“功效成分組”在中藥毒/效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用

李蕓霞，彭成

藥物的三性包括安全性，有效性和質(zhì)量可控性。中藥，作為我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療疾病的主要方式，有著深厚的文化底蘊(yùn)和社會(huì)基礎(chǔ), 同時(shí)具有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)、確切的臨床療效和完整的理論體系,為中華民族的健康與繁衍做出了不可磨滅的貢獻(xiàn),其有效性已經(jīng)得到反復(fù)的確證。然而，近年來(lái)關(guān)于中藥質(zhì)量和臨床療效不穩(wěn)定、毒副作用的報(bào)道逐漸增多，中藥安全性研究已成為中藥國(guó)際化的技術(shù)壁壘。SFDA也對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)類藥品開展/ 再評(píng)價(jià)工作，究其原因在于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明, 藥品的安全、有效、質(zhì)量可控就成了無(wú)源之水、無(wú)本之木。因此, 中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究是中藥安全性和質(zhì)量控制的基礎(chǔ)與核心, 也是中藥新藥創(chuàng)制急需解決的核心問題。

1 中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究進(jìn)展

中藥藥效物質(zhì)主要指中藥（包括單味藥、復(fù)方）中的活性成分或有效組分。通過中藥藥效物質(zhì)的研究，闡明中藥有效成分及其作用機(jī)制，揭示中藥發(fā)揮臨床療效的科學(xué)內(nèi)涵及獨(dú)特作用規(guī)律是保證中藥質(zhì)量穩(wěn)定可控的前提，也是開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)創(chuàng)新中藥的源頭。而中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，決定了揭示中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的難度和復(fù)雜性。目前針對(duì)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究已提出了多種方法和假說。

如薛燕教授等[1]提出的中藥復(fù)方霰彈理論認(rèn)為：中藥復(fù)方中多種成分在體內(nèi)同時(shí)作用于多個(gè)部位和靶點(diǎn)，通過多種途徑來(lái)治療疾病。周俊院士[2]認(rèn)為中藥復(fù)方是根據(jù)中醫(yī)理論和實(shí)踐以及單味藥功能主治性味,通過人工組合形成的具有療效的相對(duì)安全的天然組合化學(xué)庫(kù),具有多靶作用機(jī)理特征。高月研究員等[3]提出的 “分子中藥組學(xué)”認(rèn)為中藥復(fù)方是通過化學(xué)成分組合影響到信號(hào)分子組合, 使紊亂的信號(hào)分子網(wǎng)絡(luò)恢復(fù)平衡, 從而起到治療中醫(yī)的“證”和相關(guān)疾病的作用和效果。李愛秀教授[4]在李石生教授等人的中藥“分子藥性假說”基礎(chǔ)上提出“藥效團(tuán)藥性假說”，認(rèn)為藥物分子與某個(gè)受體產(chǎn)生相互作用時(shí)所具有的“特定藥效結(jié)構(gòu)，決定了中藥對(duì)機(jī)體作用的多靶點(diǎn)作用機(jī)制。彭成教授[5]提出中藥配伍“一個(gè)核心,兩個(gè)環(huán)境、三個(gè)性質(zhì)、四個(gè)層次”的觀點(diǎn),以提高療效為核心，著重內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境，堅(jiān)持中藥的復(fù)雜性、相對(duì)性、可控性，從藥隊(duì)配伍、飲片配伍、組分配伍、成分配伍四個(gè)層次研究中藥的增效減毒與調(diào)控。蔡少青教授[6]提出中藥藥效物質(zhì)的“顯效形式”、“疊加作用”和“毒性分散效應(yīng)”理論假說，探索中藥有效低毒的本質(zhì)。張伯禮院士、王永炎院士[7]在《組分配伍研制現(xiàn)代中藥的理論與實(shí)踐--方劑關(guān)鍵科學(xué)問題的基礎(chǔ)研究》一書中對(duì)“組分配伍”的概念的總結(jié)以及復(fù)方丹參方、清開靈、血府逐瘀湯等的研究為中藥復(fù)方的現(xiàn)代化研究奠定了基礎(chǔ)，對(duì)發(fā)展創(chuàng)制現(xiàn)代中藥有著示范性的啟示。

