辣木葉渣中非水溶性蛋白及酶解效果研究

施婭楠，和麗菊，趙存朝，黃艾祥

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

辣木（Moringa oleifera Lam.）是一種多年生木本植物，原產(chǎn)于印度西北部，具有生長(zhǎng)速度快、耐高溫、耐旱的特點(diǎn)[1-4]，辣木以其高蛋白質(zhì)、低脂肪、高纖維素、維生素的健康特性和降血糖、抗菌消炎、強(qiáng)心的保健效果而成為健康食品界的新寵，2012年被中國(guó)綠色食品發(fā)展中心認(rèn)定為“國(guó)家首推綠色食品”，如今在發(fā)展中國(guó)家廣泛種植[5-10]。辣木蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白，葉中蛋白含量在27%～37%，其中約80%谷蛋白，14%醇溶蛋白，3.5%白蛋白和1%球蛋白[11]，因此，約90%以上的葉蛋白為非水溶性的谷蛋白和醇溶蛋白，谷蛋白分子內(nèi)存在巰基和分子之間的二硫鍵，結(jié)構(gòu)決定其不溶于中性鹽溶液而只溶于稀酸、稀堿；醇溶蛋白疏水性較強(qiáng)，使得辣木蛋白在弱堿提、弱酸提或鹽溶后仍被保留在葉中[12]，因此，辣木蛋白溶解、乳化性能不佳等原因，多作為動(dòng)物飼料使用，造成蛋白資源的極大浪費(fèi)[13]。酶法可破壞蛋白質(zhì)與其他非水溶性物質(zhì)結(jié)合，且蛋白多肽鏈可水解為短肽鏈從而提高蛋白質(zhì)溶解性，并對(duì)其他功能特性產(chǎn)生一定的作用[14-18]。本研究從蛋白資源開(kāi)發(fā)和辣木葉資源的充分利用兩方面考慮，開(kāi)展從辣木葉渣中提取非水溶蛋白，旨在能將蛋白充分提取并適當(dāng)改性后，增強(qiáng)蛋白消化吸收性、以期加工成食用乳化劑、起泡劑、膠凝劑和多肽類產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料

辣木葉粉：云南德宏州天佑科技開(kāi)發(fā)有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、R-250、甘油、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、TEMED、Tris-Hcl、溴酚藍(lán)（分析純）、果膠酶（500 U/mg）、木聚糖酶（6 000 U/mg）、復(fù)合植物水解酶（200 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）：Sigma公司；鹽酸（食品級(jí)）：北京化工試劑廠。

1.2 儀器

UV765PC紫外分光光度計(jì)、DHG-9070A真空冷凍干燥機(jī)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器公司；TGL20M高速冷凍離心機(jī)：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；超聲波萃取儀：上海力申科學(xué)儀器有限公司；Bio-rad 164-5052電泳儀：BIO-RAD；I99161pH計(jì)：納沃德儀器（北京）有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：海博訊實(shí)業(yè)有限公司；8-2磁力攪拌器：北京世紀(jì)陽(yáng)光科技發(fā)展有限公司；XH微型漩渦混合器：上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

辣木葉渣的制備為了最大可能地去除辣木葉水浸出物，去除水溶性蛋白質(zhì)，采用0.08 mol/L堿液提取，料液比1∶80（g/mL）提取浸提2次，每次超聲時(shí)間30 min，測(cè)蛋白含量，葉渣55℃烘干保存；葉渣在最適酶解條件下4℃渦旋振蕩10 min，真空濃縮至原10倍體積，加入濃縮液4倍體積的75%預(yù)冷乙醇溶液，-4℃沉淀過(guò)夜，真空冷凍干燥得辣木蛋白干粉（-20℃保藏）。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以辣木葉渣蛋白質(zhì)的提取率為指標(biāo)，研究水解酶種類、酶用量、酶解溫度、時(shí)間4個(gè)因素變量。設(shè)置酶種類為果膠酶、復(fù)合植物水解酶、木聚糖酶、堿性蛋白酶；酶用量 0.3%、0.8%、1.3%、1.8%、2.3%；酶解溫度 40、45、50、55、60 ℃；酶解時(shí)間 40、50、60、70、80 min。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以酶的添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度為試驗(yàn)因素，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化辣木葉渣蛋白提取率的工藝參數(shù)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平Table 1 Level of experimental factors

