基因組編輯技術(shù)應用于作物遺傳改良的進展與挑戰(zhàn)

王福軍，趙開軍

（1中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京100081；2廣東省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所，廣州510640）

基因組編輯技術(shù)是指可以在基因組水平上對DNA序列進行定點改造的遺傳操作技術(shù)，其在基因功能研究和改造、生物醫(yī)學和植物遺傳改良等方面都具有重大的應用價值[1-2]?？茖W家自20世紀90年代末就開始探索基因組定點編輯技術(shù)，但直到2002年，也僅在小鼠[3]和果蠅[4]等少數(shù)模式生物中實現(xiàn)了同源重組介導的基因組定點編輯，且因同源重組的效率很低，限制了其應用前景。進入21世紀后，隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究的新突破和人工核酸內(nèi)切酶（engineered endonuclease，EEN）技術(shù)的出現(xiàn)，將特異識別并結(jié)合DNA的蛋白結(jié)構(gòu)域和EEN融合，創(chuàng)造出能夠特異切割DNA序列的核酸酶（sequence-specific nucleases，SSNs），從而可以對基因組特定位點進行高效和精確的靶向編輯[5]。

圖1 SSNs介導的DSBs及其修復途徑Fig. 1 SSNs-induced DSBs and repair pathways

目前，SSNs主要包括鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）[6]、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）[7]、成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列及其相關(guān)系統(tǒng)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated Cas9，CRISPR/Cas9 system）[8]和 CRISPR/Cpf1系統(tǒng)[9]。這些 SSNs的共同特點是都能在基因組特定部位精確切割 DNA雙鏈，造成DNA 雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSBs）；而 DSBs能夠極大地提高染色體重組事件發(fā)生的概率[10]。DSBs的修復機制在真核生物細胞中高度保守，主要包括同源重組（homology- directed repair，HDR）和非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）[11]2種修復途徑（圖 1）。當存在同源序列供體DNA時，以HDR方式的修復能夠產(chǎn)生精確的定點替換或插入；而沒有供體 DNA時，細胞則通過NHEJ途徑修復[11]。因NHEJ方式的修復往往不夠精確，在 DNA鏈斷裂位置常會產(chǎn)生少量核酸堿基的插入或缺失（insertion-deletion，InDel），從而導致基因突變[11]。

SSNs自2002年出現(xiàn)以后[12]，就掀起了一股席卷全球的基因組定點編輯研究熱潮[13]。尤其是 2010年出現(xiàn)TALENs和2013年出現(xiàn)CRISPR/Cas9技術(shù)后，因它們相對簡單、精確、高效，很快被廣泛應用于醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域[2,14]。因 TALENs和CRISPR/Cas9潛在的巨大應用價值，它們相繼被《科學》雜志評為2012年和2013年的十大科學突破之一。本文將重點綜述基因組編輯技術(shù)在作物遺傳改良上的應用進展、提出基因組編輯技術(shù)應用于作物改良的一般原則，最后討論該技術(shù)應用于作物育種的機遇和挑戰(zhàn)。

1 基因組編輯技術(shù)在作物遺傳改良上的應用進展

目前，在作物遺傳改良上應用的基因組編輯技術(shù)主要包括ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas系統(tǒng)3種類型。其中 CRISPR/Cas系統(tǒng)包括 CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/C2c1[15]和 CRISPR/C2c2[16]等亞類型，但應用最多的是CRISPR/Cas9，而CRISPR/C2c1和CRISPR/C2c2尚無在作物改良上應用的報道。

上述3類基因組編輯技術(shù)均能對植物基因組進行精準的定點敲除、插入和替換，因此，其對于控制作物重要農(nóng)藝性狀基因的功能鑒定、作物重要性狀的遺傳改良具有巨大的應用潛力。相比傳統(tǒng)的常規(guī)育種，基因組編輯技術(shù)能直接對目標性狀基因進行修飾，有可能大幅度提高目標性狀聚合的精準度和加快聚合育種進程[17]。而相比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因育種，基因組編輯在靶向修飾特定基因后，能通過自交或雜交剔除外源基因以消除轉(zhuǎn)基因安全顧慮。因此，自基因組編輯技術(shù)成功應用于植物后，對該技術(shù)的優(yōu)化及在作物遺傳改良上的應用已成為世界各國和國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)公司投資與研發(fā)的重點。目前，基因組編輯技術(shù)主要集中應用于作物產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性、育性等4個方面的遺傳改良（表1）。現(xiàn)就技術(shù)類型和目標性狀分述如下。

1.1 ZFNs技術(shù)及其應用

ZFNs技術(shù)被稱為第一代基因組編輯技術(shù)。ZFN是一種人工改造而成的核酸內(nèi)切酶，由鋅指蛋白的DNA結(jié)合域和核酸內(nèi)切酶 FokⅠ的切割結(jié)構(gòu)域組成[49]。其中，DNA結(jié)合域通常由3—6個鋅指結(jié)構(gòu)域（Zinc finger domain，ZFD）串聯(lián)而成[50]。一個ZFD能特異識別DNA鏈上3個連續(xù)的核苷酸堿基，多個ZFD串聯(lián)后就能特異識別較長的核苷酸序列。FokⅠ是一種非特異性核酸內(nèi)切酶，在二聚體狀態(tài)時才有內(nèi)切酶活性[50]。因此，實際應用ZFNs打靶時，需要在靶點的兩側(cè)各設(shè)計一個ZFN。待2個ZFN結(jié)合到結(jié)合位點后，2個 FokⅠ相互作用形成二聚體，從而在靶點處切割 DNA，產(chǎn)生 DSBs[6]。2002年，ZFNs首次成功應用于果蠅內(nèi)源基因的定向突變[12]。迄今為止，ZFNs技術(shù)已成功應用于人類干細胞[51]、大鼠[52]、果蠅[53]、斑馬魚[54]、擬南芥[55]、煙草[56]和玉米[18]等生物體的基因組編輯。

在作物改良方面，ZFNs技術(shù)迄今僅在玉米性狀改良上有一例報道，即2009年《Science》報道SHUKLA等[18]利用ZFNs技術(shù)靶向突變玉米IPK1，獲得低植酸含量的玉米突變體。植酸鹽是谷物飼料的抗營養(yǎng)組分，低植酸鹽含量的谷物飼料能降低來自動物飼養(yǎng)作業(yè)所產(chǎn)生廢物流中的磷酸鹽污染。由于ZFNs的構(gòu)建難度較大，普通分子實驗室難以操作，且成本高，預測其很難廣泛應用于植物基因組編輯。

1.2 TALENs技術(shù)及其應用

TALENs是繼ZFNs之后的第二代基因組編輯技術(shù)。TALEN結(jié)構(gòu)與ZFN類似，也由DNA結(jié)合域和FokⅠ的切割結(jié)構(gòu)域融合而成[57]。TALEN的DNA結(jié)合域為天然的或經(jīng)改造的TAL效應子（TAL effector，TALE）蛋白結(jié)構(gòu)域。天然的TALEs都具有高度統(tǒng)一的結(jié)構(gòu)：即高度保守的N端和C端、中間部分的重復區(qū)。不同TALEs之間的差異主要在中間的重復區(qū)，其由33—35個氨基酸的重復單元組成，各重復單元除了第12和第13位氨基酸高度可變外，其他都高度保守，而這兩個高度可變的氨基酸組合被稱為重復可變區(qū)（repeat-variable diresidue，RVD）[58,60]。2009 年，BOCH等[59]和MOSCOU等[60]相繼破解RVDs與核苷酸堿基之間的識別密碼（即NI或 NS—A，NG—T，NN或NK—G和HD—C），由此打開了人工構(gòu)建靶向基因組任意位點TALENs的大門。TALEN的工作原理也與ZFN相似，TALE重復區(qū)的每個重復單元能特異識別一個特定的核甘酸堿基，多個重復單元串聯(lián)后就能特異識別較長的核苷酸序列。實際利用TALENs打靶時，同樣需要在靶點兩側(cè)設(shè)計一對TALENs。與ZFN相比，TALEN載體的構(gòu)建相對簡單、成本也更低、普通的分子生物實驗室都能操作；此外，TALEN技術(shù)基于重復單元與核苷酸堿基一對一的識別模式，特異性更強，靶向編輯的效率更高[61]。因此，自 2010年TALENs技術(shù)出現(xiàn)后[7,57]，便迅速取代ZFNs成為新一代的基因組編輯技術(shù)。

表1 基因編輯技術(shù)在作物遺傳改良中的應用Table 1 Application of genome editing in crop genetic improvement

TALENs技術(shù)應用于作物遺傳改良最早見于水稻。2012年，LI等[19]首次利用 TALENs技術(shù)對水稻白葉枯病感病基因Os11N3（SWEET14）啟動子中的效應蛋白結(jié)合元件（effector-binding element，EBE）進行定點編輯，有效阻止了水稻白葉枯菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae，Xoo）分泌的效應蛋白（AvrXa7和PthXo3）與Os11N3啟動子結(jié)合，使該基因不受Xoo的誘導表達，從而提高了水稻的白葉枯病抗性。隨后，TALENs技術(shù)相繼在小麥[23]、大豆[24]和馬鈴薯[25]等主要作物的重要性狀改良上獲得成功。