我國(guó)學(xué)者積極引入現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)， “證治藥動(dòng)學(xué)”[8]、 “中藥胃腸藥動(dòng)學(xué)”[9]及“中藥血清藥物化學(xué)”[10]等理論假說的出現(xiàn)大大豐富和活躍了中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究工作。黃熙教授等提出的“證治藥動(dòng)學(xué)”理論假說是指同一藥物作用不同的中醫(yī)病證時(shí)其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,體現(xiàn)了中藥 (復(fù)雜系統(tǒng)) 與人體 (復(fù)雜系統(tǒng)) 的相互作用的動(dòng)態(tài)關(guān)系。楊奎教授等提出的“中藥胃腸藥動(dòng)學(xué)”研究胃腸道環(huán)境 (pH 值、腸道細(xì)菌及消化酶等) 因素對(duì)中藥方劑有效成分溶出、吸收和代謝的影響, 揭示各有效成分間協(xié)同或拮抗的規(guī)律。王喜軍教授提出的“中藥血清藥物化學(xué)”，以血清中入血的有效成分或移行成分為指標(biāo),通過有效成分與藥效的相互關(guān)系來(lái)反映中藥傳統(tǒng)方劑的配伍原則和藥物的量效關(guān)系。王廣基教授提出了中藥體內(nèi)外藥效物質(zhì)組生物/化學(xué)集成表征新方法[11]，劉昌孝院士、李川研究員等應(yīng)用藥代標(biāo)示物[12-13]和文愛東教授等應(yīng)用藥效差示血清色譜法[14]等從不同角度、不同層次論述了中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究思路和方法, 促進(jìn)了中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的發(fā)展。

近年來(lái),伴隨血清藥物化學(xué)的發(fā)展和后基因時(shí)代的代謝組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)出現(xiàn),使認(rèn)識(shí)中藥體內(nèi)直接作用物質(zhì)及其與病證生物標(biāo)記物成為可能, 為闡述中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了方法學(xué)可能。肖培根院士[15]指出中藥的現(xiàn)代化是指將傳統(tǒng)中藥的特色優(yōu)勢(shì)與最新的現(xiàn)代化科學(xué)技術(shù)密切結(jié)合, 明確中藥及其復(fù)方在體內(nèi)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理作用機(jī)制, 使藥材質(zhì)量達(dá)到穩(wěn)定可控, 能夠開發(fā)出具有中醫(yī)藥特色的治療復(fù)雜疾病的新藥。劉昌孝院士[16]提出代謝組學(xué)將助推中藥現(xiàn)代研究，認(rèn)為在現(xiàn)代中藥研究中，代謝組學(xué)在藥物有效性和安全性、中藥資源和質(zhì)量控制研究等方面具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。羅國(guó)安教授[17]認(rèn)為生物機(jī)體系統(tǒng)受中藥系統(tǒng)作用后將會(huì)在內(nèi)源性代謝物組上產(chǎn)生的應(yīng)答, 可間接地反映藥代動(dòng)力學(xué)的特征[18]，并通過代謝組學(xué)研究方法研究熱性中藥川芎對(duì)寒凝證潛在生物標(biāo)志物的影響，探討川芎治療寒凝證的作用機(jī)制[19]。許國(guó)旺教授等[20]基于UFLC/MSIT-TOF的代謝組學(xué)方法, 構(gòu)建了過度疲勞與抑郁大鼠的內(nèi)源性生物標(biāo)志物網(wǎng)絡(luò),揭示了其代謝紊亂過程。賈偉教授等[21]采用代謝組學(xué)研究方法開展了中藥馬兜鈴酸致腎毒性及中藥方劑（左金丸）治療大鼠結(jié)腸癌癌前病變機(jī)理研究。唐惠儒教授等[22]進(jìn)行了黃曲霉毒素導(dǎo)致的肝纖維化和肝癌的一些內(nèi)源性代謝物變化研究, 結(jié)合KEGG、Metacyc 等數(shù)據(jù)庫(kù)揭示其致毒機(jī)制。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[23]是系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)的融合與發(fā)展，用計(jì)算方法研究中藥中化學(xué)成分的多靶標(biāo)、多途徑協(xié)同作用，并用網(wǎng)絡(luò)的形式直觀呈現(xiàn)出這種復(fù)雜作用。徐筱杰教授等[24]應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討清熱中藥治療冠心病作用機(jī)制,研究清熱中藥中化學(xué)成分與相關(guān)靶標(biāo)的相互作用，初步揭示了中藥分子基礎(chǔ)及復(fù)雜的作用機(jī)理。李梢教授等[25]提出中醫(yī)藥系統(tǒng)生物學(xué)的概念，并基于網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)方法構(gòu)建了神經(jīng)內(nèi)分泌免疫 (NEI) 網(wǎng)絡(luò)并提出中醫(yī)證候生物分子網(wǎng)絡(luò)標(biāo)志的構(gòu)想。在2014年Science推出的中醫(yī)藥特刊發(fā)表的系列文章中也從不同方面中醫(yī)藥與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)包括系統(tǒng)生物學(xué)等進(jìn)行了回顧和總結(jié)。

