家兔HSL基因多態(tài)性及其與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)性分析

鄺良德，任永軍，謝曉紅，雷 岷，李叢艷，鄭 潔，郭志強(qiáng)，張翔宇，張翠霞，楊 超

（四川省畜牧科學(xué)研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066）

激素敏感性脂肪酶（Hormone Sensitive Lipase，HSL）主要負(fù)責(zé)分解脂肪組織中的甘油三酯，并釋放出游離脂肪酸，是調(diào)控脂肪分解代謝的重要因素，同時，也是影響動物機(jī)體脂肪沉積的關(guān)鍵酶之一[1]。HSL的活性受到復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)機(jī)制調(diào)控影響，在機(jī)體不同生理狀態(tài)條件下，動物自身會產(chǎn)生不同激素平衡狀態(tài)，從而影響HSL的活性大小，并且其作用機(jī)理都會發(fā)生相應(yīng)變化。HSL基因的克隆和研究最早是在大鼠中進(jìn)行的，隨后研究人員檢測到該基因在人類、小鼠和豬中也存在[2-4]。HSL基因主要在脂肪組織、卵巢、心臟、腎上腺、平滑肌和骨骼肌中表達(dá)[5]。正常情況下，HSL在動物體內(nèi)存在有活性、無活性兩種形式，而且其活性受到磷酸化或者去磷酸化作用調(diào)控。由于HSL基因在染色體上所處的位置和在脂肪代謝過程中發(fā)揮著重要作用，許多研究者都認(rèn)為HSL基因是脂肪沉積和代謝相關(guān)性狀的重要候選基因[6-8]。

HSL基因在畜禽脂肪沉積中發(fā)揮著重要作用，引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，在豬、牛、羊等畜禽上對HSL基因多態(tài)性及其對生產(chǎn)性狀的影響進(jìn)行了大量研究[9-15]。但是，在兔上并沒有關(guān)于HSL基因多態(tài)性方面的相關(guān)研究報道。因此，本研究采用PCR-SSCP和直接測序技術(shù)相結(jié)合，以齊卡巨型白兔和齊興肉兔為實驗材料，研究HSL基因第1外顯子區(qū)域遺傳多態(tài)性，并探討該基因?qū)@兩個不同品種肉兔部分生產(chǎn)性狀的影響，為下一步利用分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）進(jìn)行肉兔新品種培育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及DNA提取 選取齊卡巨型白兔、齊興肉兔每個品種35日齡斷乳仔兔各150只組建實驗群體，所有實驗兔在相同飼養(yǎng)管理條件下飼喂至84日齡，整個試驗期間自由采食、飲水，于84日齡分別隨機(jī)選取齊卡巨型白兔90只、齊興肉兔98只進(jìn)行屠宰，測定其部分生產(chǎn)性狀（包括活體重、屠宰率、滴水損失等），同時采集血液樣品，EDTA抗凝后冰盒帶回實驗室。按照Axygen血液DNA提取試劑盒說明書操作流程提取基因組DNA，經(jīng)檢測合格后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

1.2.1 引物序列設(shè)計和PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中查詢的兔HSL基因DNA序列（NW_003159415.1）自行設(shè)計引物，擴(kuò)增HSL基因部分外顯子1區(qū)域，引物序 列：HSL-F：5'- GCAAGAAACATCCACCACA-3'；HSL-R：5'- TGTCCCGACATCCCTTCA-3'。擴(kuò)增片段長度為213 bp，引物公司合成。

PCR反應(yīng)總體系為25 μL，其中2.5 mmol/L dNTP Mix 2 μL、PCR Buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl21.5 μL、基因組 DNA 2 μL、5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.125 μL、10 μmol/L 正反向引物各 1 μL、滅菌去離子水 14.875 μL。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32個循環(huán)；最后72℃充分延伸10 min，4℃保存。