1.3.4 蛋白質(zhì)提取率

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（μ/g）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在波長(zhǎng)595 nm處繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如下：

式中：C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為提取液稀釋倍數(shù)；M為辣木葉渣質(zhì)量，g。

1.3.5 SDS-PAGE凝膠電泳

1.3.5.1 制備樣品

分別取100 mg辣木葉蛋白質(zhì)干粉樣品溶解在100 mL，100 mmol/L，pH6.5的磷酸緩沖溶液中，加入0.1%的NaN3，低溫加熱，漩渦振蕩3 min使之溶解，離心（8 000 r/min，2 min），備用。

1.3.5.2 配制5×電泳緩沖液、固定液、染色液、脫色液等電泳使用相關(guān)溶液

將配置好的樣品和上樣緩沖液混合，按樣品：載樣液=4∶1（體積比）的比例配制成1 mL的溶液后搖勻，沸水浴加熱10 min制得電泳樣，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.3 配膠

取綠色夾板固定薄厚玻璃板，支架固定好夾板，準(zhǔn)備裝分離膠和濃縮膠（預(yù)試驗(yàn)確定分離膠濃度為15%），制備分離膠時(shí)小心避免產(chǎn)生氣泡，迅速在膠上部加超純水，使凝膠表面變得平整，待膠凝固30 min，棄去水層用濾紙將多余的水吸干，灌注濃縮膠，直至凝膠溶液達(dá)到玻璃板的頂端，立即插入梳子，待膠凝固30min。

1.3.5.4 電泳

移液槍小心將蛋白marker、電泳樣依此加入到凹槽內(nèi)，加入適量的5×電泳緩沖液，鏈接電源，設(shè)定濃縮膠電泳條件為50 V恒壓30 min，分離膠電泳條件為120 V恒壓約1 h，等溴酚藍(lán)跑至凝膠底部，關(guān)閉電源。

1.3.5.5 電泳膠片的處理

電泳結(jié)束，取下膠片，依次對(duì)電泳膠片進(jìn)行固定、染色、脫色、掃描分析。

固定：電泳結(jié)束，將電泳膠片從夾板上取出，切去濃縮膠后，放入30%的乙醇溶液中固定30 min。染色：將固定好的膠片，轉(zhuǎn)移到考馬斯亮藍(lán)G-250染液中染色，放置于搖床上均勻染色，5 h。脫色：染色結(jié)束后，用20%的甲醇或超純水進(jìn)行脫色，多次洗脫至條帶清晰可見(jiàn)。掃描：將脫色后的膠，放在掃描儀上掃描，放膠時(shí)注意避免產(chǎn)生氣泡。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取工藝參數(shù)

2.1.1 酶種類對(duì)蛋白提取率的影響

不同水解酶對(duì)辣木殘?jiān)鞍滋崛〉挠绊懸?jiàn)圖1。

圖1 不同種類酶對(duì)殘?jiān)鞍滋崛÷实挠绊慒ig.1 The effect of enzyme species on the residual protein extraction rate

由圖1可知，不同水解酶對(duì)辣木葉渣蛋白質(zhì)提取率的影響：堿性蛋白酶>木聚糖酶＞復(fù)合植物水解酶＞果膠酶，由于不同種類的水解酶的作用于蛋白質(zhì)的機(jī)理和酶催化動(dòng)力學(xué)特征不同導(dǎo)致提取效果有明顯不同。堿性蛋白酶的提取效果在所選4種酶制劑中最好，提取率達(dá)36.4（mg/g），辣木葉中多糖含量極高，堿性蛋白酶可使葉渣中多糖結(jié)構(gòu)變得松散，對(duì)蛋白質(zhì)和多糖的分離起到了促進(jìn)作用[17]，同時(shí)堿性蛋白酶是一種內(nèi)切肽酶，能夠水解多種蛋白，提取率相對(duì)較高，且售價(jià)合理。所以，本試驗(yàn)采用堿性蛋白酶。