2 “功效成分組學(xué)”概念的提出

中藥的功效是對(duì)在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下的對(duì)疾病的治療作用和保健作用的精煉總結(jié)。而建立在陰陽(yáng)學(xué)說的中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)，針對(duì)“陰陽(yáng)失調(diào)”的病理狀態(tài)進(jìn)行治療，基于這種理論用藥并從中總結(jié)出來(lái)的功效，應(yīng)當(dāng)屬于“治療”功效。因而中藥的治療功效歷來(lái)占絕大多數(shù)。隨著臨床用藥經(jīng)驗(yàn)的積累，主治范圍的擴(kuò)大，以及中醫(yī)病因病機(jī)學(xué)說和辯證理論的逐漸深入，中藥的治療功效也向縱深發(fā)展，大體可分為“對(duì)證治療功效”、“對(duì)病治療功效”和“對(duì)癥治療功效”[26]。“證”是中醫(yī)學(xué)的特有概念，是對(duì)疾病所處一定階段的病因、病性、病位等做出的綜合性概括。辨證論治是中醫(yī)學(xué)的顯著特征，通過這種醫(yī)療實(shí)踐而產(chǎn)生的中藥對(duì)證治療功效在各類功效中占主導(dǎo)地位，其既是各藥性能產(chǎn)生的基礎(chǔ)，又是臨床用藥的主要依據(jù)。如：麻黃發(fā)散風(fēng)寒，可推導(dǎo)其藥性為辛溫，歸肺經(jīng)，又可確定其主治為風(fēng)寒表證。

功效是中藥預(yù)防和治療疾病的基本作用，藥物的性能是對(duì)功效性質(zhì)和特征的進(jìn)一步概括，主治和應(yīng)用則是各種功效適應(yīng)的病證和用藥方法，中藥研究的關(guān)鍵應(yīng)以功效為核心。不同的功效描述意味著針對(duì)不同證的治療作用，體現(xiàn)了機(jī)體和藥物的相互關(guān)系。然中藥成分復(fù)雜，功效多樣。針對(duì)不同證型，起效部分可能是其中的某一組分群，而其它與之不相關(guān)的組分則是其副作用甚至毒性效應(yīng)的誘因。應(yīng)用整味藥材作為研究對(duì)象進(jìn)行藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，缺乏對(duì)生物機(jī)體、中藥成分與藥效改變的整體聯(lián)動(dòng)性以及組分間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系的考慮，在研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的安全性與有效性方面存在一定的局限。在此基礎(chǔ)上，課題組提出“功效成分組”的概念。認(rèn)為中藥自身即為小的藥物庫(kù)，內(nèi)含不同種類化學(xué)成分。不同成分功效在治療病證時(shí)發(fā)揮不同功效，或?yàn)橹委煶煞郑驗(yàn)闊o(wú)效成分，或?yàn)橛泻Τ煞帧３煞珠g可能存在協(xié)同、拮抗或者單行的關(guān)系。并在國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目-“附子’毒與效’的多維評(píng)價(jià)與整合分析研究(81630101)”、面上項(xiàng)目-“司外揣內(nèi)”活性成分譜橋接生物體代謝響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)探究附子治療心陽(yáng)虛型慢性心衰的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理(81573583)、多組分多靶點(diǎn)動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控驅(qū)動(dòng)效應(yīng)模型研究連翹“清熱解毒”的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和協(xié)同作用機(jī)理(81373943)、青年項(xiàng)目-連翹清熱解毒藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的“譜證動(dòng)力學(xué)”研究(811027943)的等的連續(xù)資助下，對(duì)附子及連翹的功效成分組進(jìn)行了相關(guān)研究，旨在為中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供新的思路與方法，并探索中藥整體功效及其作用本質(zhì)奧秘的關(guān)鍵所在。

3 “功效成分組學(xué)”在中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用

3.1 附子功效成分組研究

附子具有回陽(yáng)救逆，溫里散寒的功效，被稱為“藥之四維”，千百年來(lái)都是防病治病的重要藥物。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，列入國(guó)家社保目錄的中成藥中，以附子作為主要原料的就有20多個(gè)。附子主要用于" 身涼肢冷，脈微欲絕" 以" 回陽(yáng)救逆"。脈微欲絕與心衰和休克有關(guān)，而溫里散寒功效在與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)。課題組對(duì)附子進(jìn)行了長(zhǎng)期的研究，在彭成教授“毒性物質(zhì)基礎(chǔ)-毒作用機(jī)制-控毒方法體系”的有毒中藥安全性研究的思路和模式的指導(dǎo)下，對(duì)附子的基礎(chǔ)毒理、特殊毒性、安全毒理等進(jìn)行了研究，發(fā)表專著《有毒中藥附子、川烏、草烏的安全性評(píng)價(jià)與應(yīng)用》[27]。在前期研究的基礎(chǔ)上，我們提出以功效為導(dǎo)向的附子功效成分組并予以實(shí)踐研究。

藥理實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在正常大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，附子脂溶性生物堿具有明顯的毒性，在12mg/Kg劑量時(shí)就能出現(xiàn)死亡，在急慢性心衰大鼠體內(nèi)，水溶性生物堿在治療心衰方面效果顯著。給藥后，心衰大鼠的畏寒喜暖、弓背蜷縮、體毛枯疏、陰囊皺縮、睪丸回升、肛周污染、飲食減少、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、死亡及死亡時(shí)的表現(xiàn)(如腹水)等癥狀明顯減輕。與正常大鼠比較，心衰大鼠灌胃附子水溶性生物堿后，可顯著性降低各時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿中ANG-II、ALD、ANP、ET、NT-proBNP水平。

