HPLC法測定萬古霉素血藥濃度

崔海珍，郭義明，于　倩（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院藥學(xué)部，吉林 長春 130033）

·實(shí)驗(yàn)研究·

HPLC法測定萬古霉素血藥濃度

崔海珍，郭義明，于倩（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院藥學(xué)部，吉林 長春 130033）

目的：建立高效液相色譜法測定人血漿中萬古霉素濃度，考察不同沉淀劑對萬古霉素提取率的影響。方法：以去甲萬古霉素為內(nèi)標(biāo)，采用Wondasil?C18-WR色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm），流速1.0 mL·min-1，檢測波長236 nm。采用甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.2）與乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.2）為流動相，選擇其最佳配比，通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化蛋白沉淀劑的濃度及體積，并考察5種沉淀劑對血漿樣品提取率的影響。結(jié)果：采用甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.2）（16 ： 84）為流動相，乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）200 μL為沉淀劑時(shí)對血漿中萬古霉素提取率最好。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了萬古霉素血藥濃度測定方法，該方法提取率高、重現(xiàn)性好、操作簡便、靈敏，適用于萬古霉素血藥濃度測定。

萬古霉素；高效液相色譜法；血藥濃度；提取率

萬古霉素屬于糖肽類抗菌藥物，主要用于嚴(yán)重革蘭陽性菌感染，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染（MRSA）、表皮葡萄球菌和腸球菌耐藥菌引起的重癥感染［1］。目前萬古霉素血藥濃度測定方法有酶放大免疫測定法（EMIT）、熒光偏振免疫分析法（FPIA）、液-質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS/MS）和高效液相色譜法（HPLC），其中HPLC法以高效、靈敏、費(fèi)用低廉得到廣泛使用。蛋白沉淀劑與流動相條件是影響提取率的重要因素之一，筆者選用HPLC法考察兩種因素對萬古霉素提取率的影響，并建立萬古霉素血藥濃度測定方法學(xué)，為臨床安全、合理使用萬古霉素提供理論參考。

1　儀器與試藥

島津LC-16高效液相色譜儀包括SPD-16紫外檢測器、色譜工作站（日本島津公司）；Pico17高速離心機(jī)（美國Thermo公司）；WiseMix?VM-10漩渦振蕩器（韓國Daihan科學(xué)公司）；BSA 124S電子分析天平（德國Sartorius公司）。

萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號130360-201302）；去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，含量83.4%，批號130338-200303）；甲醇、乙腈為色譜純（美國天地有限公司）；磷酸、磷酸二氫鉀、高氯酸為分析純；超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)初步考察了兩種流動相系統(tǒng)對有效成分分離測定的影響。1）甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.2），等度洗脫；2）乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.2），等度洗脫。結(jié)果表明，兩種流動相系統(tǒng)都能使萬古霉素與雜質(zhì)峰分開，并且隨著有機(jī)相比例的增高，萬古霉素的出峰時(shí)間提前。分別考察流動相9% ～ 12%乙腈及15% ～ 19%甲醇的最佳配比，結(jié)果顯示甲醇比例為16%時(shí)萬古霉素有較好的分離，分離度（R）為1.900，拖尾因子（T）為1.052。當(dāng)乙腈比例為12%時(shí)由于出峰時(shí)間提前無法與雜質(zhì)峰分開，所以減少有機(jī)相比例為9.5%時(shí)分離度（R）為1.741，拖尾因子（T）為1.058滿足分析要求。最終確定甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（16 ： 84）和乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（9.5 ：90.5）為流動相。

2.2色譜條件

色譜柱：Wondasil?C18-WR柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.2） （16 ： 84）/乙腈- 0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.2） （9.5 ： 90.5）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：236 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3溶液的配制

對照品溶液：精密稱取萬古霉素對照品10 mg于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容為1000 μg·mL-1的儲備液。將儲備液依次稀釋成500、250、150、100、50 μg·mL-1系列濃度，4 ℃避光保存。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取去甲萬古霉素對照品5 mg于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容為500 μg·mL-1的儲備液，4 ℃避光保存。

2.4血漿樣品預(yù)處理方法的優(yōu)化

2.4.1蛋白沉淀劑種類的選擇 選擇6種蛋白沉淀劑考察沉淀蛋白的效果，結(jié)果顯示10%硫酸鋅溶液沉淀蛋白不完全，離心后上清液渾濁無法直接進(jìn)樣；10%三氯醋酸溶液空白血漿內(nèi)源性物質(zhì)干擾較多；10%高氯酸沉淀蛋白二氯甲烷萃取，處理血樣時(shí)操作繁瑣，二氯甲烷萃取離心后水層不宜吸出；10%高氯酸和乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）沉淀蛋白，離心后上清液澄清，空白血漿內(nèi)源性物質(zhì)干擾少。