MLO（MILDEW-RESISTANCE LOCUS）是大麥、小麥等作物中白粉病菌成功侵染所必需的基因，該基因突變后，大麥表現(xiàn)出對白粉病菌的持久、廣譜抗性[62]。2014年，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所高彩霞團隊利用TALENs技術(shù)同時靶向突變小麥MLO的3個拷貝，獲得了3個拷貝都突變的純合突變體，該突變體小麥對白粉病菌表現(xiàn)極為顯著的抗性[23]，證明TALENs技術(shù)能對小麥這樣的多倍體植物進行定向遺傳改良。同年，美國Cellectis公司研究人員通過TALENs技術(shù)靶向突變大豆脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1A和FAD2-1B，獲得的雙基因突變體中油酸含量由 20%提高到 80%、亞油酸含量由50%降至4%，極大地改善了大豆油的品質(zhì)[24]；隨后，該公司又通過TALENs技術(shù)靶向修飾馬鈴薯的VInv，改良了馬鈴薯的耐冷藏和加工性[25]。此外，SHAN等[20]利用 TALENs技術(shù)敲除水稻品種日本睛的OsBADH2，使無香味的稻米產(chǎn)生了香味；MA等[21]利用該技術(shù)敲除水稻脂肪氧化酶基因Lox3，改良了水稻種子的耐貯藏性；BLANVILLAIN-BAUFUME等[22]利用該技術(shù)對水稻白葉枯病感病基因SWEET14啟動子中效應蛋白AvrXa7和Tal5、TalC的EBEs進行定點編輯，使感病水稻品種的白葉枯病抗性提高到中抗以上水平。

1.3 CRISPR/Cas9技術(shù)及其應用

CRISPR/Cas是細菌和古細菌抵御病毒和外源DNA入侵的適應性免疫系統(tǒng)[63]。目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為兩大類。第一大類由多個Cas蛋白組成的復合體行使生物學功能，第二大類由單個 Cas蛋白（如 Cas9、Cpf1、C2c1和C2c2）行使生物學功能[64]。CRISPR/Cas9屬于Ⅱ類，僅需要成熟的 crRNA（CRISPR-derived RNA）、tracrRNA（trans-activating RNA）和Cas9蛋白就能實現(xiàn)對外源DNA的切割[65-66]。經(jīng)人工改造的 CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由引導 RNA（single guide RNA，sgRNA）和Cas9蛋白結(jié)構(gòu)域組成。其中，sgRNA起精確定位作用，其 5′端前 20個核苷酸堿基決定Cas9蛋白特異性切割基因組DNA的部位；Cas9蛋白包含類 HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域和類RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域，分別負責切割靶DNA互補鏈和非互補鏈 DNA[66-67]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在工作時，sgRNA和Cas9形成一個嵌合蛋白，該嵌合蛋白切割與sgRNA 5′端前20-nt互補的基因組DNA雙鏈，產(chǎn)生DSBs，最后通過HDR或NHEJ修復途徑產(chǎn)生基因突變。2013年，CPISPR/Cas9系統(tǒng)成功實現(xiàn)人類細胞的基因組定向編輯[8,68]，隨后被迅速應用于人類、動物和植物等的基因組編輯[69-70]，并超越TALENs成為第三代基因組編輯技術(shù)。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有構(gòu)建簡單、編輯效率高、容易實現(xiàn)多基因編輯等優(yōu)勢，現(xiàn)已成為應用最廣泛的基因組編輯技術(shù)，在作物遺傳改良和品種培育上具有重大應用潛力[71]。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)已成功應用于多種作物如水稻[26-38]、玉米[39-41]、小麥[42]、大豆[43]、番茄[44]、柑桔[45]和蘑菇[46]的重要農(nóng)藝性狀遺傳改良。

1.3.1 在作物產(chǎn)量和品質(zhì)改良上的應用 LI等[27]以水稻品種中花11為材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻產(chǎn)量負調(diào)控基因Gn1a（每穗實粒數(shù)）、DEP1（直立型密穗）、GS3（粒長和粒重）和IPA1（穗粒數(shù)、分蘗相關(guān)）進行定點修飾，發(fā)現(xiàn)Gn1a或DEP1、GS3突變后水稻的每穗實粒數(shù)或著粒密度、粒長都明顯增加，但DEP1突變體在著粒密度增加的同時有半矮化現(xiàn)象，而GS3突變體在粒長增加的同時芒也顯著增長。類似地，SHEN等[29]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對5個粳稻品種的GS3和Gn1a進行定向敲除，構(gòu)建了5個粳稻背景的gs3和gs3gn1a突變系，所有突變系稻谷粒長相比其野生型都增加，所有g(shù)s3gn1a突變系的主穗粒數(shù)相比其野生型也都增加，單株產(chǎn)量增幅最高達14%。此外，XU等[30]通過該技術(shù)靶向突變水稻GW2（粒寬和粒重）、GW5 （粒寬和粒重）和TGW6（千粒重）基因后發(fā)現(xiàn)，gw2gw5tgw6和gw2gw5純合突變系的粒長、粒寬和粒重相比其野生型都顯著增加。WANG等[28]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對秈稻DEP1進行定點突變發(fā)現(xiàn)，獲得的大片段缺失突變體水稻著粒密度增加、植株變矮，產(chǎn)量增加。

直鏈淀粉含量與水稻品質(zhì)密切相關(guān)。MA等[33]利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向突變直鏈淀粉合成酶基因OsWaxy，突變體直鏈淀粉含量從 14.6%下降至2.6%，由此獲得了糯性品質(zhì)。SUN等[34]利用該技術(shù)對水稻糖苷水解酶基因BE1和淀粉分支酶Ⅱb基因BEIIb進行定點編輯，BE1突變株相比野生型在粒型、總淀粉含量、直鏈淀粉含量等指標上未有顯著差異，但BEIIb突變株相比野生型粒型顯著變小、總淀粉含量和直鏈淀粉含量顯著增加，后者最高達到25%。

在小麥產(chǎn)量改良上，ZHANG等[42]利用瞬時表達CRISPR/Cas9系統(tǒng)對小麥粒長和粒重負調(diào)控基因TaGASR7和直立型密穗基因TaDEP1定點編輯，獲得的TaGASR7純合突變株粒重顯著增加，TaDEP1純合突變株明顯變矮。

在番茄生育期和產(chǎn)量改良上，SOYK等[44]通過CRISPR/Cas9技術(shù)對一種感光野生番茄的抗成花基因SP5G進行定向修飾。結(jié)果顯示SP5G突變后，番茄開花和成熟時間提前了約2周，且掛果量增加、產(chǎn)量顯著提升。

雙孢菇（Agaricus bisporus）非常容易褐變，從而影響其品質(zhì)。賓夕法尼亞州立大學伯克分校的楊亦農(nóng)實驗室利用CRISPR/Cas9技術(shù)對雙孢菇的1個多酚氧化酶基因PPO進行定向修飾，獲得的DNA-free突變雙孢菇中多酚氧化酶的活性降低了30%，并具有了抗褐變能力。而抗褐變蘑菇于2016年4月成為第一個豁免美國農(nóng)業(yè)部監(jiān)管的CRISPR編輯作物[46]。

綜上，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對控制作物產(chǎn)量、品質(zhì)相關(guān)的負調(diào)控基因進行定向修飾，能不同程度地改良作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和株型等，是作物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種的新途徑。

1.3.2 在作物抗病、抗逆性改良上的應用 稻瘟病是危害水稻最嚴重的病害之一。水稻OsERF922是一個ERF（ethylene responsive factors）類轉(zhuǎn)錄因子基因，負調(diào)控水稻對病瘟病的抗性[72]。中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所趙開軍團隊以稻瘟病感病品種空育131為材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除OsERF922，獲得的 T2純合突變系在苗期和分蘗期對稻瘟病菌的抗性相比野生型都有顯著提高[26]。柑桔潰瘍病是柑桔生產(chǎn)上最嚴重的病害之一，CsLOB1是導致柑桔潰瘍病的關(guān)鍵感病基因[73]。JIA等[45]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對CsLOB1的編碼區(qū)進行定點編輯，獲得的突變體植株對潰瘍病的抗性顯著增強。

隨著作物輕簡化栽培技術(shù)的普及，除草劑在作物生產(chǎn)上的使用日益廣泛，因此培育抗除草劑的作物新品種成為重要的育種目標。乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，ALS）是支鏈蛋白質(zhì)合成通路中的第一個常見酶，ALS中特定氨基酸突變可以提高植物對乙酰乳酸合酶類除草劑的抗性[74]。2015年，美國杜邦先鋒公司通過CRISPR/Cas9技術(shù)將玉米ALS2編碼區(qū)的第165位脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸，獲得了抗氯磺隆的玉米突變體[40-41]。通過類似的策略，中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所夏蘭琴團隊和美國加州大學圣地亞哥分校趙云德團隊合作，將ALS編碼區(qū)特定堿基定點替換，導致2個氨基酸（W548L和S627I）變異，獲得了抗磺酰脲類除草劑的水稻[35]。同時，ENDO等[36]也通過類似的方法，獲得了ALS編碼區(qū)W548L和S627I位置處堿基定點替換的水稻突變體。此外，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所的高彩霞團隊和李家洋團隊合作，利用NHEJ修復方式建立了基于CRISPR/Cas9的基因組定點插入及替換系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)獲得了在OsEPSPS基因保守區(qū) 2個氨基酸定點替換（T102I和P106S）的雜合突變體，其對草甘膦具有抗性[37]。最近，SHIMATANI等[38]等通過基于 CRISPR/Cas9的Target-AID（target-activation-induced cytidine deaminase）方法，將水稻ALS編碼區(qū)的第96位丙氨基酸突變成纈氨酸，獲得了抗磺酰脲類除草劑的水稻突變體。