課題組對(duì)附子總生物堿在正常大鼠體內(nèi)、附子水溶性生物堿在正常和急慢性心衰大鼠的體內(nèi)過程進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究。9.6，19.2，38.4 mg﹒kg-1灌胃大鼠附子總生物堿后[28]，采用UHPLC-Q-TOF-MS 測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)血漿中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和烏頭原堿的血藥濃度，繪制藥-時(shí)曲線，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。與低劑量組比較，中、高劑量組上述7 種生物堿類成分的藥峰濃度(Cmax) 和藥時(shí)曲線下面積AUC0-∞升高，大部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 表觀分布容積/生物利用度( Vz/F) ，清除率( CL /F)，半衰期( t1/2)和達(dá)峰時(shí)間( Tmax) 則大部分無(wú)明顯變化。表明劑量對(duì)附子總生物堿在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征有顯著影響，附子總生物堿的體內(nèi)過程基本符合線性動(dòng)力學(xué)特征。

附子水溶性生物堿在正常大鼠和模型大鼠體內(nèi)過程符合線性動(dòng)力學(xué)特征，疾病狀態(tài)可明顯影響水溶性生物堿的體內(nèi)過程[29]。大鼠的畏寒喜暖、弓背蜷縮、體毛枯疏、陰囊皺縮、睪丸回升、肛周污染、飲食減少、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、死亡及死亡時(shí)的表現(xiàn)(如腹水)等心衰癥狀明顯減輕。急慢性心衰大鼠體內(nèi)的, 鹽酸多巴胺、尿嘧啶、去甲豬毛菜堿、尿苷、鳥苷、去甲烏藥堿的 Cmax、AUClast明顯升高。結(jié)果顯示，附子水溶性生物堿對(duì)大鼠急慢性心衰均有一定的治療作用，在對(duì)證的前提下，附子水溶性生物堿的血藥濃度增加表明體內(nèi)吸收增加，能達(dá)到更好的治療效果。

之后課題組采用UPLC-Q-TOF-MS/MS代謝組學(xué)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析和模式識(shí)別技術(shù)研究附子在治療心衰時(shí)的毒效物質(zhì)基礎(chǔ)。脂溶性生物堿組10 mg/kg灌胃給藥，水溶性生物堿組2g/kg連續(xù)給藥一周后，采集血漿樣本，建立總離子流色譜圖(TIC)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行解卷積和峰對(duì)齊，數(shù)據(jù)歸一化處理，然后進(jìn)行主成分分析(PCA)，偏最小二乘方-判別分析（PLS-DA），差異代謝物韋恩圖(venn)分析，差異代謝物熱圖(heatmap)分析等，鑒定差異代謝物并進(jìn)行毒效機(jī)理分析。鑒定得到10個(gè)代謝標(biāo)志物：L-Arginine, L-Carnitine, Indoxylsulfuric acid,L-Tryptophan, L-Methionine, 1-Linoleoylglycerophosp hocholine, DL-pipecolic acid, Pyrrolidine, beta-Alanine,L-Valine。經(jīng)通路分析，推測(cè)脂溶性生物堿的毒性可能與Pantothenate and CoA biosynthesis（泛酸和輔酶A生物合成）; beta-Alanine metabolism（β-丙氨酸代謝）; Propanoate metabolism（丙酸代謝）; Pyrimidine metabolism（嘧啶代謝）; Valine, leucine and isoleucine biosynthesis（纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸生物合成）; Valine, leucine and isoleucine degradation（纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸降解）; AminoacyltRNA biosynthesis（氨酰-tRNA合成）等代謝通路有密切關(guān)系。慢性心衰使大鼠機(jī)體的Aminoacyl-tRNA biosynthesis（氨酰-tRNA合成）, Arginine and proline metabolism（精氨酸和脯氨酸代謝）, Cysteine and methionine metabolism（半胱氨酸和蛋氨酸代謝）等發(fā)生紊亂。水溶性生物堿可通過調(diào)節(jié)慢性心衰大鼠的氨酰-tRNA合成,精氨酸和脯氨酸代謝,色氨酸代謝,及賴氨酸降解等代謝途徑，對(duì)其發(fā)揮一定的治療作用。

課題組進(jìn)一步在分子層面對(duì)附子水溶性生物堿對(duì)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞膜ATP酶以及相關(guān)離子的影響進(jìn)行研究。取新生大鼠心室肌細(xì)胞原代培養(yǎng)5d至細(xì)胞成熟，用0.8%戊巴比妥鈉作用5 min造心衰細(xì)胞后，分別給予附子水溶性生物堿0.01，0.02，0.04 g﹒L-1。結(jié)果顯示，附子水溶性生物堿各劑量組均能提高心衰細(xì)胞的細(xì)胞活性,并能升高模型細(xì)胞Na＋，Mg2＋含量，提高細(xì)胞內(nèi)Ca2＋-ATP酶和Ca2＋-Mg2＋-ATP酶的活性，降低K＋，Ca2＋的含量與Na＋-K＋-ATP酶的活性，說明其對(duì)戊巴比妥鈉致心衰細(xì)胞模型具有一定的治療作用[30]。

