番荔枝花發(fā)育不同階段的差異蛋白質(zhì)組分析

劉鍇棟，莫億偉，馮少嫻，吳婉儀，黎海利，鐘軍弟，袁長(zhǎng)春

（1嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江 524048；2紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江紹興 312000）

0 引言

【研究意義】番荔枝（Annona squamosaL.）又稱(chēng)林檎、釋迦果，為番荔枝科（Annonaceae）落葉小喬木，是熱帶、亞熱帶優(yōu)稀水果。番荔枝在中國(guó)南方如廣東、福建、海南、廣西等省均有大面積種植[1-4]。番荔枝的芽為復(fù)芽，其腋芽被葉柄抱嵌，若葉片不脫落，腋芽一般不會(huì)萌發(fā)。在生長(zhǎng)季節(jié)，主要將老熟枝條中任一節(jié)位的葉片摘除，并結(jié)合剪頂或摘心，腋芽就可以抽發(fā)新梢，先發(fā)新梢 80%以上能成花[3]。此外，番荔枝的花具有雌雄異熟和雌蕊先熟的特性，往往出現(xiàn)“花而不實(shí)”、坐果不良和結(jié)果不穩(wěn)定等現(xiàn)象，且自然授粉坐果率很低，這制約了番荔枝產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展[5-6]。通過(guò)對(duì)比花發(fā)育不同階段的差異表達(dá)蛋白，可以找出與番荔枝花發(fā)育相關(guān)的重要蛋白。雙向電泳技術(shù)（Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）是一種根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和相對(duì)分子量的不同來(lái)進(jìn)行分離的技術(shù)，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要手段之一[7]。運(yùn)用2-DE技術(shù)分離花發(fā)育不同階段的差異表達(dá)蛋白，并對(duì)差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和功能分析，對(duì)研究番荔枝花發(fā)育機(jī)理具有重要的理論意義。【前人研究進(jìn)展】開(kāi)花是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段向生殖生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變的一個(gè)重要時(shí)間點(diǎn)。一個(gè)完整的花發(fā)育過(guò)程包括花誘導(dǎo)、花萌發(fā)和花器官成熟等[8]。利用不斷進(jìn)步的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，花發(fā)育過(guò)程中的差異蛋白譜已在多種植物得到解析。利用 2-DE技術(shù)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)代謝過(guò)程參與了苜蓿開(kāi)花過(guò)程。這可能為苜?；òl(fā)育提供了能量基礎(chǔ)[9]。通過(guò)對(duì)樺樹(shù)不同花發(fā)育時(shí)期蛋白變化的分析，揭示了蛋白變化與特定花發(fā)育階段的內(nèi)在關(guān)聯(lián)[10]。此外，通過(guò)比較花器官發(fā)育正常和不正常的花器官蛋白質(zhì)圖譜，為改良花發(fā)育，提高成花率提供了大量候選蛋白。通過(guò)對(duì)龍眼成花轉(zhuǎn)變與成花逆轉(zhuǎn)的蛋白譜分析，發(fā)現(xiàn)了41個(gè)差異蛋白，這些蛋白為研究龍眼成花逆轉(zhuǎn)的生物學(xué)過(guò)程提供了基礎(chǔ)[11]。王珊[12]比較了梅樹(shù)完全花和不完全花的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)差異蛋白與糖代謝、淀粉代謝以及光合作用有關(guān)。比較日本白梅正?；ê彤惓；ǎl(fā)現(xiàn)白梅雌蕾的發(fā)育依賴(lài)于多個(gè)生理生化過(guò)程[13]。筆者課題組前期對(duì)番荔枝花發(fā)育的分子機(jī)理進(jìn)行了初步的研究，利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)番荔枝從花芽到開(kāi)花等4個(gè)不同階段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得71 948條Unigenes序列信息，并發(fā)現(xiàn)番荔枝花發(fā)育不同階段都進(jìn)行著各種旺盛的生物合成和代謝活動(dòng)，且4個(gè)開(kāi)花調(diào)控途徑（光周期途徑、春化途徑、自主途徑、GA調(diào)控途徑）均已啟動(dòng)[14]。此外，筆者課題組成功克隆了AsLEAFY、AsAG等花發(fā)育相關(guān)基因，并發(fā)現(xiàn)這些基因可能都參與了番荔枝花發(fā)育過(guò)程和對(duì)激素信號(hào)的響應(yīng)[3-4]。【本研究切入點(diǎn)】對(duì)于番荔枝花發(fā)育過(guò)程的蛋白表達(dá)變化情況，獲得的信息還不多，有待進(jìn)一步研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用雙向電泳和質(zhì)譜鑒定技術(shù)對(duì)番荔枝花發(fā)育不同階段蛋白差異表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，確定其功能，以找出與番荔枝花發(fā)育有關(guān)的蛋白，從蛋白水平上為揭示番荔枝花發(fā)育的分析機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年6月至2016年12月在嶺南師范學(xué)院試驗(yàn)地及嶺南師范學(xué)院熱帶果樹(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