玉米ARGOS8是一個乙烯響應的負調(diào)控因子，在干旱脅迫過表達ARGOS8的玉米比野生型顯著增產(chǎn)[75]。SHI等[39]利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)，將玉米GOS2啟動子（能賦予中等水平的組成型表達）定點插入ARGOS8的5′-非翻譯區(qū)或直接替換ARGOS8的啟動子，獲得ARGOS8表達量顯著增加的突變體。這些突變體在干旱環(huán)境下，其最終產(chǎn)量相比野生型玉米顯著提升。這是目前首次報道利用CRISPR/Cas9技術(shù)通過調(diào)節(jié)靶標基因的表達量來改良作物遺傳性狀的案例。

總之，通過CRISPR/Cas9技術(shù)定點敲除作物抗性負調(diào)控因子基因，或定點修飾抗逆性正調(diào)控基因的啟動子以增強基因的表達，或?qū)剐韵嚓P(guān)基因編碼區(qū)定點替換改變基因功能，都能在不同程度上改良作物的抗病或抗逆性，是作物抗性分子育種的有效途徑。

1.3.3 在創(chuàng)制水稻雄不育系上的應用 光溫敏核雄性不育系（P/TGMS）的發(fā)現(xiàn)使雜交水稻由三系法向兩系法發(fā)展。使用傳統(tǒng)的方法，培育一個新的光溫敏核雄性不育系通常需要幾年甚至十年以上時間，但利用CRISPR/Cas9技術(shù)可以大大加快培育水稻雄不育系的進程。2016年，上海交通大學生命科學技術(shù)學院張大兵團隊利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯粳稻品種空育131內(nèi)源基因csa（Carbon Starved Anther），獲得了粳型光敏核雄性不育系[31]。同年 11月，華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院的莊楚雄團隊利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻溫敏核雄性不育基因TMS5進行特異性編輯，創(chuàng)制了一批溫敏核雄性不育系[32]。可見，CRISPR/Cas9技術(shù)為水稻兩系不育系的培育提供了一條新的便捷途徑。

1.4 CRISPR/Cpf1技術(shù)及其應用

CRISPR/Cpf1隸屬于Ⅱ類type V-A CRISPR系統(tǒng)[9]，是迄今發(fā)現(xiàn)最簡單、有效的Ⅱ類CRISPR/Cas系統(tǒng)。CRISPR/Cpf1特異切割 DNA雙鏈的原理與CRISPR/Cas9相似，但其作用機制不同[76]。Cpf1是Cas蛋白的一種，其功能與Cas9類似，目前AsCpf1（Acidaminococcussp. Cpf1）、LbCpf1（Lachnospiraceae bacteriumCpf1）和 FnCpf1（Francisella novicidaCpf1）已被證實具有DNA切割及執(zhí)行RNA加工的活性[77-79]。Cpf1蛋白由具有識別sgRNA功能的a-REC區(qū)域和具有核酸酶功能的 NUC區(qū)域構(gòu)成。a-REC包含 REC1和REC2 2個識別結(jié)構(gòu)域；NUC主要包含RuvC結(jié)構(gòu)域、WED（wedge）結(jié)構(gòu)域、一種推定的核酸酶（Nuc）結(jié)構(gòu)域和PI（PAM-interacting）結(jié)構(gòu)域，其中，Ruv-C和Nuc核酸酶分別負責切割靶DNA的非互補鏈及互補鏈的不同位點，由此產(chǎn)生具粘性末端的 DSBs[79]。不同于SpCas9（Streptococcus pyogenesCas9），Cpf1僅需一個42-nt的crRNA（3′端有23-nt與靶DNA序列互補），就能對靶DNA雙鏈進行切割[76]。另AsCpf1和LbCpf1的PAM識別區(qū)堿基為5′-TTTN-3′，F(xiàn)nCpf1的 PAM 識別區(qū)堿基為 5′-TTN-3′，不同于 SpCas9的5′-NGG-3′[80]。此外，Cpf1 與 SpCas9 切割機制也不一樣，SpCas9切割靶DNA互補鏈的4位和非互補鏈的16位，形成一個平末端；而Cpf1切割靶DNA互補鏈的23位和非互補鏈的18位，形成一個5-nt的粘性末端[76]。但最新的研究結(jié)果表明，Cpf1并非只切割靶DNA非互補鏈的 18位，而是在非互補鏈的 14—18位間多個位點切割。當 spacer序列長度≥20-nt時，Cpf1傾向于切割互補鏈的18位；當spacer序列長度＜20-nt時，Cpf1傾向于切割互補鏈的14位[81]。此外，研究人員還證明Cpf1核酸酶在人類細胞中與SpCas9具有相當?shù)那懈钚剩沧C實Cpf1核酸酶在人類細胞中具有高度的特異性[82-83]。

目前，CRISPR/Cpf1技術(shù)已成功應用于煙草[77]、大豆[84]和水稻[47-48,77,85-86]的基因組編輯。2016年，ENDO等[77]首次將CRISPR/Cpf1系統(tǒng)成功移植于煙草和水稻的基因組編輯，他們將FnCpf1和crRNA融合開發(fā)了 Cpf1-crRNA系統(tǒng)，在煙草和水稻中的編輯效率最高可達 90%。隨后，XU等[47]將 LpCpf1分別與pre-crRNA和加長pre-crRNA融合構(gòu)建了crRNA- Cpf1系統(tǒng)，在水稻中的編輯效率最高可達41.2%；HU等[86]也將LpCpf1和crRNA整合開發(fā)了CRISPR-Cpf1系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)成功實現(xiàn)水稻內(nèi)源基因的定點編輯；KIM 等[84]開發(fā)了 Cpf1–RNP（ribonucleoprotein）系統(tǒng)，并成功利用該系統(tǒng)對大豆和煙草的內(nèi)源基因進行定點突變。此外，BEGEMANN等[48]將Cpf1、crRNA和供體片段構(gòu)成融合表達載體，對水稻葉綠素a加氧酶基因OsCAO1進行定點編輯，獲得了在靶點產(chǎn)生的預期InDel突變和片段插入，此外純合突變植株整株都產(chǎn)生黃化現(xiàn)象。TANG等[85]針對Cpf1蛋白及crRNA的表達特性，構(gòu)建了PolⅡ型啟動子融合核酶（ribozyme）驅(qū)動的 Cpf1和crRNA植物表達單元，并成功對水稻內(nèi)源基因OsPDS、OsDEP1和OsROC5進行定點突變。WANG等[87]將4個DR (direct repeats)-guide單元組成的 crRNA分別與 FnCpf1和 LbCpf1融合構(gòu)建CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)簡單、高效地實現(xiàn)了水稻多基因定點編輯。

CRISPR/Cpf1與CRISPR/Cas9一樣，都是目前最為簡捷、高效和最易實現(xiàn)多基因編輯的基因組編輯技術(shù)。兩者表達載體的構(gòu)建都相當簡單，且都只需要串聯(lián)多個crRNA即可實現(xiàn)多位點編輯，而編輯效率和特異性也都相當，另因都受PAM識別位點的限制，編輯范圍也都有一定的局限性。因此，CRISPR/Cpf1與CRISPR/Cas9可以說是不相伯仲的基因組編輯技術(shù)，相當于CRISPR/Cas技術(shù)“廚房”兩把效果一樣但又能互補的“剪刀”，作為“廚師”的我們，只要能達到我們的目標，選擇任一“剪刀”都可。

1.5 利用CRISPR/Cas系統(tǒng)在基因組編輯方式上的技術(shù)創(chuàng)新

1.5.1 植物基因組單堿基編輯系統(tǒng)創(chuàng)新和應用 單堿基突變可引起作物許多農(nóng)藝性狀的改變，因此，實施單堿基編輯對作物遺傳改良具有十分重要的意義。2016年5月，《Nature》報道了KOMOR等[88]將大鼠胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1，一種堿基修飾酶能改變DNA序列）、Cas9變體（D10A）和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）融合構(gòu)建了大鼠基因組單堿基編輯系統(tǒng)，并用該系統(tǒng)成功糾正了小鼠細胞中阿爾茨海默病相關(guān)的突變，單堿基替換效率高達75%。隨后，有 4個研究團隊將該系統(tǒng)成功改造并用于糧食和蔬菜作物（水稻、小麥、玉米、番茄）的基因組單堿基編輯[38,89-91]。

2016年12月，中國科學院上海生命科學研究院朱健康團隊[89]，以及夏蘭琴和趙云德合作團隊[90]同時在《Molecular Plant》上發(fā)表了其在植物基因組單堿基編輯上取得的最新成果。朱健康團隊將APOBEC1通過非結(jié)構(gòu)化的16殘基肽XTEN作為接頭，融合到 Cas9（D10A）的 N末端，并將核定位信號（NLS）肽添加到Cas9（D10A）的C末端，構(gòu)建了APOBEC1-XTEN-Cas9（D10A）植物基因組單堿基編輯系統(tǒng)[89]。利用該系統(tǒng)對水稻NRT1.1B和SLR1進行編輯，結(jié)果表明該系統(tǒng)能在靶位點產(chǎn)生預期的C→T（G→A）堿基替換，NRT1.1B和SLR1在靶位點產(chǎn)生預期突變的效率分別為2.7%和13.3%。夏蘭琴和趙云德合作團隊也利用 APOBEC1、Cas9變體（nCas9-D10A）和 UGI的融合基因 BE3[88]構(gòu)建了植物基因組單堿基編輯系統(tǒng) pCXUN-BE3[90]。利用pCXUN-BE3系統(tǒng)編輯水稻八氫番茄紅素脫氫酶基因OsPDS和淀粉分支酶Ⅱb基因OsSBEIIb，獲得在3個靶位點產(chǎn)生預期突變（靶序列5′端4—8位置有G→A或C→T）的水稻植株，效率最高可達20%[90]。

