水通道蛋白4抗體的研究進(jìn)展

李 嬌 商秀麗

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110001

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是廣泛存在于動(dòng)植物及低等生物不同組織中的一種“水通道”[1]，主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)水分子通過細(xì)胞膜，也有部分水通道蛋白可以轉(zhuǎn)運(yùn)甘油，哺乳動(dòng)物中水通道蛋白共有13種亞型(AQP0-AQP12)[2]。水通道蛋白4(aquaporin-4，AQP4)是于1994年由JUNG等[3]利用水通道蛋白家族的同源性克隆而分離出來，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，介導(dǎo)腦組織中水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)。2004年LENNON等[4]利用間接免疫熒光法證明了在視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)患者血清中存在一種特異性的抗體-NMO-IgG，能與腦組織中病變的微血管、軟腦膜、軟腦膜下以及Virchow-Robin間隙(VRS)等部位特異性結(jié)合。隨后的研究證明了該抗體的靶抗原即為AQP4，因此該抗體也被稱為水通道蛋白4抗體(AQP4-IgG)[1]。AQP4-IgG對(duì)NMO診斷的高度特異性也使其成為一種獨(dú)立的疾病，并于2015年正式提出了視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(NMO spectrum disorders，NMOSD)這一概念[5]。近年來AQP4-IgG一直是研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。研究提示，AQP4-IgG不僅參與NMOSD的發(fā)病，也在其他類型中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的致病機(jī)制中發(fā)揮作用，如多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)及Balo同心圓硬化(Balo’s concentric sclerosis，BCS)[6]，但AQP4-IgG的致病機(jī)制及其與上述疾病的臨床相關(guān)性尚未明確。本文就AQP4-IgG的致病機(jī)制、常用檢測(cè)方法及其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的關(guān)系加以綜述。

1 AQP4的結(jié)構(gòu)和功能

AQP4是位于細(xì)胞膜上的水通道蛋白，其單體由6個(gè)跨膜的螺旋結(jié)構(gòu)組成，形成5個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)，其中環(huán)A、C和E位于胞外，環(huán)B、D以及羧基、氨基末端均位于細(xì)胞內(nèi)，其中環(huán)B和E環(huán)含高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)重復(fù)串聯(lián)序列，2個(gè)NPA環(huán)折返進(jìn)入胞膜雙分子層可以構(gòu)成親水通道[7]。AQP4在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)豐富，特別是在腦實(shí)質(zhì)與腦室及蛛網(wǎng)膜下腔中腦脊液間的界面處，也表達(dá)于外周的腎、胃、呼吸道、腺體及骨骼肌等處的上皮細(xì)胞[2]。星型膠質(zhì)細(xì)胞膜上的AQP4有2種亞型，即M1(32 kD)型和M23(30 kD)型，兩者的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域相同，但M1在胞內(nèi)N端有多余的22個(gè)氨基酸序列[8]。M1和M23單體可以聚集形成AQP4四聚體，進(jìn)而形成正交排列顆粒(orthogonal array of particle，OAP)[9]。OAP的大小和形狀取決于M23與M1亞型的比值，比值越大形成的OAP體積越大，而不同大小OAP的分布和功能有明顯的不同[10]。作為一種雙向的水通道蛋白，AQP4在缺血或中毒造成的細(xì)胞毒性水腫中可以促進(jìn)水腫的形成，但在血管源性和間質(zhì)性水腫中可以清除過多腦積水[2]，而OAP的形成可以進(jìn)一步增強(qiáng)局部區(qū)域(如血管周圍)細(xì)胞膜水的滲透性[11]。此外，AQP4還可以作為黏附分子參與星型膠質(zhì)細(xì)胞的遷移、膠質(zhì)瘢痕形成、神經(jīng)細(xì)胞興奮以及突觸可塑性[12]。同時(shí)AQP4介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥可以影響星形膠質(zhì)細(xì)胞膜水的滲透性，并引起繼發(fā)的細(xì)胞腫脹和細(xì)胞因子釋放[12]。