綜上，課題組對(duì)附子研究結(jié)果表明在脂溶性生物堿顯示出較大的毒性，而水溶性生物堿是治療心衰的有效成分，提示若針對(duì)心衰治療時(shí)工業(yè)生產(chǎn)中能否將脂溶性生物堿和水溶性生物堿進(jìn)行分別提取，針對(duì)不同證型給藥以減少其毒性作用。同時(shí)課題組也對(duì)臨床常用于急救的參附注射液成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)參附注射液里只能檢測(cè)到附子水溶性生物堿成分，而不含有脂溶性生物堿，從而也證明了我們的假想。

3.3 連翹功效成分組研究

連翹為木犀科植物連翹的干燥果實(shí)，被喻為“瘡家圣藥”。具有清熱解毒，消腫散結(jié)，疏散風(fēng)熱的功效。其中疏散風(fēng)熱可與清熱聯(lián)系，消腫散結(jié)與解毒聯(lián)系，因此連翹的功效可簡(jiǎn)單概括為“清熱、解毒”。中醫(yī)認(rèn)為，清熱解毒之“毒”為火熱壅盛所致的“熱毒”或“火毒”，主要為溫?zé)岵〖盁岫緹胧Y?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，清熱解毒中藥所解之“毒”包括細(xì)菌、病毒、內(nèi)毒素等“外源性之毒”和氧自由基、細(xì)胞因子等“內(nèi)源性之毒”。連翹為典型的清熱解毒藥，可用于溫?zé)岵〉母鱾€(gè)階段?，F(xiàn)在藥理研究表明其具有抗炎、抗病原微生物、解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)吐、保肝等作用。

連翹主要含有木脂素類、苯乙醇苷類、揮發(fā)油、黃酮類、有機(jī)酸、生物堿等，按組分類別分為連翹提取物和連翹揮發(fā)油。連翹提取物是中國(guó)藥典記載的連翹水提醇沉物，保留了苷類、有機(jī)酸類、氨基酸、生物堿等成分，而去掉了揮發(fā)油部位和雜質(zhì)。而連翹揮發(fā)油在研究中常常被忽略，在現(xiàn)有的制備工藝過程中也容易流失。根據(jù)已有的報(bào)道，連翹清熱解毒功效缺乏整體性研究，偏重于主要成分或者某個(gè)提取部位，且連翹提取物和揮發(fā)油相當(dāng)于將連翹有效組分一分為二的兩個(gè)部分，尚沒有兩者藥效、機(jī)制的關(guān)聯(lián)性或進(jìn)行比較的相關(guān)報(bào)道。因此，對(duì)于這類多組分-多靶點(diǎn)的中藥，有必要進(jìn)行重要部位間相關(guān)的藥效比較或者協(xié)同性研究，同時(shí)闡釋其多組分-多靶點(diǎn)的特點(diǎn)和機(jī)制。

連翹為單品種來(lái)源藥材，但根據(jù)采收時(shí)間不同可分為青翹和老翹，但臨床上對(duì)不同商品規(guī)格的藥材應(yīng)用并沒有區(qū)分。研究首先對(duì)不同產(chǎn)地來(lái)源的連翹進(jìn)行了指紋圖譜研究，考察不同產(chǎn)地、采收時(shí)期、加工方法的15批連翹藥材的各成分情況，建立連翹指紋圖譜，用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)和聚類分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)青翹與老翹的化學(xué)組成相似，但青翹的各成分含量相對(duì)老翹更多；主產(chǎn)地山西臨汾和河南盧氏的連翹化學(xué)成分組成比其他地方的含量高；同一產(chǎn)地的水煮曬干的青翹比直接曬干的青翹的化學(xué)成分含量更高。在規(guī)范了藥材來(lái)源基礎(chǔ)上，課題組制備了連翹提取物和揮發(fā)油進(jìn)行清熱解毒功效研究。