2017年2月，《Nature Biotechnology》雜志報道了高彩霞實驗室在水稻、小麥和玉米基因組中實現(xiàn)高效、精確的單堿基編輯的成果。他們同樣利用APOBEC1、nCas9-D10A和UGI，構(gòu)建了植物基因組單堿基編輯系統(tǒng)nCas9-PBE。利用該系統(tǒng)對3種作物5個內(nèi)源基因7個靶位點的定點突變結(jié)果顯示，在靶序列5′端3—9位置能產(chǎn)生預期的C→T的替換，其中，單個C的替換效率為0.39%—7.07%，多個C的替換效率高達12.48%；而遺傳轉(zhuǎn)化的結(jié)果表明，該系統(tǒng)在小麥、水稻和玉米中獲得靶區(qū)域單堿基替換的效率最高可達 43.48%[91]。同年 3月，SHIMATANI等[38]在《Nature Biotechnology》雜志發(fā)表了其在水稻和番茄中實現(xiàn)高效的單堿基編輯的最新成果。將nCas9-D10A（nCas9）、PmCDA1（Petromyzon marinuscytidine deaminase）和 sgRNA融合構(gòu)建了植物基因組單堿基編輯系統(tǒng)nCas9-PmCDA1，并利用該系統(tǒng)對水稻ALS和FTIP1e以及番茄DELLA和ETR1進行定點突變。結(jié)果表明，在水稻中該系統(tǒng)在靶區(qū)域誘導單個或多個預期單堿基替換（C→T）的效率最高可達50%，在番茄中最高可達80%。

1.5.2 DNA-free植物基因組編輯系統(tǒng)創(chuàng)新和應用

生物安全問題是限制轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的主要因素。雖然 CRISPR/Cas對基因進行定點修飾后能通過自交后代分離剔除外源 DNA，獲得無外源 DNA基因（DNA-free）的編輯植株。但目前只有美國對CRISPR編輯作物安全實行監(jiān)管豁免[92]，其他國家都還處于觀望狀態(tài)。因此，建立全程 DNA-free的植物基因組編輯系統(tǒng)對于推動基因編輯作物的商業(yè)化利用具有重要意義。目前，DNA-free植物基因組編輯系統(tǒng)主要有瞬時表達 CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)[42]和 RGEN（RNA-guided engineered nuclease）核糖核蛋白（RGEN ribonucleoproteins，RGEN RNPs）編輯系統(tǒng)[93]。

瞬時表達CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)的操作流程和原理是：將CRISPR/Cas9質(zhì)粒DNA（TECCDNA）或其轉(zhuǎn)錄的RNA（TECCRNA）通過基因槍法直接轉(zhuǎn)入植物愈傷組織，因是環(huán)狀質(zhì)?；騌NA，故不易被整合進植物基因組中；在完成切割使命后，質(zhì)粒DNA或RNA會被細胞內(nèi)源核酸酶分解，從而實現(xiàn)全程 DNA-free的基因組編輯[42]。研究人員對該系統(tǒng)在小麥基因組中的定向修飾特性進行了詳細的研究。通過對4個小麥品種的7個內(nèi)源基因（共9個靶位點）靶向修飾發(fā)現(xiàn)，TECCDNA在小麥T0轉(zhuǎn)基因植株中誘導突變的效率為1.0%—9.5%，DNA-free突變植株的比例為 43.8%—86.8%。對比分析顯示，TECCDNA和經(jīng)典 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的定向編輯效率和脫靶效應上沒有明顯差別，但都顯著高于TECCRNA[42]。

RGEN RNPs技術(shù)是將CRISPR-Cas蛋白和gRNA在體外組裝成核糖核蛋白復合體，該復合體進入細胞后能迅速行使 DNA切割功能，然后被細胞內(nèi)源蛋白酶快速分解，從而實現(xiàn)全程無外源 DNA整合的基因組編輯[94-95]。RGEN RNPs技術(shù)最先應用于低等動物[76]和人類細胞[77]，隨后被應用于擬南芥[93]、煙草[93]、萵苣[93]、水稻[93]、矮牽牛花[96]、玉米[41]、小麥[97]和大豆[84]的基因組編輯。

2015年，WOO等[93]首先將RGEN RNPs技術(shù)成功用于植物的基因組編輯。研究表明，RGEN RNPs在擬南芥、煙草和水稻的原生質(zhì)體中定向編輯的效率分別為 16%—19%、17%—44%和 8.4%—23%，在轉(zhuǎn)化萵苣的再生植株中定向編輯的效率為 45.7%，且沒有檢測到脫靶突變[93]。此外，SUBBURAJ等[96]通過RGEN RNPs技術(shù)對矮牽?；▋?nèi)源基因PhNR（nitratereductase）的 6個位點（NR1-6）進行定向修飾，發(fā)現(xiàn)在原生質(zhì)體中RGEN RNPs誘導定點突變的平均效率為（11.5±2）%。顯然，這兩項研究只聚焦在植物原生質(zhì)體層面的基因組定向修飾，還未真正涉及作物的遺傳改良。

2016年11月，《Nature Communications》報道了美國杜邦先鋒公司利用RGEN RNPs技術(shù)獲得了無葉舌、雄性不育和抗氯磺隆的玉米改良系，標志著RGEN RNPs技術(shù)在主要作物遺傳改良上的真正應用[41]。研究人員通過基因槍法將組裝好的RGEN RNPs，及RGEN RNPs和同源供體片段轉(zhuǎn)入玉米愈傷組織，通過NHEJ途徑實現(xiàn)對玉米無葉舌基因（LIG）、雄性育性基因（Ms26和Ms45）進行定點突變，通過 HDR途徑實現(xiàn)對ALS2基因定點替換（編碼區(qū)的第165位脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸），最終獲得了全程無外源 DNA作為載體的 DNA-free基因編輯玉米，表現(xiàn)為無葉舌、雄性不育和抗氯磺隆[41]；對比分析發(fā)現(xiàn)，RGEN RNPs和Cas9-gRNA質(zhì)粒（即TECCDNA）定向編輯效率基本一致，但 RGEN RNPs誘導的脫靶效應顯著低于Cas9-gRNA質(zhì)粒誘導的[41]。類似地，LIANG[97]等利用RGEN RNPs技術(shù)對小麥TaGW2進行定向編輯，深度測序結(jié)果表明 CRISPR/Cas9 RNP定向編輯的效率較CRISPR/Cas9 DNA要低，脫靶的機率也更低，且在突變植株中未檢測到脫靶現(xiàn)象。

上述報道都是基于 CRISPR/Cas9 RNP的 DNA-free植物基因組編輯。2017年，KIM 等[84]首次利用CRISPR/Cpf1 RNP成功對大豆FAD2和煙草AOC實現(xiàn)定點編輯，效率最高達 11.7%，且在大豆基因組潛在脫靶位點未檢測到顯著突變。

2 基因組編輯技術(shù)應用于作物改良的基本原則

2.1 ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas如何抉擇

ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas都是有效的基因組編輯技術(shù)，但三者在設(shè)計、特異性和效率上各有不同。ZFNs由于特異性不高、脫靶問題嚴重及獲得ZFN蛋白非常困難，嚴重阻礙了其廣泛應用。TALENs的優(yōu)點是特異高、脫靶效應低，但載體構(gòu)建較繁瑣[98]、編輯效率不是很高、且難以同時對多個基因進行編輯[23,99-100]。CRISPR/Cas系統(tǒng)的優(yōu)點是編輯效率非常高[33,101]，設(shè)計和構(gòu)建極其簡單（只需2—3 d），僅需設(shè)計、合成靶點識別序列，且也只需將 sgRNA串聯(lián)就能實現(xiàn)多基因編輯[102]；但CRISPR/Cas系統(tǒng)的特異性稍差，存在較明顯的脫靶效應[103-105]，另受PAM識別位點限制。目前，ZFNs已基本被 TALENs和 CRISPR/Cas系統(tǒng)所取代，而TALENs在植物基因組編輯中也已逐漸失去優(yōu)勢。因此，在作物遺傳改良上，優(yōu)先推薦使用 CRISPR/Cas系統(tǒng)，如 CRISPR/Cas系統(tǒng)無合適的靶位點或?qū)μ禺愋砸髽O高的情況下可使用TALENs技術(shù)。

2.2 基因敲除還是基因替換

目前，基因編輯技術(shù)應用于作物遺傳改良主要有兩種方式，一是通過靶向敲除目標性狀負調(diào)控基因，造成該基因功能缺失，以改良目標性狀；二是通過對目標性狀控制基因進行定點替換，導致該基因功能發(fā)生改變，從而獲得新的目標性狀。因此，在實踐中運用基因組編輯技術(shù)對作物進行遺傳改良時也要分以下2種情況：一是對于目標性狀起負調(diào)控作用的基因采取基因敲除的方式，目前，絕大部分基于基因組編輯技術(shù)的作物遺傳改良都是通過此方式實現(xiàn)的，如 WANG等[26]對水稻稻瘟病抗性的改良，ZHOU等[32]創(chuàng)制水稻溫敏核雄性不育系等；二是對于目標性狀的獲得是因目標基因突變導致基因功能發(fā)生改變的基因，采用基因定點替換的方式，如抗除草劑水稻、玉米等都是通過基因定點替換而獲得的[35-38, 41]。