2 AQP4-IgG的致病機(jī)制

血清中的AQP4-IgG由多個(gè)單克隆抗體組成，具有不同的AQP4結(jié)合能力[10]。AQP4-IgG不能識(shí)別AQP4單體單一的線性序列，只有當(dāng)AQP4聚集形成OAP時(shí)，才能被抗體識(shí)別[13]。兩者的結(jié)合并不影響AQP4轉(zhuǎn)運(yùn)水的能力，而是后續(xù)的炎性反應(yīng)造成致病的效應(yīng)[14]。AQP4-IgG是IgG1類抗體[10]，與星形細(xì)胞足突表面的AQP4胞外段的構(gòu)象表位結(jié)合后，可以激活補(bǔ)體、形成膜攻擊復(fù)合物，進(jìn)而損傷星形細(xì)胞[15]?；罨难a(bǔ)體(如C3a和C5a)還具有化學(xué)趨化的作用，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞在損傷部位的聚集。這兩種細(xì)胞可以通過補(bǔ)體或Ig / Fc受體介導(dǎo)補(bǔ)體或抗體依賴性細(xì)胞毒性[16]。另外，活化的巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞可以在局部產(chǎn)生細(xì)胞因子、蛋白酶或活性氧物質(zhì)，非選擇性破壞灰質(zhì)和白質(zhì)結(jié)構(gòu)，造成組織的損傷[17]。病理學(xué)研究也證實(shí)了NMO患者的病灶中不僅有AQP4缺失，同時(shí)在血管周圍也存在補(bǔ)體和免疫球蛋白的沉積[18]。此外，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2(EAAT2)和AQP4作為大分子復(fù)合物共同表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上。AQP4-IgG與AQP4的結(jié)合不僅造成細(xì)胞膜上AQP4的內(nèi)化，也造成EAAT2的喪失，破壞了谷氨酸的動(dòng)態(tài)平衡，從而導(dǎo)致谷氨酸的蓄積而產(chǎn)生神經(jīng)毒性[7]，特別是對(duì)谷氨酸濃度敏感的神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，因此也造成了繼發(fā)的脫髓鞘病變[19]。

AQP4-IgG造成的病變多累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，但該抗體不在外周富含AQP4組織致病的原因尚未闡明。研究發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)、脊髓及其他腦組織中單位組織的總AQP4的表達(dá)要明顯高于外周組織，并更多地聚集形成體積更大的OAP結(jié)構(gòu)[20]，而這些大體積的OAP更容易被AQP4-IgG識(shí)別[14]。此外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞較外周組織缺乏補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(CD46、CD55、CD59)的表達(dá)，而這些補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑可起到保護(hù)作用，使組織免受AQP4-IgG和補(bǔ)體介導(dǎo)的損傷[21]。此外，腦脊液中AQP4-IgG的來源尚不清楚。CHIHARA等[16]研究表明，外周血中CD19int、CD27high、CD38high、CD180-表型的B細(xì)胞亞群在疾病發(fā)作期可以產(chǎn)生AQP4-IgG，并通過視神經(jīng)篩板前和脊髓根部及腦干極后區(qū)未完全發(fā)育的血腦障礙進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[7]。但也有研究表明，外周血中產(chǎn)AQP4-IgG漿母細(xì)胞可以在疾病發(fā)作期遷移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生致病的AQP4-IgG[22]。

3 AQP4-IgG的檢測(cè)方法

3.1基于組織的間接免疫熒光技術(shù)基于組織的間接免疫熒光技術(shù)(indirect immunofluorescence，IIF)是檢測(cè)AQP4-IgG最為原始和基礎(chǔ)的檢測(cè)手段。LENNON等[4]利用成年小鼠腦冰凍切片與稀釋后的病人血清進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，再使用熒光素標(biāo)記的抗IgG標(biāo)記抗體，通過熒光顯微鏡檢測(cè)AQP4-IgG的滴度。此方法檢測(cè)AQP4-IgG的敏感度為73%，特異度可達(dá)91%[23]。該法因底物的簡(jiǎn)便易得和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的相對(duì)簡(jiǎn)單而被廣泛使用。雖然大鼠和人類AQP4的氨基酸序列是高度同源的，但兩者細(xì)胞外環(huán)的氨基酸序列仍存在一些差異[24]，可能影響抗原抗體的識(shí)別過程。此外，IIF也能染色目標(biāo)抗體外其他共存的抗體，使檢驗(yàn)結(jié)果呈假陽性。為減少這種非特異性染色，血清必須進(jìn)行顯著稀釋(1：60～1：120)，這可能導(dǎo)致在低效價(jià)樣品檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)假陰性結(jié)果[25]。另外，該種方法是半定量分析，結(jié)果依賴于實(shí)驗(yàn)人員的觀察，費(fèi)時(shí)費(fèi)力[26]。

