顯微鏡下觀察受病毒感染的細(xì)胞形態(tài)。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) RVG、NDV、pro-caspase 3、bax、bcl-2、α7-nAChR蛋白的相對(duì)表達(dá)

將方法“1.2”及“1.5”中經(jīng)過處理的 HGC細(xì)胞種植于6孔板上（5×104個(gè)/mL），培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞蛋白，后經(jīng)SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入小鼠抗RVG抗體（1∶300）、雞抗NDV抗體（1∶300）、羊抗兔 pro-caspase 3抗體（1∶1 000）、羊抗兔 α7-nAChR抗體（1∶500）、羊抗兔 bax抗體（1∶400）、羊抗兔 bcl-2抗體（1∶400）、羊抗鼠β-肌動(dòng)蛋白抗體（1∶5 000），4℃孵育過夜；TBST洗3次，加羊抗鼠或羊抗兔 HRP標(biāo)記 IgG（1∶3 000）室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，ECL發(fā)光劑發(fā)光顯色，在Typhoon 9400掃描儀上掃描記錄，用LANE.1D軟件（北京賽制公司）進(jìn)行條帶灰度值結(jié)果分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rL-RVG對(duì) HGC細(xì)胞RVG、NDV、pro-caspase 3與α7-nAChR蛋白表達(dá)的影響

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與PBS組及NDV組比較，RVG蛋白在rL-RVG組中顯著性表達(dá)（P均＜0.01）；與 PBS組比較，NDV、pro-caspase 3和 α7-nAChR蛋白在rL-RVG組及NDV組中的表達(dá)均明顯升高（P均＜0.01）；rL-RVG組與NDV組NDV蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；rL-RVG組α7-nAChR、pro-caspase3蛋白表達(dá)明顯高于NDV組（P均＜0.01）。見圖1。

2.2 rL-RVG對(duì)HGC細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度NDV和rL-RVG作用HGC細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力值隨濃度增加而降低。與PBS對(duì)照組相比，各稀釋濃度rL-RVG及NDV對(duì)細(xì)胞的增殖均有明顯抑制作用（P＜0.05）。見圖2。

圖1 HGC細(xì)胞感染rL-RVG后RVG、NDV、pro-caspase 3和α7-nAChR蛋白的表達(dá)

圖2 不同濃度NDV、rL-RVG病毒對(duì)胃癌HGC細(xì)胞增殖的影響

2.3 rL-RVG感染后HGC細(xì)胞α7-nAChR蛋白的熒光表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果顯示，rL-RVG組HGC細(xì)胞α7-nAChR的表達(dá)明顯高于NDV組及PBS組，NDV組高于PBS組（圖3）。

2.4 rL-RVG感染后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化

各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理24 h后倒置顯微鏡下可見，細(xì)胞逐漸由貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)為懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞膜皺縮，凋亡增多。rL-RVG組較NDV明顯；α7-nAChR抑制劑處理過的 NDV組、PBS組分別較NDV組、PBS組明顯，但rL-RVG＋α7-nAChR抑制劑組與rL-RVG組差別不大；經(jīng)α7-nAChR激動(dòng)劑處理過的rL-RVG組、NDV組和PBS組分別較rL-RVG組、NDV組和PBS組細(xì)胞膜明顯皺縮，凋亡狀態(tài)明顯減弱。見圖4。

圖3 rL-RVG感染后HGC細(xì)胞α7-nAChR蛋白表達(dá)（熒光顯微鏡×1 000）

2.5 rL-RVG感染后 HGC細(xì)胞 pro-caspase 3、bax、bcl-2的相對(duì)表達(dá)量

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，rL-RVG組和NDV組pro-caspase 3、bax表達(dá)明顯高于 PBS組（P均＜0.01）。

pro-caspase3、bax蛋白在 NDV＋α7-nAChR抑制劑組、PBS＋α7-nAChR抑制劑組分別較NDV組、PBS組明顯提高（P均＜0.01），在 rL-RVG＋α7-nAChR抑制劑組與rL-RVG組間無明顯差異（P＞0.05）；bcl-2蛋白在NDV＋α7-nAChR抑制劑組、PBS＋α7-nAChR抑制劑組表達(dá)量分別明顯低于NDV組、PBS組（P均＜0.01），在rL-RVG＋α7-nAChR抑制劑組與rL-RVG組間無明顯差異（P＞0.05）。

圖4 rL-RVG感染后HGC細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化（倒置顯微鏡×1 000）

pro-caspase3、bax蛋白在 rL-RVG＋α7-nAChR激動(dòng)劑組表達(dá)顯著低于rL-RVG組（P＜0.05或P＜0.01），而NDV＋α7-nAChR激動(dòng)劑組的表達(dá)量明顯低于NDV組（P均＜0.01）。bcl-2蛋白在 rL-RVG＋α7-nAChR激動(dòng)劑組表達(dá)顯著低于rL-RVG組（P＜0.05），而 NDV＋α7-nAChR激動(dòng)劑組的表達(dá)量明顯高于NDV組（P＜0.01）。見圖5。