2.1.2 酶的添加量對(duì)蛋白提取率的影響

酶添加量對(duì)辣木殘?jiān)鞍滋崛〉挠绊懸?jiàn)圖2。

圖2可知，堿性蛋白酶用量1.8%（E/S）時(shí)，提取率達(dá)34.7（mg/g）。隨著酶用量的增加，提取率反而下降，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)受到酶的過(guò)度水解，空間結(jié)構(gòu)受到破壞，與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合的疏水區(qū)減少，所以酶用量提高而蛋白提取率下降。同時(shí)，把已水解的蛋白質(zhì)水解成更小的肽[20]，而蛋白質(zhì)含量并沒(méi)有增加，提取率反而降低。

圖2 酶添加量對(duì)殘?jiān)鞍滋崛〉挠绊慒ig.2 The effect of enzyme dosage on the residual protein extraction rate

2.1.3 酶解溫度對(duì)蛋白提取率的影響

酶解溫度對(duì)辣木殘?jiān)鞍滋崛〉挠绊懸?jiàn)圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)殘?jiān)鞍滋崛〉挠绊慒ig.3 The effect of enzyme hydrolysis temperature on the residual protein extraction rate

在堿性蛋白酶用量1.8%（E/S）的條件下提取蛋白質(zhì)，該酶理論最適作用溫度為50℃～60℃，由圖3可知，本試驗(yàn)最適作用溫度為55℃，溫度繼續(xù)升高時(shí)，酶活性降低，蛋白提取率降低，當(dāng)溫度高于55℃，尤其是具有催化活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，易變性，同時(shí)由于疏水基團(tuán)的暴露和展開(kāi)、蛋白質(zhì)分子的聚集，使葉渣中的蛋白質(zhì)溶解度下降，導(dǎo)致酶提時(shí)蛋白質(zhì)提取率下降[12]。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)殘?jiān)鞍滋崛÷实挠绊慒ig.4 The effect of enzyme hydrolysis time on the residual protein extraction rate

在堿性蛋白酶用量1.8%（E/S），酶解溫度55℃的條件提取蛋白質(zhì)，由圖4可知，提取的時(shí)間越長(zhǎng)，提取率越高，在60 min～70 min內(nèi)，增長(zhǎng)速率很快；當(dāng)時(shí)間達(dá)到70 min后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的提取率變化不大，且緩慢減低，蛋白酶催化植物蛋白質(zhì)水解時(shí)是通過(guò)催化肽鍵的斷裂來(lái)發(fā)揮作用的，其作用于肽鏈內(nèi)部的肽鍵，生成長(zhǎng)度較短的多肽鏈，使得大分子蛋白的質(zhì)量降低，得到小分子蛋白[16]。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化辣木蛋白的提取率參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表2進(jìn)行多元回歸擬合，得到辣木蛋白提取率對(duì)X1酶的添加量（%）、X2酶解時(shí)間（min）、X3酶解溫度（℃）的回歸模型方差分析表。模型的方差分析結(jié)果如表3所示。

利用Design-Expert 8.06軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到蛋白質(zhì)提取率X1酶的添加量（%）、X2酶解時(shí)間（min）、X3酶解溫度（℃）的回歸模型方程為：蛋白提取率Y=36.63-0.35X1-0.53X2-1.08X3-0.20X1X2+0.12X1X3-0.35X2X3-4.22X12-1.87X22-3.68X32。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results

從方差分析可以看出，回歸模型F=174，97，P＜0.01，表明二次多元回歸模型顯著；失擬項(xiàng)F=0.78，P=0.560 3＞0.05，模型失擬不顯著，說(shuō)明未知因素對(duì)結(jié)果的影響非常小，試驗(yàn)誤差主要來(lái)源于隨機(jī)誤差。回歸診斷表明，決定系數(shù)R2=0.439 5，信噪比Adeq precisior=24.326。這表明方程的擬合和可信度高，可用于預(yù)測(cè)辣木中可溶性蛋白的提取。CV（Y變異系數(shù)）表示試驗(yàn)本身的精度，CV值越小，試驗(yàn)的可靠性越高，本試驗(yàn)中CV比較低，為0.28%，表明試驗(yàn)操作的可信度高，具有實(shí)用性指導(dǎo)意義。通過(guò)回歸系數(shù)的絕對(duì)值分析了每個(gè)因素對(duì)辣木蛋白提取變化的影響，檢驗(yàn)可知：X22的影響顯著（P＜0.01），X12，X32的影響極顯著（P＜0.001）。據(jù)F值可知，各個(gè)因素對(duì)辣木蛋白的提取率影響的大小順序?yàn)椋篨3酶解溫度＞X1酶的添加量＞X2酶解時(shí)間。

