馬克斯克魯維酵母菌的分離鑒定與所產(chǎn)乳糖酶酶學(xué)性能研究

岳壽松　邊斐　張燕　孫蕊蕊　齊自成　李福欣 　朱友峰

摘要：為研究開發(fā)具有應(yīng)用價(jià)值的新型微生物資源，用鄰硝基苯酚β-D-半乳糖苷 （ONPG ） 法，從雪蓮菌發(fā)酵乳中分離到一株產(chǎn)乳糖酶的酵母菌株XL-B36，通過分子鑒定，確定該菌為馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）。對(duì)該菌所產(chǎn)乳糖酶酶學(xué)性能進(jìn)行研究，該酶最適反應(yīng)溫度和最適pH值分別為47℃和7.0，在35 ～ 40℃具有良好的穩(wěn)定性。pH 5.0 ～ 8.0表現(xiàn)穩(wěn)定，pH 7.0 時(shí)出現(xiàn)酶活峰值。金屬離子Mn2+、Mg2+、Na+對(duì)酶活具有激活作用，Ca2+和Zn2+對(duì)酶活具有抑制作用，Cu2+和EDTA對(duì)酶活具有完全抑制作用。

關(guān)鍵詞：馬克斯克魯維酵母；β-半乳糖苷酶；分子鑒定；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)：S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）11-0066-06

Abstract In order to research and develop new microbial resources with applied value， a novel lactase-producing yeast XL-B36 was selected from fermented milk by ONPG method and identified as Kluyveromyces marxianus by molecular identification. The enzymatic properties of lactase produced by it were studied and the results showed that the temperature and pH value of β-galactosidase were 47℃ and 7.0， respectively. The enzyme was stable at pH 5.0～8.0，and 35～40℃. The activity of β-galactosidase was promoted by Mn2+，Mg2+ and Na+，but inhibited by Ca2+ and Zn2+. It could be completely inhibited by Cu2+ and ethylene diamine tetraacetic acid （EDTA）.

Keywords Kluyveromyces marxianus； β-galactosidase； Molecular identification； Enzymatic properties

乳糖酶即β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，又名β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），是一類催化β-D-半乳糖苷鍵發(fā)生水解的酶，能將乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，對(duì)解決人體存在的乳糖不耐受具有重要意義[1]。不同種類微生物所產(chǎn)乳糖酶性能不同，霉菌產(chǎn)生的乳糖酶最適pH偏酸性，可應(yīng)用于酸性乳清和奶酪的水解；而酵母菌和細(xì)菌所產(chǎn)乳糖酶最適pH 近中性，適于牛乳和鮮乳清的水解[2-4]。隨著對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品研究的深入，越來越多的酵母菌種、屬在各種乳制品中被檢出，包括開菲爾酸奶、蒙古酸馬奶、蘇丹發(fā)酵乳Rob、匈牙利發(fā)酵乳等[5-8]。王遠(yuǎn)微等[9]從西部牧區(qū)10份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品中鑒定出16株馬克斯克魯維酵母菌。謝婕等[10]從傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中鑒定得到馬克斯克魯維酵母17株（47.2%）、釀酒酵母6株（16.7%）、平常假絲酵母5株（13.9%）、喜仙人掌畢赤酵母4株（11.1%）、發(fā)酵畢赤酵母3株（8.3%）。馬克斯克魯維酵母具有減少食品中乳糖含量的作用，可通過發(fā)酵分解乳糖，產(chǎn)生多種羰基化合物和揮發(fā)性脂肪酸，這些芳香物質(zhì)也是形成乳制品獨(dú)特風(fēng)味的主要原因之一[10]。本試驗(yàn)從特色雪蓮菌發(fā)酵乳中分離到一株產(chǎn)乳糖酶的酵母菌株，利用18S rDNA技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定，研究酵母菌乳糖酶的特性，為挖掘利用自然界特殊功能微生物資源和開發(fā)利用乳糖酶提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

市售雪蓮菌牦牛酸奶；酵母基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自Solarbio公司；通用引物EF3 （5′-TCCTCAAATGACCAAGTTTG-3′）和EF4 （5′-GGAAGGGRTGTATTTATTAG -3′）及ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3′），由上海生物工程有限公司合成；PCR buffer、Taq酶、dNTP，購(gòu)自寶生物（大連）生物工程有限公司。