2.4.2蛋白沉淀劑濃度、體積對提取率的影響 考察高氯酸、乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）在不同濃度、比例條件下對提取率的影響。結(jié)果顯示，通過6% ～ 10%高氯酸對提取率影響的篩選，10%高氯酸的提取效果最好。進(jìn)一步篩選10%高氯酸80 μL、200 μL對提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)200 μL血漿中加入10%高氯酸80 μL時(shí)，萬古霉素的峰面積較大，提取率高。加大高氯酸的用量反而使峰面積減小，考慮為提取液的pH值對色譜柱的影響使柱效降低及萬古霉素在酸性條件下的穩(wěn)定性下降加快分解。此外，分別考察萃取液二氯甲烷與血漿樣品體積比為1 ： 1與2 ： 1時(shí)對提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示加入等體積的萃取液可得到較高的提取回收率。乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）分別采用100 μL、200 μL體積時(shí)，發(fā)現(xiàn)后者對血漿樣品的提取率較高。

2.4.3不同蛋白沉淀劑對提取率的影響 根據(jù)上述結(jié)果最終確定流動相1為甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.2），流動相2為乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.2）時(shí)，考察不同沉淀劑［10%高氯酸80 μL，10%高氯酸80 μL-二氯甲烷200 μL，10%三氯醋酸100 μL，乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）200 μL］對血漿樣品提取率的影響，結(jié)果顯示乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）作為沉淀劑對萬古霉素提取率最好。見表1。

結(jié)合萬古霉素血漿提取率與內(nèi)標(biāo)峰及雜質(zhì)峰的分離情況，最后確定流動相為甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.2）（16 ： 84），血漿樣品預(yù)處理沉淀劑為乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）。

表1　不同沉淀劑提取率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 1　The extraction rate results of the different precipitants

2.5血漿樣品預(yù)處理

取空白血漿180 μL，依次加入萬古霉素儲備液20 μL，500 μg·mL-1去甲萬古霉素20 μL，渦旋30 s，加乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）200 μL，渦旋2 min，離心（12 000 r·min-1）10 min，取上清液進(jìn)樣。

2.6血漿樣品分析方法的驗(yàn)證

2.6.1方法專屬性考察 按“2.5”項(xiàng)下方法分別制備空白血漿、萬古霉素+去甲萬古霉素+水、萬古霉素+去甲萬古霉素+空白血漿，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。結(jié)果表明，萬古霉素保留時(shí)間約為18.5 min，空白血漿中內(nèi)源性成分不干擾萬古霉素測定，詳見圖1。

圖1　萬古霉素色譜圖A - 空白血漿，B - 萬古霉素+去甲萬古霉素+水，C - 萬古霉素+去甲萬古霉素+空白血漿；1 - 去甲萬古霉素，2 - 萬古霉素Fig 1　Chromatograms of vancomycinA - blank plasma， B - vancomycin + norvancomycin + water， C - vancomycin + norvancomycin + blank plasma； 1 - norvancomycin， 2 - vancomycin

2.6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備、檢測限及定量限取健康人空白血漿180 μL，加入不同濃度的萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)液各20 μL，配制成濃度為5、10、15、25、50、100 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)血樣。按“2.5”項(xiàng)下方法處理血樣、進(jìn)樣，以測得的萬古霉素峰面積與內(nèi)標(biāo)去甲萬古霉素峰面積之比（Y）對血漿藥物萬古霉素的濃度（X）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y = 0.21×10-1X - 0.000 7（r = 0.999 9，n = 6）。結(jié)果表明，萬古霉素血藥濃度在5 ～ 100 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測限為2 μg·mL-1，定量限為5 μg·mL-1。

2.6.3回收率與精密度 制備10、25、100 μg·mL-1的低、中、高3種濃度萬古霉素血漿樣品各5份，按“2.5”項(xiàng)下方法處理血樣，測定其濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間RSD值，方法回收率及絕對回收率（n = 5），詳見表2。

表2　回收率及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果. n = 5Tab 2　Results of recovery and precision. n = 5

2.6.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 制備10、25、100 μg·mL-1低、中、高3種濃度萬古霉素血漿樣品各5份，分別在室溫放置4 h，反復(fù)凍融2次及冷凍（- 20 ℃）7 d、14 d、1個月的條件下，考察其穩(wěn)定性，詳見表3。

表3　穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果. n = 5Tab 3　Results of stability. n = 5

3　討論

3.1流動相選擇

乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.2）（9.5 ： 90.5）時(shí)，萬古霉素保留時(shí)間約為14.5 min，能與內(nèi)標(biāo)峰分開，峰形為尖高峰，但內(nèi)標(biāo)去甲萬古霉素峰形較差，有嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，通過調(diào)整乙腈比例無法改變拖尾現(xiàn)象，影響測定結(jié)果。采用甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.2）為流動相，在調(diào)整甲醇比例時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兩者比例為16 ： 84時(shí)與內(nèi)標(biāo)峰分離完全，且目標(biāo)物質(zhì)不受內(nèi)源性物質(zhì)干擾，但峰形較矮，可能會降低本方法的定量限。