2.3 靶位點如何選擇

目前，已有多個專門設(shè)計SSNs靶位點和搜索脫靶位點的網(wǎng)站和工具[106]。而在作物遺傳改良的實際操作中，是敲除多基因還是單基因、靶位點在基因上的位置及數(shù)目都是需要考慮的。如果需要同時改良多個目標性狀，以及目標性狀是由微效多基因或多等位基因控制的情況，最好針對每個目標性狀控制基因，或微效多基因等設(shè)計多個靶位點進行定向敲除，能最快、最省地獲得改良目標性狀；而如果控制目標性狀的是主效基因，則敲除單個基因一般即可達到改良目的。

靶位點在基因上的位置也比較重要，進行基因敲除時，靶位點應優(yōu)先選擇在起始密碼子附近，或在特定的功能域（可能引起密碼子缺失和移碼）；而如果是基因替換，靶位點則需選擇在基因特定功能區(qū)（突變后基因功能發(fā)生改變的區(qū)域）。

此外，靶位點的數(shù)量也關(guān)系到定向編輯的效率和遺傳轉(zhuǎn)化的規(guī)模，筆者在試驗中發(fā)現(xiàn)，敲除同一個基因時分別設(shè)計1個、2個和3個靶點進行修飾，突變的效率分別為42%、70%（2個靶點都突變的為63.3%）和90%（3個靶點都突變），獲得純合突變株的效率分別為14.3%、47.6%和40.7%[26]。因此，在基因敲除時，建議單個基因設(shè)計2個靶位點，能減輕遺傳轉(zhuǎn)化的工作量，也能更省、更快地獲得純合突變植株，極大地節(jié)省人力和物力。

2.4 如何快速獲得純合的DNA-free編輯植株

目前，獲得純合的DNA-free編輯植株主要有2種途徑：一是通過經(jīng)典的 TALENs和 CRISPR/Cas9技術(shù)獲得基因得以修飾的植株后，通過自交或雜交的方式剔除外源基因；二是直接利用DNA-free植物基因組編輯系統(tǒng)對植物基因組進行定向編輯。2種途徑都有各自的優(yōu)缺點，通過自交或雜交剔除的途徑相對來說操作簡單、成本低，普通的分子實驗室都能操作完成，且最快能在T1代獲得純合的DNA-free編輯植株[20,26]。DNA-free植物基因組編輯系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能得到全程無外源DNA整合的編輯植株，且在T0代即可獲得純合的DNA-free編輯植株[41-42]，但相對經(jīng)典的CRISPR/Cas9系統(tǒng)操作較復雜、成本更高。因此，想要最快獲得純合的 DNA-free編輯植株，有條件的實驗室優(yōu)先推薦使用RGEN RNPs編輯系統(tǒng)，其次推薦瞬時表達 CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)中的 TECCRNA方式，而TECCDNA方式因質(zhì)粒DNA被細胞內(nèi)源核酸酶分解后的小片段 DNA有時會插入靶位點和非靶位點處，如果插入的 DNA片段過小，目前的檢測手段還不能對其進行有效鑒定，故不推薦；沒有條件利用DNA-free植物基因組編輯系統(tǒng)的情況下，則使用經(jīng)典的CRISPR/Cas系統(tǒng)。

3 基因組編輯技術(shù)在作物遺傳改良上應用的機遇與挑戰(zhàn)

作物轉(zhuǎn)基因育種的歷史已有20多年，很多轉(zhuǎn)基因作物如棉花、大豆、玉米等已在多個國家種植，但轉(zhuǎn)基因生物（genetically modified organism，GMO）的生物安全性問題一直備受關(guān)注?；蚓庉嫾夹g(shù)的出現(xiàn)為作物分子育種提供了新的機遇，但仍然面臨政策法規(guī)和技術(shù)優(yōu)化兩方面的挑戰(zhàn)。目前，國際上對基因編輯作物是否屬于轉(zhuǎn)基因生物尚未有明確一致的定論，其監(jiān)管標準也存在較大爭議。美國農(nóng)業(yè)監(jiān)管部門認為基因編輯作物（genome edited crop，GEC）是通過細胞自我修復機制而產(chǎn)生的突變體，與作物自然突變以及物理和化學誘導突變極其相似，都是少數(shù)幾個核苷酸的改變，因此，GEC不被定義為GMO[107]。歐盟對GMO監(jiān)管較為嚴格，其認為只要有外源DNA轉(zhuǎn)入，而不論最終植物中是否還存在外源DNA，都被定義為GMO。從科學角度來講，基因編輯誘導的突變與自然突變以及物理和化學誘導突變性質(zhì)一樣，實質(zhì)無法區(qū)分，因此歐盟也有建議將GEC定義為非GMO。但基于政治考慮，歐盟尚未下明確定論，對GEC的監(jiān)管標準存在不確定性[108]。目前，中國對于基因編輯作物的監(jiān)管標準尚無明確的規(guī)定，因此亟需出臺相關(guān)的政策法規(guī)以正確引導基因編輯育種。迄今，美國農(nóng)業(yè)監(jiān)管部門至少已認定 5種基因編輯作物新品種不屬于GMO范疇，即通過ZFNs技術(shù)創(chuàng)制的低植酸玉米品種，通過TALEN技術(shù)創(chuàng)制的耐冷藏馬鈴薯品種和高油酸、低亞油酸大豆，以及通過CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制的抗褐化雙孢菇和抗除草劑玉米。

為正確引導基因編輯技術(shù)應用于作物育種，中國科學院的李家洋院士等針對基因編輯作物提出了一個監(jiān)管框架，并發(fā)表在《Nature Genetics》雜志。文章對基因編輯作物的監(jiān)管提出了幾點建議[109]：一是在研究階段應盡量減少GEC不受控的傳播風險；二是要確保GEC中外源 DNA被完全剔除；三是準確記錄靶點DNA的變化，如果通過同源同組引入了新的序列，必須注明供體和受體之間的親緣關(guān)系；四是基于參考基因組信息和全基因組測序技術(shù)檢測并確定主要靶點沒有意外的二次編輯事件和考慮潛在脫靶事件的后果；五是將上述四點信息在新品種資料中登記備案，除上述四點外，GEC只需執(zhí)行常規(guī)作物品種的監(jiān)管標準即可。同期，該雜志編輯部發(fā)文支持GEC管理框架的建議，并倡導GEC品種在完成透明的原則下，不需要進一步的監(jiān)管，及與傳統(tǒng)品種進行區(qū)分[110]。

基因組編輯技術(shù)從出現(xiàn)至今不過短短十多年時間，但其已廣泛應用于生物醫(yī)學和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。特別是TALENs和CRISPR/Cas9技術(shù)出現(xiàn)后，極大地加快了作物分子育種的研究步伐。目前，CRISPR/Cas技術(shù)已成為基因編輯應用的首選，雖然發(fā)明至今不到5年時間，但已被廣泛應用于生物和農(nóng)業(yè)的各個領(lǐng)域，而其本身也歷經(jīng)了多次技術(shù)優(yōu)化。例如，利用Cas9變體將脫靶率降低到檢測不到的水平[111-112]，對Cas9和Cpf1蛋白進行定點突變擴大了PAM位點的選擇范圍[113-114]，基于CRISPR/Cas9的植物基因組單堿基編輯系統(tǒng)[89-91]，基于CRISPR/Cas9的植物基因組定點插入和替換系統(tǒng)[35-41,115]，以及DNA-free植物基因組編輯系統(tǒng)[41-42]等。

目前，基因編輯技術(shù)應用于作物遺傳改良，主要是通過定點突變靶標基因，造成基因功能缺失（lossof-function）以實現(xiàn)性狀改良，故敲除的基因必須都是目標性狀負調(diào)控基因。但作物許多性狀改良都需要獲得基因功能（gain-of-function），因此，基因組定點替換或插入的基因組編輯具有更廣泛的應用前景，而植物細胞中同源重組效率很低，目前植物基因組編輯技術(shù)對基因單堿基替換、片段定點插入和替換等編輯的效率還很低。如目前已報道的植物單堿基定點替換技術(shù)在水稻、小麥和玉米中的編輯效率為0.39%—20%（大都低于10%），且只能是C→T（G→A）堿基替換[89-91]；而已報道的植物基因組定點插入和替換技術(shù)在水稻、玉米和擬南芥中的編輯效率也極低，片段定點替換效率普遍低于1%[35-37,40]。因此，對大部分控制重要農(nóng)藝性狀的正調(diào)控基因目前還無法高效、精準地進行編輯，從而極大地限制了基因編輯技術(shù)大規(guī)模應用于作物遺傳改良的步伐。

雖然目前基因組編輯技術(shù)應用于作物遺傳改良還存在政策法規(guī)和技術(shù)優(yōu)化兩方面的挑戰(zhàn)，但在植物基因功能研究和作物遺傳改良上其更具有其他分子技術(shù)無法比擬的巨大優(yōu)勢和機遇。放眼未來，我們預計GEC品種監(jiān)管的法規(guī)肯定會寬松；實現(xiàn)基因定點替換和插入的基因組編輯技術(shù)一定會得到優(yōu)化。隨著大量作物品種全基因組測序的完成和越來越多重要農(nóng)藝性狀不利基因被發(fā)現(xiàn)，基因組編輯技術(shù)必將在作物遺傳改良和品種培育上發(fā)揮巨大的作用。

[1] VOYTAS D F. Plant genome engineering with sequence-specific nucleases.Annual Review of Plant Biology, 2013, 64(1): 327-350.