3.2基于細(xì)胞測(cè)定法基于細(xì)胞測(cè)定法(cell based assay，CBA)是使用穩(wěn)定表達(dá)人AQP4蛋白的細(xì)胞作為底物，再使用間接免疫熒光，特異性檢測(cè)AQP4抗體，敏感度可達(dá)91%，敏感度可達(dá)100%，明顯高于IIF法[27]。但該方法也存在一些缺點(diǎn)。首先，非穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞需要在測(cè)試之前重新轉(zhuǎn)染；另外，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的AQP4表達(dá)水平可能隨著時(shí)間的推移而下降[28]。基于細(xì)胞測(cè)定法操作相對(duì)較為簡(jiǎn)單，能批量進(jìn)行半定量檢測(cè)，是目前臨床上最為廣泛使用的檢測(cè)手段。

3.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是將純化的AQP4蛋白吸附在固相載體表面，將血清樣品中待測(cè)的抗體與之結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)抗Ig抗體(二抗)與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，測(cè)定加底物后的顯色程度，確定待測(cè)抗體含量[29]。其靈敏度在NMO患者中可達(dá)72%，特異度可達(dá)98%。該技術(shù)具有定量?jī)?yōu)勢(shì)，可以用來觀察抗體濃度與疾病的嚴(yán)重情況[30]。

3.4放射免疫沉淀分析放射免疫沉淀分析(radio immunoprectation assay，RIPA)是于2007年由PAUL等[31]建立的定量檢測(cè)AQP4-IgG的新方法。該方法使用真核翻譯/轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)克隆和表達(dá)人AQP4，用放射性35S蛋氨酸標(biāo)記得到35S-蛋氨酸-AQP4。通過測(cè)定該復(fù)合物中的35S放射性強(qiáng)度，確定AQP4抗體的濃度。該檢測(cè)方法敏感度為57%，特異度為98%。RIPA的優(yōu)點(diǎn)是能同時(shí)測(cè)定大量的血清標(biāo)本，并能定量分析結(jié)果，不受觀察者影響，但該種方法因其敏感度偏低和過于高端的技術(shù)而未能在臨床中廣泛使用[28]。

3.5熒光免疫沉淀熒光免疫沉淀(fluorescence-based immunorecipitation assay，F(xiàn)IPA)是利用免疫沉淀原理建立的定量檢測(cè)AQP4抗體的新方法，使用人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)穩(wěn)定表達(dá)AQP4，用綠色熒光蛋白標(biāo)記AQP4得到EGEF-AQP4，之后再裂解細(xì)胞獲得EGFP-AQP4提取物，將其與抗體結(jié)合，通過測(cè)定復(fù)合物中的綠色熒光蛋白熒光強(qiáng)度，確定AQP4抗體濃度。該方法檢測(cè)的靈敏度可達(dá)76%～80%，特異度可達(dá)100%[32]。但該檢測(cè)方法耗時(shí)費(fèi)力，且所需的高端細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施，限制了該法在臨床中的使用[28]。

4 AQP4-IgG與視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病

視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，以單發(fā)或復(fù)發(fā)的視神經(jīng)炎(optic neuritis，ON)和(或)長(zhǎng)節(jié)段橫貫性脊髓炎(longtudinally extensive transverse myelitis，LETM)為特點(diǎn)[33]。2004年NMO特異性抗體NMO-IgG的發(fā)現(xiàn)[4]使NMO成為一種獨(dú)立的疾病，隨后的研究即證明了該抗體的靶抗原即為水通道蛋白4(AQP4)[1]。AQP4-IgG對(duì)NMO診斷的高度特異性，也使其成為診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。此外，臨床上還有一組疾病，具有和NMO相似的發(fā)病機(jī)制及臨床表現(xiàn)，如單發(fā)或復(fù)發(fā)性O(shè)N或LETM、可伴或不伴AQP4-IgG陽性，最終可演變?yōu)镹MO[34]。因此。WINGERCHUK等[35]于2007年正式提出了視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(NMOSD)這一概念。2015年NMO診斷國(guó)際專家組取消了NMO的個(gè)別定義，并達(dá)成了NMOSD診斷標(biāo)準(zhǔn)國(guó)際共識(shí)[36]。