PCR 反 應(yīng) 結(jié) 束 后， 取 PCR 產(chǎn) 物 4 μL 和 1 μL 6×Loading Bufffer混合后加入含 0.1% Goldview DNA 染料的1.5%瓊脂糖凝膠上樣孔中，120 V 電壓電泳35 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.2 PCR-SSCP分析 利用該引物擴(kuò)增齊卡巨型白兔和齊興肉兔所有血液樣本DNA，反應(yīng)條件和反應(yīng)體系同1.2.1，反應(yīng)完成后，取4 μL PCR產(chǎn)物與8 μL變性劑（體積分?jǐn)?shù)95%的去離子甲酰胺10 mL，0.5 mol/L的EDTA（pH8.0）200 μL，溴酚藍(lán)0.025 g和二甲苯青0.025 g）混勻，98℃變性10 min，迅速冰浴10 min，放置5 min。樣品于100 g/L聚丙烯酰胺凝膠（交聯(lián)度Acr ：Bis=9:1）中，在溫度20℃、電壓10 V/cm的條件下電泳7.5 h。電泳結(jié)束后，銀染顯色并照相保存，然后再判定其基因型，并統(tǒng)計各基因型的個數(shù)。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物純化測序與分析 根據(jù)PCR-SSCP分析結(jié)果，選取不同基因型純合子個體經(jīng)膠回收試劑盒純化后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序，同時，利用DNASTAR軟件中的SwqMan程序?qū)y序結(jié)果進(jìn)行校正和BLAST分析確定SNPs。

1.3 統(tǒng)計分析 利用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件計算基因型頻率、等位基因頻率以及進(jìn)行哈代-溫伯格平衡的χ2適合性檢驗?；蛐托?yīng)分析采用如下固定模型：Yi=μ+Gi+ei，其中，Yi為個體生長性狀觀測值，μ為生長性狀的群體均值，Gi為基因型效應(yīng)，ei為隨機(jī)殘差效應(yīng)。利用SAS 8.0軟件的GLM程序分析基因型均值。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 從實驗兔血液中提取的基因組DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，利用設(shè)計合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果與預(yù)期一致，得到213 bp擴(kuò)增片段，且沒有非特異擴(kuò)增條帶，可直接用于測序反應(yīng)和PCR-SSCP分析。

圖1 HSL基因片段PCR擴(kuò)增圖

2.2 SSCP檢測結(jié)果 利用設(shè)計合成的HSL基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，共出現(xiàn)3種基因型，分別命名為AA、AB以及BB（圖2）。

圖2 不同基因型的電泳圖

2.3 序列分析結(jié)果 將HSL基因AA型和BB 型2種純合子進(jìn)行雙向測序（圖3、4），測序結(jié)果通過與GenBank中家兔HSL基因DNA序列（NW_003159415.1）進(jìn)行Blast比對分析，發(fā)現(xiàn)在家兔HSL基因第1外顯子784 bp處存在A→C的突變。

圖3 AA基因型測序圖

圖4 BB基因型測序圖

2.4HSL基因遺傳多態(tài)性分析HSL基因在不同品種家兔群體中的基因型分布，等位基因頻率見表1。在2個品種家兔群體中均檢測到3種基因型，2個品種群體的基因型頻率均為AA＞AB＞BB，AA型為優(yōu)勢基因型；等位基因頻率均為A＞B，A為優(yōu)勢等位基因?？ǚ竭m合性檢驗結(jié)果表明，齊卡巨型白兔和齊興肉兔均顯著偏離哈代-溫伯格平衡（P＜0.01）。

2.5HSL基因多態(tài)位點與生產(chǎn)性能關(guān)聯(lián)性分析 對HSL基因外顯子1多態(tài)位點與生產(chǎn)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。由表2可知，在齊卡巨型白兔中，HSL基因AA型和AB型個體的宰前活體重均顯著高于BB型個體（P＜0.05）；AA型和BB型個體的全凈膛屠宰率和半凈膛屠宰率均顯著低于AB型個體（P＜0.05）。在齊興肉兔中，HSL基因AA型個體的宰前活體重顯著高于AB型個體（P＜0.05），極顯著高于BB型個體（P＜0.01）；BB型個體的全凈膛屠宰率和半凈膛屠宰率均顯著低于AA型和AB型個體（P＜0.05），而AA型和AB型個體間差異不顯著。在2個品種中，不同基因型個體的滴水損失和剪切力差異均不顯著（P＞0.05）。實驗結(jié)果說明，HSL基因AA型對宰前活體重有一定正面影響，而AB型對全凈膛屠宰率和半凈膛屠宰率有較大影響。