[2] GO D E, STOTTMANN R W. The impact of CRISPR/Cas9-based genomic engineering on biomedical research and medicine.Current Molecular Medicine, 2016, 16(4): 343-352.

[3] CAPECCHI M. Altering the genome by homologous recombination.Science, 1989, 244(4910): 1288-1292.

[4] BELLAICHE Y, MOGILA V, PERRIMON N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms inDrosophila.Genetics, 1999, 152(3): 1037-1044.

[5] BAKER M. Gene-editing nucleases.Nature Methods, 2012, 9(1):23-26.

[6] URNOV F D, REBAR E J, HOLMES M C, ZHANG H S,GREGORY P D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases.Nature Reviews Genetics, 2010, 11(9): 636-646.

[7] CHRISTIAN M, CERMAK T, DOYLE E L, SCHMIDT C, ZHANG F,HUMMEL A, BOGDANOVE A J, VOYTAS D F. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases.Genetics, 2010,186(2): 757-761.

[8] MALI P, AACH J, STRANGES P B, ESVELT K M, MOOSBURNER M, KOSURI S, YANG L, CHURCH G M. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering.Nature Biotechnology, 2013, 31(9):833-838.

[9] ZETSCHE B, GOOTENBERG J S, ABUDAYYEH O O,SLAYMAKER I M, MAKAROVA K S, ESSLETZBICHLER P,VOLZ S E, JOUNG J, VAN DER OOST J, REGEV A, KOONIN E V,ZHANG F. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.Cell, 2015, 163(3): 759-771.

[10] COHEN-TANNOUDJI M, ROBINE S, CHOULIKA A, PINTO D, EL MARJOU F, BABINET C, LOUVARD D, JAISSER F. I-SceI-induced gene replacement at a natural locus in embryonic stem cells.Molecular and Cellular Biology, 1998, 18(3): 1444-1448.

[11] SYMINGTON L S, GAUTIER J. Double-strand break end resection and repair pathway choice.Annual Review of Genetics, 2011, 45:247-271.

[12] BIBIKOVA M, GOLIC M, GOLIC K G, CARROLL D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis inDrosophilausing zincfinger nucleases.Genetics, 2002, 161(3): 1169-1175.

[13] ISHII T. Germline genome-editing research and its socioethical implications.Trends in Molecular Medicine, 2015, 21(8): 473-481.

[14] WEEKS D P, SPALDING M H, YANG B. Use of designer nucleases for targeted gene and genome editing in plants.Plant Biotechnology Journal, 2016, 14(2): 483-495.

[15] YANG H, GAO P, RAJASHANKAR K R, PATEL D J. PAM-dependent target DNA recognition and cleavage by C2c1 CRISPRCas endonuclease.Cell, 2016, 167(7): 1814-1828.

[16] ABUDAYYEH O O, GOOTENBERG J S, KONERMANN S,JOUNG J, SLAYMAKER I M, COX D B T, SHMAKOV S,MAKAROVA K S, SEMENOVA E, MINAKHIN L, SEVERINOV K,REGEV A, LANDER E S, KOONIN E V, ZHANG F. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.Science, 2016, 353(6299): aaf5573.

[17] ZHU C, BORTESI L, BAYSAL C, TWYMAN R M, FISCHER R,CAPELL T, SCHILLBERG S, CHRISTOU P. Characteristics of genome editing mutations in cereal crops.Trends in Plant Science,2017, 22(1): 38-52.

[18] SHUKLA V K, DOYON Y, MILLER J C, DEKELVER R C,MOEHLE E A, WORDEN S E, MITCHELL J C, ARNOLD N L,GOPALAN S, MENG X, CHOI V M, ROCK J M, WU Y-Y,KATIBAH G E, ZHIFANG G, MCCASKILL D, SIMPSON M A,BLAKESLEE B, GREENWALT S A, BUTLER H J, HINKLEY S J,ZHANG L, REBAR E J, GREGORY P D, URNOV F D. Precise genome modification in the crop speciesZea maysusing zinc-finger nucleases.Nature, 2009, 459(7245): 437-441.

[19] LI T, LIU B, SPALDING M H, WEEKS D P, YANG B.High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice.Nature Biotechnology, 2012, 30(5): 390-392.

[20] SHAN Q, ZHANG Y, CHEN K, ZHANG K, GAO C. Creation of fragrant rice by targeted knockout of theOsBADH2gene using TALEN technology.Plant Biotechnology Journal, 2015, 13(6): 791-800.

[21] MA L, ZHU F, LI Z, ZHANG J, LI X, DONG J, WANG T.TALEN-based mutagenesis of lipoxygenase LOX3 enhances the storage tolerance of rice (Oryza sativa) seeds.PLoS ONE, 2015,10(12): e0143877.

[22] BLANVILLAIN-BAUFUME S, RESCHKE M, SOLE M, AUGUY F,DOUCOURE H, SZUREK B, MEYNARD D, PORTEFAIX M,CUNNAC S, GUIDERDONI E, BOCH J, KOEBNIK R. Targeted promoter editing for rice resistance toXanthomonas oryzaepv.oryzaereveals differential activities forSWEET14-inducing TAL effectors.Plant Biotechnology Journal, 2017, 15(3): 306-317.

[23] WANG Y, CHENG X, SHAN Q, ZHANG Y, LIU J, GAO C, QIU J L.Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew.Nature Biotechnology,2014, 32(9): 947-951.

[24] HAUN W, COFFMAN A, CLASEN B M, DEMOREST Z L, LOWY A, RAY E, RETTERATH A, STODDARD T, JUILLERAT A,CEDRONE F, MATHIS L, VOYTAS D F, ZHANG F. Improved soybean oil quality by targeted mutagenesis of the fatty acid desaturase 2 gene family.Plant Biotechnology Journal, 2014, 12(7):934-940.

[25] CLASEN B M, STODDARD T J, LUO S, DEMOREST Z L, LI J,CEDRONE F, TIBEBU R, DAVISON S, RAY E E, DAULHAC A,COFFMAN A, YABANDITH A, RETTERATH A, HAUN W,BALTES N J, MATHIS L, VOYTAS D F, ZHANG F. Improving cold storage and processing traits in potato through targeted gene knockout.Plant Biotechnology Journal, 2016, 14: 169-176.

[26] WANG F, WANG C, LIU P, LEI C, HAO W, GAO Y, LIU Y G,ZHAO K. Enhanced rice blast resistance by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the ERF transcription factor geneOsERF922.PLoS ONE, 2016, 11(4): e0154027.

[27] LI M, LI X, ZHOU Z, WU P, FANG M, PAN X, LIN Q, LUO W, WU G, LI H. Reassessment of the four yield-related genesGn1a,DEP1,GS3, andIPA1in rice using a CRISPR/Cas9 system.Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 377.

[28] WANG Y, GENG L, YUAN M, WEI J, JIN C, LI M, YU K, ZHANG Y, JIN H, WANG E, CHAI Z, FU X, LI X. Deletion of a target gene inIndicarice via CRISPR/Cas9.Plant Cell Reports, 2017, 36(8):1333-1343.

[29] SHEN L, WANG C, FU Y, WANG J, LIU Q, ZHANG X, YAN C,QIAN Q, WANG K. QTL editing confers opposing yield performance in different rice varieties.Journal of Integrative Plant Biology, 2016 Sep 15. doi: 10.1111/jipb.12501.

[30] XU R, YANG Y, QIN R, LI H, QIU C, LI L, WEI P, YANG J. Rapid improvement of grain weight via highly efficient CRISPR/Cas9-mediated multiplex genome editing in rice.Journal of Genetics and Genomics, 2016, 43(8): 529-532.

[31] LI Q, ZHANG D, CHEN M, LIANG W, WEI J, QI Y, YUAN Z.Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9.Journal of Genetics and Genomics, 2016, 43(6): 415-419.

[32] ZHOU H, HE M, LI J, CHEN L, HUANG Z, ZHENG S, ZHU L, NI E, JIANG D, ZHAO B, ZHUANG C. Development of commercial thermo-sensitive genic male sterile rice accelerates hybrid rice breeding using the CRISPR/Cas9-mediatedTMS5editing system.Scientific Reports, 2016, 6: 37395.

[33] MA X, ZHANG Q, ZHU Q, LIU W, CHEN Y, QIU R, WANG B,YANG Z, LI H, LIN Y, XIE Y, SHEN R, CHEN S, WANG Z, CHEN Y, GUO J, CHEN L, ZHAO X, DONG Z, LIU Y G. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants.Molecular Plant, 2015,8(8): 1274-1284.

[34] SUN Y, JIAO G, LIU Z, ZHANG X, LI J, GUO X, DU W, DU J,FRANCIS F, ZHAO Y, XIA L. Generation of high-amylose rice through CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis of starch branching enzymes.Frontiers in Plant Science, 2017, 8: 298.

[35] SUN Y, ZHANG X, WU C, HE Y, MA Y, HOU H, GUO X, DU W,ZHAO Y, XIA L. Engineering herbicide-resistant rice plants through CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination of acetolactatesynthase.Molecular Plant, 2016, 9(4): 628-631.