以證為出發(fā)點(diǎn)，課題組建立不同熱證模型[31]：皮下注射干酵母致大鼠發(fā)熱模型、腹腔注射脂多糖（LPS）致大鼠發(fā)熱模型、皮下注射2,4-二硝基苯酚致大鼠發(fā)熱模型，給予連翹提取物及揮發(fā)油高中低不同劑量，研究其解熱功效。并在此基礎(chǔ)上，選擇發(fā)熱穩(wěn)定的干酵母致大鼠發(fā)熱模型，進(jìn)行代謝組學(xué)及相關(guān)機(jī)制研究。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析和模式識(shí)別技術(shù)對(duì)酵母致發(fā)熱大鼠分別經(jīng)連翹提取物和揮發(fā)油治療后經(jīng)行血清代謝組學(xué)分析，挑選潛在的代謝標(biāo)志物來(lái)揭示連翹提取物和揮發(fā)油的解熱機(jī)制。通過與模型大鼠的比較，研究發(fā)現(xiàn)連翹提取物和揮發(fā)油均能顯著的扭轉(zhuǎn)發(fā)熱大鼠的代謝紊亂。8種代謝物被篩選出來(lái)，包括鞘氨醇、胞嘧啶、亮氨酸、蛋氨酸、溶血磷脂膽堿、L-乳酸、已二酸和3-羥基丁酸。結(jié)果表明，連翹的解熱機(jī)制可能涉及“半胱氨酸和蛋氨酸代謝”、“纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成和降解”、“酮體的生成和降解”、“丁酸代謝”。這些結(jié)果進(jìn)一步說明，連翹的不同組分在治療酵母所致大鼠發(fā)熱時(shí)具有協(xié)同作用。同樣建立角叉菜膠致大鼠足腫脹模型、雞蛋清致大鼠足腫脹模型、大鼠棉球肉芽腫慢性炎癥模型[32]，給予連翹提取物及揮發(fā)油高中低不同劑量，研究解毒（抗炎）功效。并在此基礎(chǔ)上，基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的代謝組學(xué)方法，通過研究連翹提取物和揮發(fā)油治療角叉菜膠致足腫脹大鼠后血清代謝物改變來(lái)系統(tǒng)地闡明連翹抗炎機(jī)制[33]。13個(gè)代謝標(biāo)記物被篩選出來(lái)，包括PC (19:0/0:0)、LysoPC (20:0)、LysoPC (20:1)、LysoPC (17:0)、鞘氨醇、亞油酸、3R-羥基-丁酸乙酯、2-羥基十六烷酸、乳酸、L-蘇氨酸、L-亮氨酸、馬來(lái)酸、己二酸。根據(jù)KEGG通路圖得到連翹抗炎對(duì)代謝通路影響的網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行metaboanalyst分析，連翹提取物組影響的主要代謝通路有亞油酸代謝、纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、鞘氨醇代謝、甘油磷脂代謝，連翹揮發(fā)油組影響的代謝通路有鞘氨醇代謝、甘油磷脂代謝）。

課題組進(jìn)一步采用分子對(duì)接和藥理實(shí)驗(yàn)方法篩選連翹的主要藥效成分。以JAK/STAT信號(hào)通路為例，課題選取JAK/STAT信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)作為研究靶點(diǎn)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)主要選取了細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子家族（SOCS）、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶家族（PTPS）等相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行研究。由連翹與JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)各靶點(diǎn)的對(duì)接得分可以看出中藥連翹的抗炎作用整體較好，提取物中苯乙醇苷類、木脂素類以及揮發(fā)油類成分與該通路的多個(gè)蛋白靶點(diǎn)結(jié)合較優(yōu)，尤其是苯乙醇苷類成分在該通路上顯示出了明顯且廣泛的多靶點(diǎn)抗炎作用。苯乙醇苷類成分中得分較高的成分主要為連翹酯苷類，以連翹酯苷A（Forsythiaside A）和連翹酯苷B（Forsythiaside B）的得分較高，并且連翹酯苷A和連翹酯苷B與JAK/STAT信號(hào)通路的多個(gè)靶點(diǎn)結(jié)合的得分均優(yōu)于其相應(yīng)的陽(yáng)性結(jié)果；木脂素類成分中以連翹脂素（Phillygenin）、連翹苷（Phillynin）得分較高，其中連翹脂素與該信號(hào)通路的多個(gè)靶點(diǎn)對(duì)接得分均高于陽(yáng)性對(duì)照；揮發(fā)油類成分中α-蒎烯、β-蒎烯對(duì)接得分較高，此外，環(huán)烯醚萜類如Forsythide、Adoxosidic acid等與該信號(hào)通路的一些靶點(diǎn)也顯示了較好的結(jié)合。從對(duì)接得分情況來(lái)看其結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果推測(cè)的連翹抗炎成分相吻合。

結(jié)合虛擬篩選結(jié)果，采用藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)連翹的主要解熱藥效成分為連翹脂素＞連翹酯苷＞連翹苷，機(jī)制與提取物和揮發(fā)油均能顯著降低下丘腦中cAMP含量有關(guān)，同時(shí)連翹提取物能顯著降低下丘腦中PGE2含量[34]?？寡姿幮С煞譃檫B翹脂素、連翹酯苷A及連翹酯苷B顯示較強(qiáng)的抗炎活性，同時(shí)推測(cè)其抗炎機(jī)制可能與抑制TNF-α和IL-6這兩種炎癥因子的生成和多成分作用有關(guān)[35]。課題組整合計(jì)算機(jī)模擬及組學(xué)等最新技術(shù)，通過對(duì)連翹的功效成分組體內(nèi)外不同層次的系統(tǒng)研究確定了連翹的主要藥效成分及其在清熱和解毒功效方面起多靶點(diǎn)協(xié)同增效的作用，提示在連翹藥材提取過程中對(duì)于連翹的揮發(fā)油和提取物都應(yīng)盡可能提取，以保證藥效的最大程度發(fā)揮。