3 討論

胃癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)α7-nAChR，α7-nAChR參與腫瘤的侵襲、增殖和轉(zhuǎn)移[4]。rL-RVG穩(wěn)定表達(dá)的RVG可與煙堿型乙酰膽堿受體結(jié)合，對(duì)其具有阻斷作用[11－13]，所以我們猜測(cè)rL-RVG可以通過拮抗α7-nAChR受體促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡及抑制胃癌細(xì)胞增殖。

本研究MTT試驗(yàn)顯示，當(dāng)病毒濃度接近于10－5mmol/L時(shí)，rL-RVG、NDV組的細(xì)胞活力明顯受到抑制。同時(shí)免疫熒光及蛋白質(zhì)印跡證實(shí)胃癌細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)α7-nAChR，加入rL-RVG病毒后α7-nAChR蛋白表達(dá)明顯提高。α7-nAChR表達(dá)升高應(yīng)該會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[6]，但凋亡蛋白及光鏡下形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示rL-RVG作用后HGC細(xì)胞凋亡增多。rL-RVG感染HGC細(xì)胞產(chǎn)生的RVG的G蛋白競(jìng)爭(zhēng)性抑制了α7-nAChR，進(jìn)一步促進(jìn)HGC細(xì)胞凋亡，從α7-nAChR免疫熒光及蛋白質(zhì)印跡可以看出，RVG的G蛋白對(duì)α7-nAChR有拮抗作用，引起α7-nAChR反饋性上調(diào)。而且蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，α7-nAChR抑制劑作用HGC細(xì)胞24 h后，pro-caspase 3及bax表達(dá)量與rL-RVG組無明顯差異，說明rL-RVG本身產(chǎn)生的RVG產(chǎn)生同樣的效果。但NDV及PBS組加入抑制劑后其表達(dá)量增多，證明了α7-nAChR抑制劑可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，這與本課題組的前期實(shí)驗(yàn)相符[10]。

同時(shí)，α7-nAChR激動(dòng)劑加入rL-RVG組和NDV組后pro-caspase 3及bax蛋白表達(dá)受到明顯抑制，進(jìn)一步證實(shí)rL-RVG感染HGC通過拮抗α7-nAChR途徑促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡和抑制其增殖。

本實(shí)驗(yàn)是對(duì)rL-RVG殺腫瘤作用理論的補(bǔ)充，為rL-RVG在臨床上治療腫瘤晚期患者提供了一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。關(guān)于rL-RVG通過煙堿型乙酰膽堿受體作用哪些途徑導(dǎo)致HGC細(xì)胞凋亡還需進(jìn)一步探索。

圖5 rL-RVG感染后HGC細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

[1]Alexander DJ.Gordon Memorial Lecture.Newcastle disease[J].Br Poult Sci，2001，42（1）：5－22.

[2]Mayo MA.A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV[J].Arch Virol，2002，147（8）：1655－1663.

[3]Jin CY，Park C，Hwang HJ，et al.Naringenin up-regulates the expression of death receptor 5 and enhances TRAIL-induced apoptosis in human lung cancer A549 cells[J].Mol Nutr Food Res，2011，55（2）：300－309.

[4]Zhao J，Lu Y，Shen HM，et al.Targeting p53 as a therapeutic strategy in sensitizing TRAIL-induced apoptosis in cancer cells[J].Cancer Lett，2012，314（1）：8－23.

[5]Tu CC，Huang CY，Cheng WL，et al.Silencing A7-nAChR levels increases the sensitivity of gastric cancer cells to ixabepilone treatment[J].Tumour Biol，2016，37（7）：9493－9501.

[6]Dasgupta P，Rizwani W，Pillai S，et al.Nicotine induces cell proliferation，invasion and epithelial-mesenchymal transition in a variety of human cancer cell lines[J].Int JCancer，2009，124（1）：36－45.

[7]Heeschen C，Weis M，Aicher A，et al.A novel angiogenic pathway mediated by non-neuronal nicotinic acetylcholine receptors[J].JClin Invest，2002，110（4）：527－536.

[8]Pavlov VA，Wang H，Czura CJ，et al.The cholinergic anti-inflammatory pathway：a missing link in neuroimmunomodulation.[J].Mol Med，2003，9（5－8）：125－134.

[9]Ge J，Wang X，Tao L，et al.Newcastle disease virus-vectored rabies vaccine is safe，highly immunogenic，and provides long-lasting protection in dogs and cats[J].J Virol，2011，85（16）：8241－8252.

[10]趙英海，嚴(yán)玉蘭，李米，等.重組新城疫病毒 rL-RVG誘導(dǎo)人胃腺癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2016，26（3）：199－203.

[11]Gastka M，Horvath J，Lentz TL.Rabies virus binding to the nicotinic acetylcholine receptorαsubunit demonstrated by virus overlay protein binding assay[J].J Gen Virol，1996，77（Pt10）：2437－2440.

[12]Mai H，MayWS，Gao F，etal.A functional role for nicotine in Bcl-2 phosphorylation and supression of apoptosis[J].JBiol Chem，2003，278（3）：1886－1891.

[13]Lentz TL，Burrage TG，Smith AL，et al.Is the acetylcholine receptor a rabies virus receptor？[J].Science，1982，215（4529）：182－184.