[36] ENDO M, MIKAMI M, TOKI S. Biallelic gene targeting in rice.Plant Physiology, 2016, 170(2): 667-677.

[37] LI J, MENG X, ZONG Y, CHEN K, ZHANG H, LIU J, LI J, GAO C.Gene replacements and insertions in rice by intron targeting using CRISPR-Cas9.Nature Plants, 2016, 2: 16139.

[38] SHIMATANI Z, KASHOJIYA S, TAKAYAMA M, TERADA R,ARAZOE T, ISHII H, TERAMURA H, YAMAMOTO T, KOMATSU H, MIURA K, EZURA H, NISHIDA K, ARIIZUMI T, KONDO A.Targeted base editing in rice and tomato using a CRISPR-Cas9 cytidine deaminase fusion.Nature Biotechnology, 2017, 35(5):441-443.

[39] SHI J, GAO H, WANG H, LAFITTE H R, ARCHIBALD R L, YANG M, HAKIMI S M, MO H, HABBEN J E. ARGOS8 variants generated by CRISPR-Cas9 improve maize grain yield under field drought stress conditions.Plant Biotechnology Journal, 2017, 15(2): 207-216.

[40] SVITASHEV S, YOUNG J K, SCHWARTZ C, GAO H, FALCO S C,CIGAN A M. Targeted mutagenesis, precise gene editing, and site-specific gene insertion in maize using Cas9 and guide RNA.Plant Physiology, 2015, 169(2): 931-945.

[41] SVITASHEV S, SCHWARTZ C, LENDERTS B, YOUNG J K,MARK CIGAN A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.Nature Communications,2016, 7: 13274.

[42] ZHANG Y, LIANG Z, ZONG Y, WANG Y, LIU J, CHEN K, QIU J L,GAO C. Efficient and transgene-free genome editing in wheat through transient expression of CRISPR/Cas9 DNA or RNA.Nature Communications, 2016, 7: 12617.

[43] CAI Y, CHEN L, LIU X, GUO C, SUN S, WU C, JIANG B, HAN T,HOU W. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis ofGmFT2adelays flowering time in soybean.Plant Biotechnology Journal, 2017 May 16. doi: 10.1111/pbi.12758.

[44] SOYK S, MULLER N A, PARK S J, SCHMALENBACH I, JIANG K,HAYAMA R, ZHANG L, VAN ECK J, JIMENEZ-GOMEZ J M,LIPPMAN Z B. Variation in the flowering geneSELF PRUNING 5Gpromotes day-neutrality and early yield in tomato.Nature Genetics,2017, 49(1): 162-168.

[45] JIA H, ZHANG Y, ORBOVIC V, XU J, WHITE F F, JONES J B,WANG N. Genome editing of the disease susceptibility geneCsLOB1in citrus confers resistance to citrus canker.Plant Biotechnology Journal, 2017, 15(7): 817-823.

[46] WALTZ E. Gene-edited CRISPR mushroom escapes US regulation.Nature, 2016, 532(7599): 293.

[47] XU R, QIN R, LI H, LI D, LI L, WEI P, YANG J. Generation of targeted mutant rice using a CRISPR-Cpf1 system.Plant Biotechnology Journal, 2017, 15(6): 713-717.

[48] BEGEMANN M B, GRAY B N, JANUARY E, GINA C GORDON,HE Y H, LIU HVJ, WU X R, BRUTNELL T P, MOCKLER T C,OUFATTOLE M. Precise insertion and guided editing of higher plant genomes using Cpf1 CRISPR nucleases.Scientific Reports, 2017, 7(1):11606.

[49] KANDAVELOU K, CHANDRASEGARAN S. Custom-designed molecular scissors for site-specific manipulation of the plant and mammalian genomes.Methods in Molecular Biology, 2009, 544:617-636.

[50] KIM Y G, CHA J, CHANDRASEGARAN S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokⅠ cleavage domain.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1996, 93(3): 1156-1160.

[51] HOCKEMEYER D, SOLDNER F, BEARD C, GAO Q,MITALIPOVA M, DEKELVER R C, KATIBAH G E, AMORA R,BOYDSTON E A, ZEITLER B, MENG X, MILLER J C, ZHANG L,REBAR E J, GREGORY P D, URNOV F D, JAENISCH R. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.Nature Biotechnology, 2009, 27(9):851-857.

[52] REMY S, TESSON L, MENORET S, USAL C, SCHARENBERG A M, ANEGON I. Zinc-finger nucleases: A powerful tool for genetic engineering of animals.Transgenic Research, 2010, 19(3): 363-371.

[53] BIBIKOVA M, BEUMER K, TRAUTMAN J K, CARROLL D.Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases.Science,2003, 300(5620): 764.

[54] DOYON Y, MCCAMMON J M, MILLER J C, FARAJI F, NGO C,KATIBAH G E, AMORA R, HOCKING T D, ZHANG L, REBAR E J, GREGORY P D, URNOV F D, AMACHER S L. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases.Nature Biotechnology, 2008, 26(6): 702-708.

[55] ZHANG F, MAEDER M L, UNGER-WALLACE E, HOSHAW J P,REYON D, CHRISTIAN M, LI X, PIERICK C J, DOBBS D,PETERSON T, JOUNG J K, VOYTAS D F. High frequency targeted mutagenesis inArabidopsis thalianausing zinc finger nucleases.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America, 2010, 107(26): 12028-12033.

[56] CAI C Q, DOYON Y, AINLEY W M, MILLER J C, DEKELVER R C,MOEHLE E A, ROCK J M, LEE Y L, GARRISON R,SCHULENBERG L, BLUE R, WORDEN A, BAKER L, FARAJI F,ZHANG L, HOLMES M C, REBAR E J, COLLINGWOOD T N,RUBIN-WILSON B, GREGORY P D, URNOV F D, PETOLINO J F.Targeted transgene integration in plant cells using designed zinc finger nucleases.Plant Molecular Biology, 2009, 69(6): 699-709.

[57] LI T, HUANG S, JIANG W Z, WRIGHT D, SPALDING M H,WEEKS D P, YANG B. TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain.Nucleic Acids Research, 2010, 39(1): 359-372.

[58] SCHORNACK S, MINSAVAGE G V, STALL R E, JONES J B,LAHAYE T. Characterization of AvrHah1, a novel AvrBs3-like effector fromXanthomonas gardneriwith virulence and avirulence activity.New Phytologist, 2008, 179(2): 546-556.

[59] BOCH J, SCHOLZE H, SCHORNACK S, LANDGRAF A, HAHN S K S, LAHAYE T, NICKSTADT A, BONAS U. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type Ⅲ effectors.Science, 2009(326):1509-1512.

[60] MOSCOU M J, BOGDANOVE A J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.Science, 2009, 326(5959): 1501.

[61] REYON D, TSAI S Q, KHAYTER C, FODEN J A, SANDER J D,JOUNG J K. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.Nature Biotechnology, 2012, 30(5): 460-465.

[62] MIKLIS M, CONSONNI C, BHAT R A, LIPKA V, SCHULZELEFERT P, PANSTRUGA R. Barley MLO modulates actin-dependent and actin-independent antifungal defense pathways at the cell periphery.Plant Physiology, 2007, 144(2): 1132-1143.

[63] CARTER J, WIEDENHEFT B. SnapShot: CRISPR-RNA-guided adaptive immune systems.Cell, 2015, 163(1): 260-260.

[64] MAKAROVA K S, KOONIN E V. Annotation and classification of CRISPR-Cas systems.Methods in Molecular Biology, 2015, 1311:47-75.

[65] MARRAFFINI L A, SONTHEIMER E J. Self versus non-self discrimination during CRISPR RNA-directed immunity.Nature, 2010,463(7280): 568-571.

[66] DELTCHEVA E, CHYLINSKI K, SHARMA C M, GONZALES K,CHAO Y, PIRZADA Z A, ECKERT M R, VOGEL J, CHARPENTIER E. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.Nature, 2011, 471(7340): 602-607.

[67] JINEK M, JIANG F, TAYLOR D W, STERNBERG S H, KAYA E,MA E, ANDERS C, HAUER M, ZHOU K, LIN S, KAPLAN M,IAVARONE A T, CHARPENTIER E, NOGALES E, DOUDNA J A.Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation.Science, 2014, 343(6176): 1247997.

[68] CONG L, RAN F A, COX D, LIN S, BARRETTO R, HABIB N,HSU P D, WU X, JIANG W, MARRAFFINI L A, ZHANG F.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science,2013, 339(6121): 819-823.

[69] HSU P D, LANDER E S, ZHANG F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.Cell, 2014, 157(6):1262-1278.

[70] BELHAJ K, CHAPARRO-GARCIA A, KAMOUN S, PATRON N J,NEKRASOV V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9.Current Opinion in Biotechnology, 2015, 32: 76-84.

[71] SCHEBEN A, EDWARDS D. Genome editors take on crops.Science,2017, 355(6330): 1122-1123.

[72] LIU D F, CHEN X J, LIU J Q, YE J C, GUO Z J. The rice ERF transcription factorOsERF922negatively regulates resistance toMagnaporthe oryzaeand salt tolerance.Journal of Experimental Botany, 2012, 63(10): 3899-3912.

[73] HU Y, ZHANG J, JIA H, SOSSO D, LI T, FROMMER W B, YANG B,WHITE F F, WANG N, JONES J B.Lateral organ boundaries 1is a disease susceptibility gene for citrus bacterial canker disease.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(4): 521-529.