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖糖苷（X-gal，色譜純），鄰硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷 （ONPG，色譜純），購(gòu)自Bio Basic Inc公司（上海生物工程有限公司分裝）；鄰硝基苯酚 （ONP），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

ONPG磷酸鹽緩沖液制備：0.602 5 g ONPG溶于100 mL磷酸鹽緩沖溶液；pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液制備：13.6 g磷酸二氫鈉、0.06 g硫酸鎂、0.126 g氯化錳溶于1 L水；檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液制備：0.1 mol/L檸檬酸與0.2 mol/L磷酸氫二鈉混合；0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液制備：0.2 mol/L的醋酸和0.3 mol/L的醋酸鈉混合后稀釋一倍；0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液制備：0.2 mol/L的甘氨酸和0.2 mol/L的氫氧化鈉混合。PDA培養(yǎng)基制備：去皮馬鈴薯200 g加蒸餾水1 000 mL，煮沸20 ～ 30 min，2層紗布過濾，棄濾渣。葡萄糖20 g、瓊脂20 g、補(bǔ)充蒸餾水至1 000 mL，自然pH。種子培養(yǎng)基（g/L）制備：乳糖20 g、酵母膏3.5 g、蛋白胨3.5 g、 pH 6.0。發(fā)酵培養(yǎng)液制備：乳糖80 g/L，葡萄糖5 g/L，酵母膏7 g/L，尿素1.5 g/L，KH2PO4 15 g/L，MgSO4 1 g/L，MnCl2 0.1 g/L，pH 6.6 ～ 6.8。

冷凍高速離心機(jī) （美國(guó)Thermo Fisher公司）；PCR儀 （日本Takara公司）；UP200s型超聲波破碎儀 （德國(guó)Dr. Hielscher公司）；TSQ-280型立式搖床 （上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；723型可見分光光度計(jì) （上海光譜儀器有限公司）。

1.2 酵母菌分離與產(chǎn)乳糖酶篩選

將1 mL雪蓮菌牦牛酸奶加入盛有9 mL無菌生理鹽水的試管中，渦旋器振蕩混勻，制成10-1稀釋液，依次進(jìn)行梯度稀釋。選取10-4、10-5、10-6稀釋液100 μL分別涂布PDA平板，30℃培養(yǎng)48～72 h，對(duì)長(zhǎng)出疑似酵母菌的菌落（乳白或灰乳白色）顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，劃線純化至單菌落，4℃斜面保存。

乳糖酶X-gal初篩：將24 mg X-gal溶解于6 mL二甲基甲酰胺（DMF），配制成終濃度為4 mg/mL 的溶液，取該溶液200 μL涂布PDA平板，待表面干燥后，劃線接種上述挑選出來的菌株。30℃培養(yǎng)48～72 h，菌落變?yōu)樗{(lán)色的為產(chǎn)乳糖酶菌株。

1.3 β-D-半乳糖苷酶活性測(cè)定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取6支試管分別加入200 μg/mL的ONP溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足至1 mL，37℃水浴10 min。分別加入0.5 mol/L Na2CO3 4 mL。以第一只試管為空白，測(cè)OD420值。以O(shè)NP濃度（mmol/L）為縱坐標(biāo)，OD420值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 酶的發(fā)酵與提取 挑取斜面菌種，接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶 （250 mL）中，28℃、100 r/min旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)20 h。按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)液中，28℃、150 r/min旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)18 h。取4.0 mL發(fā)酵液，7 000 r/min離心5 min，傾去上清液，菌體用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液 （pH 7.0） 洗滌，7 000 r/min離心 5 min，重復(fù)洗滌兩次。加入濃度為0.1 mol/L的磷酸緩沖液（ pH 7.0，含濃度為0.5 mmol/L MgSO4，濃度為0.1 mmol/L MnCl2） 至4.0 mL懸浮菌體，置冰水浴中超聲波破碎。振幅30%，間歇破胞15 min，4℃、10 000 r/min離心5 min ，取上清液測(cè)酶活。