番荔枝sugar-apple（Annona squamosaL.）栽培于試驗(yàn)地，品種為‘普通番荔枝’，樹(shù)齡為5年，常規(guī)栽培管理。于2015年7—8月分別采集4個(gè)階段的花，分別為花芽（1 mm＜花芽＜2 mm）（A）、花蕾（5 mm＜花蕾＜6 mm）（B）、開(kāi)花前期（花瓣輕微張開(kāi)）的花（C）及開(kāi)花期（花瓣張開(kāi)）的花（D）。取樣后立即用液氮速凍后保存于-80℃冰箱中，用于雙向電泳分析。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)的提取及含量測(cè)定 稱(chēng)取1 g番荔枝花樣品在液氮中研磨，研磨過(guò)程加入100 mg PVPP，樣品懸浮于 10 mL提取液，再加入10 mL Tris飽和酚，充分混合后，4℃下，20 000×g離心30 min，吸出上層酚相，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，再加入跟酚相同體積的提取液，以上步驟重復(fù)兩次。最后一次取出來(lái)的酚相再加入酚的5倍體積的醋酸銨甲醇溶液對(duì)蛋白進(jìn)行沉淀，充分振蕩后，-20℃沉淀過(guò)夜。沉淀過(guò)夜的蛋白質(zhì)4℃存放，然后20 000×g，離心30 min倒掉上清液，加入5 mL甲醇對(duì)蛋白進(jìn)行洗滌，用移液器反復(fù)吹打均勻后4℃存放，20 000×g，離心30 min。重復(fù)一次操作。加入5 mL丙酮對(duì)蛋白進(jìn)行洗滌，用移液器反復(fù)吹打均勻后 4℃存放，20 000×g，離心 30 min。重復(fù)一次操作。洗滌兩次之后加入4 mL丙酮，吹打均勻后將蛋白質(zhì)平均分到4支1.5 mL EP管中，4℃下，20 000×g離心20 min。倒去上清液后，室溫干燥得到沉淀的蛋白團(tuán)塊。在干燥后的蛋白質(zhì)團(tuán)塊中加入 200 μL RB（7 mol·L-1Urea、2 mol·L-1Thiourea、4% CHAPS），將蛋白質(zhì)充分分散。超聲助溶，80 W，0.8 s開(kāi)，0.8 s關(guān)，超聲4下后放于冰上冷卻，再重復(fù)1次，超聲后，4℃下，20 000×g，離心20 min，取出上清液，采用Bradford蛋白定量方法測(cè)定蛋白濃度，保存在-80℃超低溫冰箱。

1.2.2 雙向電泳

1.2.2.1 第一向固相pH梯度等電聚焦 雙向電泳第一向采用長(zhǎng)度24 cm，pH 4—7的線(xiàn)性干膠條，取120 μg蛋白提取液與水化緩沖液（1% DTT、1% IPG Buffer、1×BPB、RB）混合至總體積460 μL，混合液加入到GE水化盤(pán)的槽中，覆蓋上干膠條，膠面朝下，泡脹過(guò)夜（10—12 h）。第二天，把泡脹好的膠條轉(zhuǎn)移到GE的等電聚焦盤(pán)，按照以下參數(shù)進(jìn)行聚焦：500 V聚焦1 h；1 000 V聚焦1 h；從1 000 V在3 h內(nèi)升到8 000 V；8 000 V聚焦 5 h 36 min。第一向電泳結(jié)束后，將膠條置于平衡緩沖液（50 mmol·L-1Tris-HCl、6 mol·L-1Urea、30% Glycerol、2% SDS、0.002%Bromophenol blue）振蕩2次，每次15 min。第一次平衡和第二次平衡分別在緩沖液中加入 100 mmol·L-1DTT和250 mmol·L-1IAA，IAA平衡時(shí)要避光。平衡完畢后取出膠條輕輕潤(rùn)洗，并去除多余的平衡緩沖液，準(zhǔn)備第二向電泳。