以視神經(jīng)炎起病的NMOSD患者多表現(xiàn)為單眼或雙眼視力下降、眼痛及視野缺損。AQP4-IgG陽性的ON較抗體陰性的患者臨床表現(xiàn)更重，更易復(fù)發(fā)[37]。AQP4-IgG累及的ON多造成雙側(cè)、長(zhǎng)節(jié)段的視神經(jīng)炎，病變部位多位于后視覺通路，包括視交叉、視束以及顱內(nèi)段，而MS-ON更常累及單側(cè)、短節(jié)段的視神經(jīng)，病變多位于前視覺通路[38]。長(zhǎng)節(jié)段橫貫性脊髓炎(LETM)為病變延伸超過3個(gè)椎體節(jié)段的脊髓損傷，是NM0SD典型的表現(xiàn)之一[39]，約41.2%的LETM患者合并AQP4-IgG陽性[40]。以LETM起病的患者常表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)肢體無力、感覺異常、尿便障礙，還有一些特殊癥狀，如皮膚游走性瘙癢和束帶感[41]。合并AQP4-IgG陽性的患者更常以純運(yùn)動(dòng)癥狀起病，而以純感覺癥狀起病的患者多為抗體陰性[42]。AQP4-IgG累及的脊髓病變多位于頸部[43]，且抗體滴度越高，病變節(jié)段越長(zhǎng)[24]，復(fù)發(fā)率也更高[44]。此外，合并AQP4-IgG陽性的NMOSD患者中，約14%的患者以短節(jié)段脊髓炎(STM)起病，其中92%的患者在之后的隨訪中發(fā)展為長(zhǎng)節(jié)段脊髓炎[45]。由此可見，以STM起病的NMOSD患者并不罕見，而將其誤診為MS會(huì)影響其早期及后續(xù)的治療及恢復(fù)。1999年NMO的診斷標(biāo)準(zhǔn)中，“發(fā)病時(shí)頭顱MRI陰性”是診斷該病的支持標(biāo)準(zhǔn)之一[35]。但隨著研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)約60%的NMOSD患者可合并腦部病變，合并AQP4抗體陽性時(shí)該發(fā)生率為46.7%，而抗體陰性時(shí)該發(fā)生率可達(dá)76%[46]。NMOSD累及腦部病變的位置比較多變，臨床表現(xiàn)也比較復(fù)雜。其典型的病變位于高AQP4表達(dá)區(qū)，如下丘腦和室管膜周圍、第三、四腦室周圍的間腦和腦干等處[47]，臨床表現(xiàn)為頑固性呃逆和惡心、復(fù)視和延髓功能障礙、激素異常分泌綜合征等癥狀[48]。

5 AQP4-IgG與其他類型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病

多發(fā)性硬化(MS)是由髓鞘自身反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病。MS有兩種不同的亞型：視神經(jīng)脊髓型MS(OSMS)，病變主要累及視神經(jīng)及脊髓，與NMO相似；經(jīng)典的MS(CMS)[49]。在OSMS患者中，血清AQP4-IgG的陽性率可達(dá)20%～30%[50]，且多合并長(zhǎng)節(jié)段脊髓病變[34]，于脫髓鞘病灶處也可見到AQP4的丟失[18]。因此部分學(xué)者認(rèn)為，OSMS與NMO有同樣的致病機(jī)制。CMS患者血清AQP4-IgG陽性率為5%～10%，但MS典型的顱內(nèi)病變更多見于抗體陰性的患者[51]。

Balo同心圓硬化(BCS)是一種罕見的以病灶處髓鞘脫失區(qū)與髓鞘保留區(qū)呈特征性同心圓或洋蔥皮樣相間排列為特征的疾病，是多發(fā)性硬化癥的罕見亞型[52]。GRABER等[53]報(bào)道了1例NMO患者合并腦干Balo同心環(huán)病變，病理學(xué)研究也表明BCS所有脫髓鞘病變區(qū)及髓鞘保留區(qū)存在廣泛的AQP4丟失，且血管周圍有大量淋巴細(xì)胞堆積，提示在BCS中也發(fā)生與AQP4相關(guān)的星形細(xì)胞病[54]。但在這些患者的血清中卻未能檢測(cè)到AQP4抗體，因此，BCS病變處AQP4的丟失可能并不依賴于AQP4-IgG的介導(dǎo)[55]。

6 展望

AQP4-IgG的發(fā)現(xiàn)距今已有十多年的歷史，其為NMOSD的診斷、治療和預(yù)后判斷提供了一個(gè)新的方向，但其在NMOSD及其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病中的發(fā)病具體機(jī)制并未完全清楚，仍需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來闡明AQP4-IgG確切的致病機(jī)制。另外，提高AQP4-IgG檢驗(yàn)方法的靈敏度也是一個(gè)值得關(guān)注的問題，特別是在NMOSD病程早期，能及時(shí)做出準(zhǔn)確的診斷，為患者提供最佳治療時(shí)期，改善預(yù)后。