1.3.3 酶活性測(cè)定 取1 mL酶稀釋液，37℃水浴預(yù)熱5 min，加入已預(yù)熱至37℃含20 mmol/L ONPG磷酸鹽緩沖液1.0 mL，37℃水浴反應(yīng)10 min，立即加入0.5 mol/L Na2CO3 3 mL終止反應(yīng)，測(cè)OD420值。以65℃加熱失活的酶液作為空白對(duì)照。一個(gè)酶活力單位（U）定義為：37℃條件下，水解1 min產(chǎn)生1 μmol ONP 所需要的酶量。X= （C×20×N）/10。其中，X為乳糖酶活力；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的ONP濃度；N為稀釋倍數(shù)。

1.4 18S rDNA基因的克隆、測(cè)序

采用酵母基因組DNA提取試劑盒提取DNA，利用通用引物EF3、EF4 和ITS1、ITS4分別擴(kuò)增酵母菌18S rDNA 和ITS序列。PCR反應(yīng)體系 （20 μL）：超純水13.4 μL，10 × PCR buffer 2 μL，dNTP 0.3 μL，引物各1 μL，Taq酶0.3 μL，DNA 2 μL。PCR擴(kuò)增條件為：①94℃ 5 min；94℃ 45 s，51℃ 1 min，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。② 95℃ 5 min；95℃ 45 s，60℃ 1 min，72℃ 1 min ，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，交由華大基因（武漢）中心測(cè)序。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

在NCBI網(wǎng)站對(duì)測(cè)得的18S rDNA 和ITS分別進(jìn)行序列間的BLAST分析或通過DNAMAN 6.0進(jìn)行序列相似性分析。利用Mega 3.1軟件中的Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算各序列間距離，采用鄰位相連法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 β-D-半乳糖苷酶酶學(xué)性能

1.6.1 最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性 最適反應(yīng)溫度：取9份200 μL磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）稀釋的酶液分別于30、35、37、40、45、47、50、55、57℃保溫5 min，同時(shí)將9份200 μL ONPG溶液分別在上述溫度下保溫5 min后加入到酶液中，在各溫度下反應(yīng)10 min，加入0.5 mol/L Na2CO3 600 μL終止反應(yīng)。計(jì)算各溫度酶活與最高酶活百分比，確定酶最適反應(yīng)溫度。

酶的熱穩(wěn)定性：將200 μL磷酸鹽緩沖液稀釋的酶液，分別于35、40、45、50、55℃保溫0、20、40、60、80 min。同時(shí)將200 μL ONPG溶液分別在上述溫度下保溫 0、20、40、60、80 min，將ONPG加入到粗酶液中，37℃反應(yīng)10 min，加入0.5 mol/L Na2CO3 600 μL終止反應(yīng)，測(cè)OD420值，以65℃加熱失活的酶液作為空白對(duì)照，以保溫開始時(shí)酶活為100%，計(jì)算各時(shí)間酶活與最高酶活百分比。

1.6.2 最適pH值和pH穩(wěn)定性 最適pH值：分別配制pH 2.0～10.0的緩沖液 （pH 2.0～3.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、pH 4.0～5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液、pH 6.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、pH 9.0～10.0的0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液），在最適溫度下，按1.3.3酶活測(cè)定方法，測(cè)定pH 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0和10.0條件下酶活性。計(jì)算各pH酶活與最高酶活百分比，確定酶最適反應(yīng)pH值。

pH穩(wěn)定性：將酶液分別置于pH為3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0和10.0的緩沖溶液中，37℃保溫60 min后置冰上，然后將pH值調(diào)回至7.0，測(cè)定各pH條件下的酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算各pH酶活與最高酶活百分比，測(cè)定酶的pH穩(wěn)定性。

1.6.3 金屬離子和EDTA對(duì)酶活的影響 在酶促反應(yīng)體系中加入1 mol/L的Mn2+、Mg2+、Na2+、K2+、Ca2+、Cu2+ 、Zn2+、EDTA溶液，使最終反應(yīng)體系中金屬離子濃度為1 mmol/L。以加熱失活的酶液作為空白對(duì)照，不加金屬離子和EDTA溶液的酶活作為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌產(chǎn)乳糖酶能力篩選與菌種鑒定