1.2.2.2 第二向 SDS-PAGE電泳 將平衡好的膠條置于第二向凝膠上方，排除氣泡使二者緊密接觸，用 1%瓊脂糖凝膠封固膠條，接通電源。第一階段2 W/Gel 1 h；第二階段17 W/Gel，直至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底端，約4.5 h。雙向電泳結(jié)束后，SDS-PAGE 凝膠置于固定液（100 mL 乙醇、25 mL冰醋酸、50%超純水）中固定2 h以上；凝膠固定后，將其轉(zhuǎn)移到敏化液（75 mL 乙醇、0.788 g硫代硫酸鈉、17 g無(wú)水乙酸鈉），敏化1 h；超純水沖洗4次，每次10 min；加入銀染液染色（0.625 g硝酸銀加蒸餾至250 mL）1 h；超純水沖洗2次，每次1 min；顯色液顯色（6.25 g碳酸鈉、100 μL甲醛，加蒸餾水至250 mL）；顯色8 min后用終止液終止（3.65 g Na2EDTA·H2O 加蒸餾水至250 mL），終止時(shí)間為45 min；最后用超純水沖洗2次，每次30 min。

1.2.3 質(zhì)譜鑒定與數(shù)據(jù)庫(kù)分析 MICROTEK ScanMaker i800掃描儀掃描脫色后的凝膠，用Image master 2D 5.0軟件分析 4個(gè)階段的凝膠圖譜，采用YANG等[15]的方法，使用蛋白相對(duì)表達(dá)體積（%VOL）來(lái)表述每一個(gè)匹配蛋白點(diǎn)在不同時(shí)期的表達(dá)豐度。差異蛋白點(diǎn)為相對(duì)表達(dá)豐度上調(diào)（出現(xiàn)）或下調(diào)（消失）差異大于2倍（Ratio＞2.0），并且在統(tǒng)計(jì)學(xué) T 檢驗(yàn)上P＜0.05（Student’s t test）的蛋白質(zhì)。差異蛋白點(diǎn)使用 Ultraflex Ⅲ MALDL-TOF-MS質(zhì)譜儀（Bruker公司，美國(guó)）進(jìn)行分析，同時(shí)利用得到的 peaklist 文件進(jìn)行在線(xiàn)MASCOT（http://www.Matrixscience.com）檢索。以檢索結(jié)果中分?jǐn)?shù)最高，并且超過(guò)mascot系統(tǒng)閾值的蛋白為最可信蛋白。應(yīng)用 GO數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.geneontology.org/）計(jì)算每一個(gè)GO分類(lèi)（term）的差異蛋白數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1 番荔枝花發(fā)育不同階段的蛋白點(diǎn)表達(dá)豐度分析

為了找到與番荔枝花發(fā)育相關(guān)的蛋白，以番荔枝為材料，收集了番荔枝花發(fā)育4個(gè)階段的樣本材料（圖1）。進(jìn)一步運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，獲得了 4個(gè)樣本的雙向電泳圖譜（圖 2）。通過(guò)蛋白圖譜比較分析發(fā)現(xiàn)，番荔枝花雙向電泳圖譜中的每張凝膠圖譜上都可以檢測(cè)到800多個(gè)重復(fù)蛋白點(diǎn)。通過(guò)控制2倍上、下調(diào)來(lái)篩選不同階段的差異蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其中有50個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)豐度在不同階段花之間存在差異。

圖1 番荔枝花發(fā)育不同階段材料Fig. 1 Materials of different developmental stages of sugar apple flowers

2.2 差異蛋白點(diǎn)的鑒定及功能分類(lèi)