3.2蛋白沉淀劑選擇

為了提高檢測靈敏度，分別比較了5種沉淀劑沉淀蛋白的效果，結(jié)果表明乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）沉淀效果好，提取回收率高。根據(jù)篩選結(jié)果進(jìn)一步考察沉淀劑濃度、體積對提取率的影響，通過系統(tǒng)綜合分析得出最好的提取效果，減少結(jié)果偏差及臨床影響。

有文獻(xiàn)［2］報(bào)道，比較4種沉淀劑時(shí)乙腈-6%高氯酸的沉淀效果最好、回收率較高、峰形佳，與本文結(jié)論相符合。也有報(bào)道［3］硫酸鋅作為沉淀劑，但其蛋白沉淀效果和提取率不理想。有文獻(xiàn)［4］報(bào)道采用60%高氯酸溶液15 μL作為沉淀劑，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)高氯酸濃度與提取率呈正比，隨著濃度的增高提取率升高。因此，在加入適當(dāng)濃度及體積的高氯酸時(shí)，有助于萬古霉素在提取過程中的穩(wěn)定性和提取率，但加大高氯酸溶液濃度或體積時(shí)，萬古霉素峰形變差，提取率降低。

有研究［5］表明，以LC-MS/MS法為對照，4種不同的免疫分析法測定的萬古霉素血藥濃度比較結(jié)果對臨床影響，其中PETINIA法偏差及臨床影響最小為2.4%、6.1%。根據(jù)國外289例樣本的比較，通過Bland-Altman分析和Pearson相關(guān)性分析得出結(jié)論HPLC法敏感性為PETINIA法的8倍［6］。因此本文采用HPLC法，并結(jié)合萬古霉素穩(wěn)定性、血漿蛋白結(jié)合率的基礎(chǔ)上，考察兩種流動相溶液中5種沉淀劑對提取率的影響，通過比較得出不同沉淀劑對提取率存在很大差異，這直接關(guān)系到萬古霉素血藥濃度臨床監(jiān)測的準(zhǔn)確性。因此，通過流動相配比及沉淀劑對提取率影響的優(yōu)化，建立了簡便、靈敏的檢測方法，該方法沉淀效果好，提取率高，測定結(jié)果可靠，適用于萬古霉素血藥濃度測定。

［1］ 陳佰義，管向東，何禮賢，等.萬古霉素臨床應(yīng)用中國專家共識（2011版）［J］.中國新藥與臨床雜志，2011，30（8）：561-573.

［2］ 胡偉，陳璐璐，孫成，等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定人體血漿中萬古霉素的濃度［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2016，36（8）：616-620.

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［5］ Oyaert M， Peersman N， Kieffer D， et al. Novel LC-MS/MS method for plasma vancomycin： comparison with immunoassays and clinical impact［J］. Clin Chim Acta， 2015： 63-70.

［6］ Usman M， Hempel G. Development and validation of an HPLC method for the determination of vancomycin in human plasma and its comparison with an immunoassay （PETINIA）［J］. Springerplus， 2016， 5： 124.

Determination of vancomycin concentration in human plasma by HPLC

CUI Hai-zhen， GUO Yi-ming， YU Qian（Department of Pharmacy， China-Japan Union Hospital of Jilin University， Changchun 130033， China）

Objective： To establish the method for determination of vancomycin in human plasma by HPLC， and investigate the effects of different precipitants to vancomycin extraction rate. Methods： Norvancomycin was used as the internal standard， the liquid chromatography was performed on Wondasil?C18-WR column （4.6 mm × 150 mm， 5 μm）， the flow rate was 1.0 mL·min-1， and UV detector wavelength was 236 nm. Using two mobile phases of methanol-0.05 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate buffer （pH 3.2） and acetonitrile-0.05 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate buffer （pH 3.2） to select the best ratio of mobile phase. The concentration and volume of protein precipitants were optimized through experiments， five kinds of precipitant were used to investigate the affect of plasma sample extraction rate. Results： The results showed that mobile phase consisted of methanol-0.05 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate buffer （pH 3.2） （16 ： 84） and acetonitrile-6% perchloric acid （1 ： 6） as a precipitant， the extraction rate was the best. Conclusion： The method for the determination of plasma vancomycin concentration was optimized and proved to be high extraction rate， reproducible， simple and sensitive， it is suitable for the determination of vancomycin concentration.

Vancomycin； HPLC； Blood drug concentration； Extraction rate

R917

A

1672 - 8157（2016）05 - 0268 - 04

于倩，女，主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)及藥事管理工作。E-mail：819389186@qq.com

崔海珍，女，藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作。E-mail：289483722@qq.com

（2016-02-26

2016-04-14）