此外，課題組還對(duì)大黃在治療便秘時(shí)的功效成分組進(jìn)行了研究。大黃作為傳統(tǒng)的瀉下藥，治療便秘十分有效。其主要成分大黃游離蒽醌、結(jié)合蒽醌、大黃鞣質(zhì)和大黃多糖，然而哪種成分才是大黃治療便秘的有效成分卻不清楚。課題組建立大鼠便秘模型，分別給藥大黃游離蒽醌、結(jié)合蒽醌、大黃鞣質(zhì)和大黃多糖，進(jìn)行形態(tài)學(xué)、病理學(xué)觀察及胃腸激素測(cè)定，進(jìn)行大黃治療便秘的藥效成分篩選。研究發(fā)現(xiàn)，大黃含有的多種成分，其中大黃結(jié)合蒽醌有瀉下的作用能治療便秘，而鞣質(zhì)有止瀉作用。因此，大黃在長(zhǎng)期應(yīng)用的過程中，容易引起繼發(fā)性便秘。若在臨床上使用不含大黃鞣質(zhì)的藥品，可能降低其不良反應(yīng)的發(fā)生率。因此，課題組以大黃結(jié)合蒽醌含量為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量考察，進(jìn)行了工藝優(yōu)化，并提出一種以疾病為基礎(chǔ)、以藥效為指導(dǎo)的中藥有效成分研究方法來(lái)進(jìn)行中藥質(zhì)量控制[36]。

4 結(jié)語(yǔ)

在中藥的系統(tǒng)研究中，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的確定是整個(gè)研究的核心所在。藥效物質(zhì)基礎(chǔ)確定，藥材品種、栽培、采收、炮制、配伍、貯藏等各環(huán)節(jié)才有了客觀的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，而中藥的質(zhì)量可控后才能談安全性和有效性問題。是藥三分毒，在機(jī)體不需要的情況下，再好的藥也會(huì)產(chǎn)生毒副作用。功效成分組概念的提出，將有助于中藥的標(biāo)準(zhǔn)化研究。對(duì)于不同功效成分的提取不僅有助于“辨證施治”的中醫(yī)藥理論發(fā)展，同時(shí)能幫助去除與疾病無(wú)關(guān)的成分或有害成分，并能充分利用中藥資源，有利于綠色中藥的持續(xù)發(fā)展。

[1]薛燕, 雷躋九.中藥復(fù)方霰彈理論——論中藥復(fù)方現(xiàn)代研究方法[M].北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社, 1996.4.

[2]周俊.中藥復(fù)方——天然組合化學(xué)庫(kù)與多靶作用機(jī)理[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1998,18(2):67.

[3]馬增春,高月,譚洪玲,梁乾德, 王升啟.用分子中藥組學(xué)技術(shù)研究四物湯補(bǔ)血的作用機(jī)理[J].世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2005, 7(3): 24.

[4]李愛秀.中藥“藥效團(tuán)藥性假說”的提出[J].天津藥學(xué), 2007,19(2): 41.

[5]彭成.試論中藥配伍研究的方法與實(shí)踐[J].中藥與臨床，2012，3(1):1.

[6]徐風(fēng),楊東輝,尚明英,王璇,蔡少青.中藥藥效物質(zhì)的“顯效形式”、“疊加作用”和“毒性分散效應(yīng)”—由中藥體內(nèi)代謝研究引發(fā)的思考[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化★思路與方法.2014, 16(4):688.

[7]張伯禮,王永炎.組分配伍研制現(xiàn)代中藥的理論與實(shí)踐--方劑關(guān)鍵科學(xué)問題的基礎(chǔ)研究[M],遼寧科學(xué)技術(shù)出版社,2010.

[8]黃熙,陳可冀.“證治藥動(dòng)學(xué)”新假說的理論與實(shí)踐[J].中醫(yī)雜志.1997,38(12)：745-747.

[9]楊奎, 蒲旭峰.論“中藥胃腸藥動(dòng)學(xué)研究”的意義及對(duì)策[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 1998, 4(1): 36.

[10]王喜軍.中藥血清藥物化學(xué)學(xué)科的形成及發(fā)展[J].世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2010，12(4): 632

[11]齊煉文, 周建良, 郝海平, 等.基于中醫(yī)藥特點(diǎn)的中藥體內(nèi)外藥效物質(zhì)組生物/化學(xué)集成表征新方法[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2010, 41 (3):195.