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件

X1酶的添加量（%）、X2酶解時(shí)間（min）、X3酶解溫度（℃）可以通過(guò)觀察圖5中的響應(yīng)面的變化和輪廓線的稀疏度來(lái)衡量蛋白提取率的影響。當(dāng)輪廓為圓形時(shí)，兩個(gè)因素之間的相互作用不顯著，而橢圓形或鞍形形狀顯示兩個(gè)因素之間的相互作用是顯著的。各因素交互作用對(duì)辣木蛋白提取影響的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5。

圖5可以表明：交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3影響極顯著（P＜0.01）。而且 X1、X2、X3之間的相互作用的變化是陡峭的，表明每個(gè)因素對(duì)辣木提取率的影響大，與方差分析一致。其中等高線呈名的橢圓形和馬蹄形，說(shuō)明這4個(gè)因數(shù)的相互作用是顯著的，對(duì)辣木蛋白的提取率影響較大。

圖5 各因素交互作用對(duì)辣木蛋白提取影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graph interactive effects of various factors on the protein extract of Moringa oleifera

2.2.4 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

通過(guò)響應(yīng)面法得到辣木葉渣中蛋白的最佳提取工藝為堿性蛋白酶添加量1.4%，酶解溫度為54.5℃，酶解時(shí)間為68.4 min，此條件提取率為（35.88±1.73）mg/g。實(shí)際操作中稍作調(diào)整確定的最佳工藝條件為堿性蛋白酶添加量1.8%，酶解溫度為55℃，酶解時(shí)間為70 min，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的蛋白提取率為（34.92±1.42）mg/g與理論值接近，說(shuō)明模型與實(shí)際相符，具有實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。

2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

辣木葉總蛋白質(zhì)在非還原條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜見(jiàn)圖6，酶解后蛋白電泳圖譜見(jiàn)圖7。

圖6 總蛋白的電泳圖Fig.6 Electrophoresis profiles of total proteins

酶解前在高分子區(qū)域有25 KD～100 KD蛋白譜帶，其中55 KD～100 KD屬于高分子量醇溶蛋白，75%預(yù)冷乙醇條件下部分醇溶蛋白被提取出來(lái)[22-23]。25 KD～55 KD譜帶為低分子量谷蛋白，其中25 KD～30 KD，55 KD為主要辣木葉谷蛋白，0.08 mol/L堿液可以將此部分蛋白提取出來(lái)，圖6區(qū)域顯示的蛋白可能是通過(guò)分子間二硫鍵交鏈形成的，使得這部分蛋白質(zhì)在水或0.15 M氯化鈉提取過(guò)程中不能溶出[22-23]。

酶解條件下的凝膠電泳條帶見(jiàn)圖7。

圖7 酶解后蛋白電泳圖譜Fig.7 Electrophoresis profiles of the protein after enzymatic hydrolysis

通過(guò)添加量為1.8%的堿性蛋白酶，辣木葉中非水溶性蛋白在酶解過(guò)程中發(fā)生降解，形成分子在15 KD以下的小分子蛋白，其原因是，酶法可破壞蛋白質(zhì)與其他非水溶性物質(zhì)結(jié)合，且蛋白多肽鏈可水解為短肽鏈從而提高蛋白質(zhì)溶解性，并且降解成為原先不存在的小分子蛋白。

3 結(jié)論

響應(yīng)面分析法建立辣木葉渣中非水溶性蛋白提取的二次回歸模型，建立的最佳參數(shù)為堿性蛋白酶添加量1.8%，酶解溫度為55℃，酶解時(shí)間70 min，提取率為（34.92±1.42）mg/g。電泳結(jié)果顯示疏水作用、二硫鍵連同其它形式的共價(jià)鍵共同作用，使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集導(dǎo)致溶解性降低，酶解后蛋白質(zhì)高分子量亞基的谷蛋白和醇溶蛋白基本消失，在低分子區(qū)域形成15 KD以下的蛋白譜帶。

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