50個(gè)差異蛋白點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜鑒定分析，并采用MASCOT在線(xiàn)（http://www.atrixscience.com）檢索，結(jié)果有36個(gè)得到成功鑒定，蛋白質(zhì)鑒定成功率為72%（表1）。鑒定出的36個(gè)蛋白質(zhì)可分為7個(gè)主要的功能類(lèi)別，且不同功能類(lèi)別蛋白所占比例各不相同。這些功能類(lèi)別包括：呼吸與能量代謝（11個(gè)蛋白質(zhì)，30.6%），蛋白合成與代謝（8個(gè)蛋白質(zhì)，22.2%），轉(zhuǎn)錄與翻譯（3個(gè)蛋白質(zhì)，8.3%），脅迫與防御（2個(gè)蛋白質(zhì)，5.6%），細(xì)胞分化與增殖（3個(gè)蛋白質(zhì)，8.3%），次生物質(zhì)代謝（8個(gè)蛋白質(zhì)，22.2%）和未知功能蛋白（1個(gè)蛋白質(zhì)，2.8%）。

2.3 差異蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析

利用PROSITE_Prorule程序，預(yù)測(cè)所有鑒定得到的差異蛋白的亞細(xì)胞定位。研究表明，共有29個(gè)蛋白具有顯著的亞細(xì)胞定位特征。其中，12個(gè)差異蛋白定位于細(xì)胞液中，組成了最大的一類(lèi)亞細(xì)胞定位蛋白。另有11個(gè)蛋白分別定位于葉綠體及3個(gè)葉綠體相關(guān)的亞細(xì)胞器中，包括2個(gè)葉綠體類(lèi)囊體膜蛋白，2個(gè)葉綠體類(lèi)囊體內(nèi)腔蛋白，2個(gè)葉綠體膜定位蛋白，5個(gè)葉綠體定位蛋白。此外，還有1個(gè)蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)膜上，2個(gè)蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)孔中（圖3）。

2.4 差異表達(dá)蛋白點(diǎn)GO功能分析

應(yīng)用GO數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)成功鑒定的差異蛋白進(jìn)行注釋及功能分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)36個(gè)鑒定到的蛋白，分別歸屬于20個(gè)GO分類(lèi)（term）（部分蛋白歸屬于2個(gè)或2個(gè)以上的GO分類(lèi)）。其中，25個(gè)蛋白質(zhì)屬于離子結(jié)合分類(lèi)（GO：0043167）。其他擁有超過(guò)兩個(gè)差異蛋白的GO分類(lèi)分別為：跨膜運(yùn)輸載體活性分類(lèi)（GO：0022857，3個(gè)蛋白），ATG 酶活性分類(lèi)（GO：0016887，3個(gè)蛋白），非折疊蛋白結(jié)合分類(lèi)（GO：0051082，2個(gè)蛋白），激酶活性分類(lèi)（GO：0016301，2個(gè)蛋白），裂解酶活性分類(lèi)（GO：0016829，2個(gè)蛋白），翻譯因子活性分類(lèi)（GO：0008135，2個(gè)蛋白）（圖4）。

圖3 番荔枝花發(fā)育不同時(shí)期相關(guān)差異表達(dá)蛋白亞細(xì)胞定位分析Fig. 3 Subcellular localization analysis of deferentially expressed proteins in different developmental stages of sugar-apple flowers

表1 番荔枝花發(fā)育不同階段的差異表達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 1 Identification of deferentially expressed protein spots by MALDL-TOF-MS and database searching in different developmental stages of sugar-apple flowers

續(xù)表1 Continued table 1

2.5 差異蛋白點(diǎn)的表達(dá)趨勢(shì)分析

在上述鑒定到的蛋白中，部分蛋白表達(dá)量隨著花發(fā)育而逐漸上調(diào)，部分蛋白表達(dá)則逐漸下調(diào)。依據(jù)所得蛋白的不同分組，分析36個(gè)蛋白在番荔枝花發(fā)育4個(gè)不同階段的表達(dá)豐度差異。在11個(gè)呼吸與能量代謝相關(guān)蛋白中，3個(gè)蛋白（A07、C28、C42）隨著花發(fā)育表達(dá)量不斷下降，而另外 4個(gè)蛋白（A36、A37、B13、B29）則表達(dá)量顯著上升。在蛋白合成與代謝相關(guān)蛋白中，2個(gè)蛋白（A13和A22）在花發(fā)育的4個(gè)階段都處于低水平表達(dá)，而另5個(gè)蛋白（B17、B20、A19、A21和 C21）表達(dá)量顯著上升。一個(gè)脅迫與防御相關(guān)蛋白（B32）在開(kāi)花期表達(dá)量達(dá)到最大值。2個(gè)細(xì)胞分化與增殖相關(guān)蛋白（B27和C57）表達(dá)也呈逐漸升高的趨勢(shì)。5個(gè)次生物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白（A06、A29、A34、C100和C110）隨著花發(fā)育而表達(dá)逐漸降低，蛋白質(zhì)C79和D38在花蕾階段表達(dá)達(dá)到最大值后，又逐漸呈下降趨勢(shì)（圖5）。