[74] OKUZAKI A, SHIMIZU T, KAKU K, KAWAI K, TORIYAMA K. A novel mutated acetolactate synthase gene conferring specific resistance to pyrimidinyl carboxy herbicides in rice.Plant Molecular Biology, 2007, 64(1/2): 219-224.

[75] SHI J, HABBEN J E, ARCHIBALD R L, DRUMMOND B J,CHAMBERLIN M A, WILLIAMS R W, LAFITTE H R, WEERS B P.Overexpression of ARGOS genes modifies plant sensitivity to ethylene, leading to improved drought tolerance in bothArabidopsisand maize.Plant Physiology, 2015, 169(1): 266-282.

[76] GAO P, YANG H, RAJASHANKAR K R, HUANG Z, PATEL D J.Type V CRISPR-Cas Cpf1 endonuclease employs a unique mechanism for crRNA-mediated target DNA recognition.Cell Research, 2016,26(8): 901-913.

[77] ENDO A, MASAFUMI M, KAYA H, TOKI S. Efficient targeted mutagenesis of rice and tobacco genomes using Cpf1 fromFrancisella novicida.Scientific Reports, 2016, 6: 38169.

[78] FONFARA I, RICHTER H, BRATOVIC M, LE RHUN A,CHARPENTIER E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.Nature, 2016, 532(7600):517-521.

[79] YAMANO T, NISHIMASU H, ZETSCHE B, HIRANO H,SLAYMAKER I M, LI Y, FEDOROVA I, NAKANE T, MAKAROVA K S, KOONIN E V, ISHITANI R, ZHANG F, NUREKI O. Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA.Cell,2016, 165(4): 949-962.

[80] DONG D, REN K, QIU X, ZHENG J, GUO M, GUAN X, LIU H, LI N, ZHANG B, YANG D, MA C, WANG S, WU D, MA Y, FAN S,WANG J, GAO N, HUANG Z. The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA.Nature, 2016, 532(7600): 522-526.

[81] LEI C, LI S Y, LIU J K, ZHENG X, ZHAO G P, WANG J. The CCTL(Cpf1-assisted Cutting and Taq DNA ligase-assisted Ligation) method for efficient editing of large DNA constructsin vitro.Nucleic Acids Research, 2017, 45(9): e47.

[82] KLEINSTIVER B P, TSAI S Q, PREW M S, NGUYEN N T, WELCH M M, LOPEZ J M, MCCAW Z R, ARYEE M J, JOUNG J K.Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells.Nature Biotechnology, 2016, 34(8): 869-874.

[83] KIM D, KIM J, HUR J K, BEEN K W, YOON S H, KIM J S.Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells.Nature Biotechnology, 2016, 34(8): 863-868.

[84] KIM H, KIM S T, RYU J, KANG B C, KIM J S, KIM S G.CRISPR/Cpf1-mediated DNA-free plant genome editing.Nature Communications, 2017, 8: 14406.

[85] TANG X, LOWDER L G, ZHANG T, MALZAHN A A, ZHENG X,VOYTAS D F, ZHONG Z, CHEN Y, REN Q, LI Q, KIRKLAND E R,ZHANG Y, QI Y. A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants.Nature Plants, 2017, 3: 17018.

[86] HU X, WANG C, LIU Q, FU Y, WANG K. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cpf1 system.Journal of Genetics and Genomics,2017, 44(1): 71-73.

[87] WANG M, MAO Y, LU Y, TAO X, ZHU J K. Multiplex gene editing in rice using the CRISPR-Cpf1 system.Molecular Plant, 2017, 10(7):1011-1013.

[88] KOMOR A C, KIM Y B, PACKER M S, ZURIS J A, LIU D R.Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.Nature, 2016, 533(7603): 420-424.

[89] LU Y, ZHU J K. Precise editing of a target base in the rice genome using a modified CRISPR/Cas9 system.Molecular Plant, 2017, 10(3):523-525.

[90] LI J, SUN Y, DU J, ZHAO Y, XIA L. Generation of targeted point mutations in rice by a modified CRISPR/Cas9 system.Molecular Plant, 2017, 10(3): 526-529.

[91] ZONG Y, WANG Y, LI C, ZHANG R, CHEN K, RAN Y, QIU J L,WANG D, GAO C. Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion.Nature Biotechnology, 2017, 35(5):438-440.

[92] WALTZ E. CRISPR-edited crops free to enter market, skip regulation.Nature Biotechnology, 2016, 34(6): 582.

[93] WOO J W, KIM J, KWON S I, CORVALAN C, CHO S W, KIM H,KIM S G, KIM S T, CHOE S, KIM J S. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.Nature Biotechnology, 2015, 33(11): 1162-1164.

[94] CHO S W, LEE J, CARROLL D, KIM J S, LEE J. Heritable gene knockout inCaenorhabditis elegansby direct injection of Cas9-sgRNA ribonucleoproteins.Genetics, 2013, 195(3): 1177-1180.

[95] KIM S, KIM D, CHO S W, KIM J, KIM J S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.Genome Research, 2014, 24(6): 1012-1019.

[96] SUBBURAJ S, CHUNG S J, LEE C, RYU S M, KIM D H, KIM J S,BAE S, LEE G J. Site-directed mutagenesis inPetunia×hybridaprotoplast system using direct delivery of purified recombinant Cas9 ribonucleoproteins.Plant Cell Reports, 2016, 35(7): 1535-1544.

[97] LIANG Z, CHEN K, LI T, ZHANG Y, WANG Y, ZHAO Q, LIU J,ZHANG H, LIU C, RAN Y, GAO C. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes.Nature Communications, 2017, 8: 14261.

[98] CERMAK T, DOYLE E L, CHRISTIAN M, WANG L, ZHANG Y,SCHMIDT C, BALLER J A, SOMIA N V, BOGDANOVE A J,VOYTAS D F. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.Nucleic Acids Research, 2011, 39(12): e82.

[99] SHAN Q, WANG Y, CHEN K, LIANG Z, LI J, ZHANG Y, ZHANG K, LIU J, VOYTAS D F, ZHENG X, ZHANG Y, GAO C. Rapid and efficient gene modification in rice andBrachypodiumusing TALENs.Molecular Plant, 2013, 6(4): 1365-1368.

[100] ZHANG H, GOU F, ZHANG J, LIU W, LI Q, MAO Y, BOTELLA J R, ZHU J K. TALEN-mediated targeted mutagenesis produces a largevariety of heritable mutations in rice.Plant Biotechnology Journal,2016, 14: 186-194.

[101] ZHANG H, ZHANG J, WEI P, ZHANG B, GOU F, FENG Z, MAO Y, YANG L, ZHANG H, XU N, ZHU J K. The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation.Plant Biotechnology Journal, 2014, 12(6): 797-807.

[102] MA X, LIU Y G. CRISPR/Cas9-based multiplex genome editing in monocot and dicot plants.Current Protocols in Molecular Biology,2016, 115: 31.6.1-31.6.21.

[103] FU Y, FODEN J A, KHAYTER C, MAEDER M L, REYON D,JOUNG J K, SANDER J D. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.Nature Biotechnology,2013, 31(9): 822-826.

[104] ENDO M, MIKAMI M, TOKI S. Multigene knockout utilizing off-target mutations of the CRISPR/Cas9 system in rice.Plant and Cell Physiology, 2015, 56(1): 41-47.

[105] SCHAEFER K A, WU W-H, COLGAN D F, TSANG S H, BASSUK A G, MAHAJAN V B. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editinginvivo.Nature Methods, 2017, 14(6): 547-548.

[106] KHANDAGALE K, NADAF A. Genome editing for targeted improvement of plants.Plant Biotechnology Reports, 2016, 10(6):327-343.

[107] LEDFORD H. US regulation misses some GM crops.Nature, 2013,500: 389-390.

[108] JONES H D. Regulatory uncertainty over genome editing.Nature Plants, 2015, 1: 14011.

[109] HUANG S, WEIGEL D, BEACHY R N, LI J. A proposed regulatory framework for genome-edited crops.Nature Genetics, 2016, 48(2):109-111.

[110] Where genome editing is needed.Nature Genetics, 2016, 48(2): 103.

[111] KLEINSTIVER B P, PATTANAYAK V, PREW M S, TSAI S Q,NGUYEN N T, ZHENG Z, JOUNG J K. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.Nature,2016, 529(7587): 490-495.

[112] SLAYMAKER I M, GAO L, ZETSCHE B, SCOTT D A, YAN W X,ZHANG F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.Science, 2016, 351(6268): 84-88.

[113] GAO L, COX D B T, YAN W X, MANTEIGA J C, SCHNEIDER M W, YAMANO T, NISHIMASU H, NUREKI O, CROSETTO N,ZHANG F. Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities.Nature Biotechnology, 2017 Jun 05. doi: 10.1038/nbt.3900.

[114] HU X, MENG X, LIU Q, LI J, WANG K. Increasing the efficiency of CRISPR-Cas9-VQR precise genome editing in rice.Plant Biotechnology Journal, 2017 Jun 12. doi: 10.1111/pbi.12771.

[115] WANG M, LU Y, BOTELLA J R, MAO Y, HUA K, ZHU J K. Gene targeting by homology-directed repair in rice using a geminivirusbased CRISPR/Cas9 system.Molecular Plant, 2017, 10(7): 1007-1010.