利用PDA平板進(jìn)行酵母菌分離培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)出的酵母菌利用X-gal培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)乳糖酶能力篩選，得到一株產(chǎn)酶能力強(qiáng)的酵母菌株XL-B36，菌體在PDA培養(yǎng)基呈圓形或橢圓形，菌體直徑2.8～5.0 μm，芽殖。

測(cè)序結(jié)果表明，XL-B36菌株18S rDNA序列全長(zhǎng)1 690 bp，符合預(yù)期值。BLAST顯示與大多數(shù)克魯維酵母屬（Kluyveromyces）聚成一族，同源性為99%。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示與鑒定為馬克斯克魯維酵母聚為一族，因此鑒定XL-B36菌株為馬克斯克魯維酵母（圖1）。

2.2 ONPG標(biāo)準(zhǔn)曲線

以光密度OD420值為橫坐標(biāo)，ONP 濃度為縱坐標(biāo)繪制乳糖酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R2=0.998（圖2），說明該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于乳糖酶的測(cè)定。

2.3 XL-B36乳糖酶最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性

在30～47℃范圍內(nèi)，乳糖酶活性隨溫度升高而增加，47℃條件下活性最高，之后隨溫度升高活性快速下降，55℃降至最高酶活的34.3%，至57℃已檢測(cè)不到酶活（圖3）。因此乳糖酶的最適反應(yīng)溫度為47℃。

乳糖酶活性在35℃和40℃具有較好的穩(wěn)定性，保溫80 min，相對(duì)酶活仍保持60%以上。45℃穩(wěn)定性下降，50℃穩(wěn)定性快速下降，處理20 min降至最高酶活的50%以下（48.6%），40 min酶活僅為最高酶活的31.1%。說明該酶對(duì)熱敏感（圖4）。

2.4 XL-B36乳糖酶最適pH與pH穩(wěn)定性

測(cè)定酶在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0的活性變化，以最高酶活為100%計(jì)算不同pH條件下的相對(duì)酶活。結(jié)果表明乳糖酶酶活在pH 5 ～ 10范圍內(nèi)為單峰曲線變化，最適pH為7.0（圖5）。pH 4.0時(shí)檢測(cè)不到酶活性，在5.0 ～ 8.0 范圍內(nèi)比較穩(wěn)定（圖6）。

2.5 金屬離子和EDTA對(duì)乳糖酶活性的影響

Mn2+、Mg2+、Na+對(duì)酶活有明顯的激活作用，Ca2+和Zn2+對(duì)酶活具有抑制作用，Cu2+和EDTA對(duì)乳糖酶活具有完全抑制作用（表1）。

3 討論與結(jié)論

酵母菌是目前工業(yè)化生產(chǎn)乳糖酶的主要菌種資源。本研究從傳統(tǒng)雪蓮菌發(fā)酵乳中分離到一株產(chǎn)乳糖酶的酵母菌，克隆該菌的18S rDNA序列，序列全長(zhǎng)1 690 bp，BLAST顯示該菌株在進(jìn)化關(guān)系上與克魯維酵母屬聚成一族，鑒定為馬克斯克魯維酵母 （XL-B36）。XL-B36乳糖酶最適反應(yīng)溫度為47℃，之后隨溫度升高乳糖酶活性快速下降，至57℃已檢測(cè)不到酶活；該酶在35～40℃有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，高于45℃穩(wěn)定性快速下降。XL-B36乳糖酶最適pH為7.0，在5.0～8.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定。金屬離子Mn2+、Mg2+、Na+對(duì)酶活有明顯的激活作用，Ca2+和Zn2+對(duì)酶活具有抑制作用，Cu2+和EDTA對(duì)乳糖酶活性具有完全抑制作用。