3 討論

在鑒定得到的差異蛋白中，呼吸與能量代謝所占的比例最大。前人研究表明，能量代謝與植物花發(fā)育過(guò)程有著密切的聯(lián)系[16]。在煙草中的研究表明，多個(gè)糖代謝關(guān)鍵酶，如 UDP-glucose pyrophosphorylase，sucrose synthase和sucrose phosphate synthase，被發(fā)現(xiàn)與花發(fā)育有關(guān)[17]。同樣，通過(guò) 2D-PAGE技術(shù)，人們發(fā)現(xiàn)糖代謝、淀粉代謝、光合作用和光呼吸相關(guān)蛋白的表達(dá)為白梅正常開(kāi)花的必要條件[13]。在本研究中，多個(gè)能量代謝相關(guān)蛋白，如兩個(gè)ATP合酶α亞基和丙酮酸脫羧化同工酶，都在番荔枝花發(fā)育過(guò)程呈現(xiàn)顯著的差異表達(dá)。這可能與花發(fā)育過(guò)程需要耗費(fèi)大量的能量有關(guān)。

圖4 鑒定蛋白的功能分類(lèi)圖Fig. 4 Functional categories of the identified proteins

圖5 差異蛋白的表達(dá)趨勢(shì)分析Fig. 5 Expression pattern analysis of deferentially expressed proteins

此外，在本研究所鑒定的差異蛋白中，第二大類(lèi)別為蛋白質(zhì)合成與代謝相關(guān)蛋白。有報(bào)道表明，荔枝花發(fā)育期，蛋白質(zhì)合成總體上逐漸增強(qiáng)[18]。在棉花花粉發(fā)育過(guò)程中，大量與酯酶和過(guò)氧化物酶同工酶相關(guān)的蛋白質(zhì)被合成[19]。在本研究中，8個(gè)與蛋白合成與代謝相關(guān)的蛋白被鑒定為差異蛋白，這表明番荔枝花發(fā)育的不同階段需要不同的蛋白質(zhì)參與。而細(xì)胞的分化與增殖和花發(fā)育的關(guān)系則有較多的報(bào)道。人們研究發(fā)現(xiàn)花發(fā)育的過(guò)程，即是花器官分化和增殖的過(guò)程[20]。在擬南芥中，眾多的基因，如TSO1、AIL6等控制著花序頂端分生組織的分化與增殖[21-22]。本研究還報(bào)道了兩個(gè)含有三角狀五肽重復(fù)蛋白（Pentatricopeptide repeat-containing protein），它們的表達(dá)隨著番荔枝花發(fā)育階段的變化而改變，這些蛋白在花發(fā)育過(guò)程中的功能還有待于進(jìn)一步研究。

植物次生代謝及其產(chǎn)物與花發(fā)育緊密相連[23]。2-DE凝膠電泳分析揭示大花茉莉整個(gè)次生代謝網(wǎng)絡(luò)，其中花青素的降解、揮發(fā)物的形成與其開(kāi)花有關(guān)[24]。高溫影響甜椒（Capsicum annuumL.）花粉管的萌發(fā)，而次生代謝的一個(gè)關(guān)鍵酶——果糖激酶，參與其溫度依賴(lài)的花粉管萌發(fā)[25]。本試驗(yàn)也鑒定了番荔枝果糖激酶，這表明它可能與番荔枝花粉管的萌發(fā)有關(guān)。

植物花發(fā)育過(guò)程包括翻譯水平、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控等，其分子調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜。在鑒定得到的36個(gè)差異蛋白中，有3個(gè)蛋白與轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)，這正說(shuō)明番荔枝的花發(fā)育，也是一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控與蛋白翻譯調(diào)控并存的過(guò)程。除了以上蛋白外，還鑒定得到一個(gè)功能未知的蛋白C103，這可能和番荔枝蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的信息較少有關(guān)。