[12]Xue-Feng Xiao, Xiao-Li Qiao, Wen-Bin Hou, et al.Studies on pharmacokinetics of pharmacokinetic-markers in Huanglian jiedu Decoction to cerebral ischemia reperfusion model mice[J].Asian J Pharmacodyn Pharmacokinet, 2008,8(4) :287.

[13]Houfu Liu, Junling Yang, Feifei Du, et al.Absorption and disposition of ginsenosides after oral administration of Panax notoginseng extract to rats [J].Drug Metabolism &Disposition, 2009, 37 (12): 2290.

[14]喬逸,楊志福,田云,等.藥效差示血清色譜法研究紅花的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[J].中國(guó)藥師, 2010, 13(5): 624.

[15]肖培根.21世紀(jì)中藥研究的進(jìn)展方向[J].中藥研究與信息,2005,7(6):6.

[16]劉昌孝.代謝組學(xué)助推中藥現(xiàn)代研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2007，36(7) : 1.

[17]羅國(guó)安, 梁瓊麟, 王義明, 等.中醫(yī)藥系統(tǒng)生物學(xué)發(fā)展及展望[J].中國(guó)天然藥物, 2009, 7(4): 242.

[18]Jeremy K Nicholson, Jeremy R Everett, John C Lindon.Longitudinal pharmacometabonomics for predicting patient responses to therapy: drug metabolism, toxicity and efficacy[J].Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology,2012, 8(2): 135.

[19]孟憲生,姜民, 羅國(guó)安, 等.基于代謝組學(xué)的中藥川芎對(duì)寒凝血瘀證大鼠作用機(jī)制研究[J].遼寧中醫(yī)雜志, 2012, 39(2):218.

[20]Fengxia Zhang, Zhenhua Jia, Peng Gao, et al.Metabonomics study of urine and plasma in depression and excess fatigue rats by ultra fast liquid chromatography coupled with ion trap-time of flight mass spectrometry [J].Molecular BioSystems,2010, 6:852.

[21]Qiu J.‘Back to the future’ for Chinese herbal medicines [J].Nature Reviews Drug Discovery, 2007, 6(7): 506.

[22]Limin Zhang, Yangfang Ye, Yanpeng An, et al.Systems responses of rats to aflatoxin B1 exposure revealed with metabonomic changes in multiple biological matrices [J].J Proteome Res, 2011, 10：614.

[23]Andrew L Hopkins.Network pharmacology: the next paradigm in drug discovery [J].Nature Chemical Biology,2008, 4: 682.

[24]吳釘紅, 丘小惠, 朱偉, 等.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討清熱中藥治療冠心病作用機(jī)制[J].中華中醫(yī)藥雜志,2011,26(5):1004.

[25]Shao Li.Network systems underlying traditional Chinese medicine syndrome and herb formula [J].Current Bioinformatics, 2009, 4(3):188.

[26]張廷模.中藥功效學(xué)[M].人民衛(wèi)生出版社，2013.

[27]彭成.有毒中藥附子、川烏、草烏的安全性評(píng)價(jià)與應(yīng)用[M].四川科技出版社, 2014.

[28]李燕, 趙夢(mèng)杰, 袁岸，等.給藥劑量對(duì)附子總生物堿在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征的影響.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志[J],2016, 22(22): 82.

[29]Li Y, Li YX, Dang J,et al.Simultaneous Determination and Comparative Pharmacokinetics of Fuzi Water-soluble Alkaloids between Normal and Acute Heart Failure Rats by Ultra Performance Liquid Chromatography Method [J].J Chromatogr Sci, 2017, 55(7):719.

[30]賀抒,謝曉芳,張雪,等.附子水溶性生物堿對(duì)心衰細(xì)胞模型的治療作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014, 20(16):127.

[31]袁岸,李燕,羅林,等.連翹提取物對(duì)酵母和脂多糖所致大鼠發(fā)熱模型的影響研究[J].遼寧中醫(yī)雜志, 2017, 44(2):402.

[32]袁岸,羅林,龔小紅,等.連翹提取物對(duì)角叉菜膠和雞蛋清所致大鼠足腫脹的影響研究[J].遼寧中醫(yī)雜志, 20176,43(10):2200.

[33]An Yuan, Lihong Gong, Lin Luo,et al.Revealing antiinflammation mechanism of water-extract and oil of forsythiae fructus on carrageenan-Induced edema rats by serum Metabolomics [J].Biomedicine & Pharmacotherapy,2017, 95:929.

[34]黨玨,袁岸,羅林,等.連翹提取物和連翹揮發(fā)油對(duì)酵母致熱大鼠的解熱機(jī)制研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2017, 29(9): 1542.

[35]全云云,袁岸,龔小紅,等.連翹抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)篩選研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2017,29(3):435.

[36]李蕓霞,龔小紅,李燕,等.以藥效為指導(dǎo)的大黃提取工藝質(zhì)量控制策略研究,世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化★中藥研究[J],2014,16(10):2197.