金屬離子對(duì)酶活具有調(diào)節(jié)作用，謝毅等[12]的研究表明，高濃度金屬離子對(duì)乳酸克魯維酵母乳糖酶活性具有抑制作用，Ca2+對(duì)酶的抑制可以被磷酸鹽、脫脂乳以及Mg2+、Mn2+所恢復(fù)。母智森[13]研究發(fā)現(xiàn)分離自乳制品的馬克斯克魯維酵母STK-1-1所產(chǎn)乳糖酶最適pH為6.5，酶的最適作用溫度范圍為35～45℃，Cu2+、Ca2+對(duì)酶的活力有抑制作用，K+、Na+、Mg2+對(duì)酶有激活作用。XL-B36與STK-1-1所產(chǎn)的乳糖酶相比，最適pH略有不同（6.5和7.0），最適溫度范圍和金屬離子對(duì)酶活的影響基本相同。李文婷等[2]研究了凝結(jié)芽孢桿菌RY237 β-半乳糖苷酶酶學(xué)性能，其最適反應(yīng)溫度和最適pH值分別為50℃和6.0，金屬離子Ca2+、K+、Zn2+、Mn2+、Na+、Mg2+對(duì)酶活具有抑制作用，Cu2+對(duì)酶活具有完全抑制作用，而EDTA對(duì)酶活具有激活作用。李淑娟[14]研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉乳糖酶DL116酶促反應(yīng)最適溫度為60℃，最適pH 3.2～4.0，該酶在pH 2.5～9.0范圍較穩(wěn)定，在pH 7.5～9.0處理2 d仍保持最大酶活的94%以上，表明該酶具有很好的耐堿性。不同種類微生物產(chǎn)乳糖酶性能有很大差異，是乳糖酶開發(fā)應(yīng)用的重要理論依據(jù)。本研究馬克斯克魯維酵母乳糖酶最適pH值為7.0，最適作用溫度范圍為35～45℃，適宜商業(yè)化應(yīng)用。后續(xù)將研究乳糖酶代謝調(diào)控機(jī)制。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Husain Q. β- galactosidases and their potential applications： a review[J]. Critical Reviews in Biotechnology， 2010， 30（1）： 41-62.

[2] 李文婷， 邊斐， 王翠萍， 等. 凝結(jié)芽孢桿菌RY237 β-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 食品工業(yè)科技， 2017， 38（14）： 111-115.

[3] 張明麗， 熊華， 齊金峰， 等. 乳酸克魯維酵母乳糖酶性質(zhì)的研究[J]. 中國(guó)乳品工業(yè)， 2008， 36（1）： 7-9.

[4] Mlichova Z， Rosenberg M. Current trends of β-galactosidase application in food technology[J]. Journal of Food and Nutrition Research， 2006， 45（2）： 47-54.

[5] Simova E， Beshkova D， Angelov A， et al. Lactic acid bacteria and yeasts in kefir grains and kefir made from them[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology， 2002， 28（1）：1-6.

[6] Latorre-García L， del Castillo-Agudo L， Polaina J. Taxonomical classification of yeasts isolated from kefir based on the sequence of their ribosomal RNA genes[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2007， 23（6）： 785-791.

[7] Bai M， Qing M， Guo Z， et al. Occurrence and dominance of yeast species in naturally fermented milk from the Tibetan Plateau of China[J]. Canadian Journal of Microbiology， 2010， 56（9）： 707-714.

[8] 王和平， 王鋰韞， 李少剛， 等. 類開菲爾粒中乳酸菌和酵母菌的分離鑒定及生物學(xué)特性[J]. 中國(guó)乳品工業(yè)， 2004， 32（12）： 3-6.

[9] 王遠(yuǎn)微， 張誠(chéng)民， 索化夷， 等. 傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中馬克斯克魯維酵母菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].食品科學(xué)， 2014， 35（15）： 216-220.

[10]謝婕， 趙欣， 騫宇， 等. 傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中酵母菌的分子生物學(xué)鑒定[J]. 食品科學(xué)， 2015， 36（11）： 114-118.

[11]Fonseca G G， Heinzle E， Wittmann C， et al. The yeast Kluyveromyces marxianus and its biotechnological potential[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2008， 79（3）： 339-354.

[12]謝毅， 江培翝， 郭杰炎. 乳酸克魯維酵母（Kluveromces lactis）β-半乳糖苷酶的穩(wěn)定性研究[J]. 復(fù)旦學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 1999， 38（5）： 524-528.

[13]母智森. 乳糖酶高活力酵母菌株的篩選及酶的特性研究[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2002.

[14]李淑娟. 黑曲酶乳糖酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2007.