前期筆者通過(guò)高通量測(cè)序的手段，分析了番荔枝花不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。結(jié)合蛋白表達(dá)譜的分析，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在一定相關(guān)性。在轉(zhuǎn)錄組中，差異表達(dá)基因的27.67%與番荔枝的代謝過(guò)程有關(guān)[14]。而在本研究中，共有 22.2%的差異表達(dá)蛋白與次生物質(zhì)代謝相關(guān)。兩者各自占差異基因和差異蛋白的比例非常接近。與呼吸與能量代謝相關(guān)的差異蛋白中，V型質(zhì)子ATP酶亞基B2、磷酸丙糖轉(zhuǎn)運(yùn)器、脫氧鳥(niǎo)苷-5'-三磷酸酶、丙酮酸脫羧化同工酶 1、丙酮酸脫羧化同工酶2、噻唑生物合成酶等6個(gè)蛋白在前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中都能關(guān)聯(lián)到相應(yīng)的差異基因。且 V型質(zhì)子 ATP酶亞基B2、丙酮酸脫羧化同工酶1和噻唑生物合成酶這 3個(gè)蛋白與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中相關(guān)基因的表達(dá)趨勢(shì)一致，推測(cè)這些蛋白與番荔枝花發(fā)育密切相關(guān)。而在蛋白質(zhì)合成與代謝途徑中，谷氨酰胺合成酶和RuBisCO大亞基-結(jié)合蛋白α這2個(gè)蛋白與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的相關(guān)基因都呈現(xiàn)出不斷上調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)。在煙草中過(guò)量表達(dá)谷氨酰胺合成酶改變了植株的開(kāi)花時(shí)間及氮的合成[26]。在朝天椒的雄性不育系及其恢復(fù)系的差異蛋白質(zhì)組研究中也鑒定到了 RuBisCO大亞基-結(jié)合蛋白α[27]。這些結(jié)果都暗示著這 2個(gè)蛋白可能在番荔枝花發(fā)育進(jìn)程中的蛋白質(zhì)合成代謝途徑中發(fā)揮著重要的作用。此外，在轉(zhuǎn)錄與翻譯途徑中，富含亮氨酸重復(fù)序列的活性蛋白受體激酶蛋白在前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找到了9個(gè)與其相對(duì)應(yīng)的基因。在擬南芥中，富含亮氨酸重復(fù)序列的活性蛋白受體激酶蛋白與花粉管的生長(zhǎng)密切相關(guān)[28-29]。有趣的是，在轉(zhuǎn)錄組中共有187個(gè)與植物脅迫及防御相關(guān)的基因被鑒定為差異基因。在玉米早期花藥蛋白質(zhì)組分析中也找到較多的脅迫與防御相關(guān)的基因[30]。而在本試驗(yàn)中，兩個(gè)與植物防御相關(guān)的蛋白，多酚氧化酶和咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，也得到了鑒定。多酚氧化酶和咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分別關(guān)聯(lián)到3個(gè)和1個(gè)與它們表達(dá)趨勢(shì)一致的差異基因。推測(cè)這兩個(gè)蛋白可能參與了番荔枝花發(fā)育脅迫與防御應(yīng)答過(guò)程。蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組之間的更多相關(guān)性以及關(guān)聯(lián)到的差異蛋白與番荔枝花發(fā)育之間的關(guān)系，還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

通過(guò)比較番荔枝4個(gè)不同花發(fā)育階段的蛋白表達(dá)圖譜，鑒定得到36個(gè)差異蛋白，注釋并分析了它們參與的生物學(xué)功能。其中包括11個(gè)呼吸與能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì)，8個(gè)蛋白合成與代謝相關(guān)蛋白質(zhì)，2個(gè)脅迫與防御相關(guān)蛋白質(zhì)，8個(gè)次生物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白質(zhì)，3個(gè)細(xì)胞分化與增殖相關(guān)蛋白質(zhì)，3個(gè)轉(zhuǎn)錄與翻譯相關(guān)蛋白質(zhì)和一個(gè)未知功能蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，能量代謝、次生代謝、蛋白質(zhì)合成等生物過(guò)程可能參與了番荔枝開(kāi)花過(guò)程的調(diào)控。

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