3 討論與結(jié)論

HSL基因作為影響動物脂肪沉積和肉質(zhì)性狀的候選基因被廣泛應(yīng)用于動物生產(chǎn)性狀的相關(guān)研究中。雷明剛等[1]在豬上發(fā)現(xiàn)，HSL基因外顯子1的442 bp處有G→A的堿基變異，把該突變位點多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪含量、個體背膘厚、眼肌面積等性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)AG基因型和GG基因型個體之間在眼肌面積上存在顯著差異。薛慧良等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在豬HSL基因外顯子1的874 bp處存在G→A的轉(zhuǎn)換，該突變位點對豬背膘厚影響差異顯著。強(qiáng)巴央宗等[17]采用PCR-RFLP和SSCP方法檢測了藏豬外顯子1和外顯子8的突變位點，發(fā)現(xiàn)藏豬在這兩個突變位點的基因型分布均處于脂肪性地方豬和瘦肉型外種豬之間，表現(xiàn)出其品種的特異性。馬志杰等[9]在牦牛HSL基因外顯子1第70位發(fā)現(xiàn)了G→A的堿基突變，該變異導(dǎo)致所編碼的氨基酸由甘氨酸（G）變成了精氨酸（R）。柴志欣等[14]利用PCR-SSCP技術(shù)和DNA測序技術(shù)對牦牛HSL基因多態(tài)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HSL基因外顯子7第6 816處發(fā)生了堿基A→G突變，并且該突變位點對牦牛的體高、體斜長、胸圍、管圍、體重等生長發(fā)育指標(biāo)有顯著影響。劉俊霞等[12]研究發(fā)現(xiàn)，陜北白絨山羊HSL基因外顯子1具有多態(tài)性，相關(guān)分析表明，HSL基因可能是陜北白絨山羊產(chǎn)絨性狀以及胴體性狀的主效基因，或者是與控制這些性狀的主效基因相連鎖在一起。Yang等[18]在綿羊HSL基因內(nèi)含子5、外顯子9分別發(fā)現(xiàn)3、2個突變位點，采用多變量線性混合效應(yīng)模型分析發(fā)現(xiàn)這些突變位點與眼部肌肉深度（EMD）、眼部肌肉寬度（EMW）和眼部脂肪厚度（FDM）等沒有相關(guān)性?？梢?，HSL基因具有豐富的多態(tài)性，且其變異對家畜的生長發(fā)育及重要經(jīng)濟(jì)性狀可能具有顯著的遺傳效應(yīng)。

表1 2個不同品種家兔HSL基因的基因型頻率和等位基因頻率

表2 2個不同品種家兔HSL基因不同基因型與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析

本實驗利用PCR-SSCP結(jié)合測序的方法分析了齊卡巨型白兔和齊興肉兔HSL基因第1外顯子的遺傳多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)家兔HSL基因第1外顯子784 bp處存在A→C的單個堿基突變，共存在3種基因型，2個品種兔群體中基因型頻率均為AA＞AB＞BB，AA型為優(yōu)勢基因型；卡方適合性檢驗結(jié)果表明，齊卡巨型白兔和齊興肉兔均極顯著偏離哈代-溫伯格平衡。對該多態(tài)位點與部分生產(chǎn)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，在2個品種兔中，不同基因型個體的宰前活體重、全凈膛屠宰率和半凈膛屠宰率差異顯著；不同基因型個體的滴水損失和剪切力差異均不顯著。HSL基因AA型對宰前活體重有一定的正面影響，而AB型對全凈膛屠宰率和半凈膛屠宰率有較大影響。因此，初步推斷該多態(tài)位點可作為一種分子遺傳標(biāo)記用于肉兔育種，但還需要進(jìn)一步擴(kuò)大試驗群體數(shù)量進(jìn)行深入研究，以期提供更加豐富的實驗依據(jù)，更好地用于提高肉兔生產(chǎn)性狀的分子標(biāo)記輔助選擇育種，為培育肉兔新品種提供一種新思路、新方法。

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