PCR技術(shù)在豬肉中微生物檢測(cè)的應(yīng)用分析

□ 鞏長(zhǎng)海 江蘇權(quán)正檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司

食品安全關(guān)系著人們的身體健康、社會(huì)經(jīng)濟(jì)的有序發(fā)展以及社會(huì)的和諧穩(wěn)定，保障食品安全是全社會(huì)、全人類的共同責(zé)任。食品安全中最主要面臨的問(wèn)題為食源性疾病，即通過(guò)攝食進(jìn)入人體的有害物質(zhì)引發(fā)的一類疾病，包括食物中毒、腸道感染、寄生蟲(chóng)病以及有害的化學(xué)物質(zhì)引發(fā)的疾病。

我國(guó)每年消費(fèi)大量的豬肉，作為居民副食品，豬肉的消費(fèi)占肉類總消費(fèi)比重的50%以上。但最近幾年，關(guān)于豬肉安全問(wèn)題的事件層出不窮，近十幾年來(lái)，豬肉安全問(wèn)題事件高達(dá)700多起，50%以上的食品安全事件是由違規(guī)使用瘦肉精、二噁英等化學(xué)品引發(fā)的，還有一部分來(lái)源于物理性風(fēng)險(xiǎn)。全世界每年有70%的食源性疾病患者是由致病微生物引起的。因此，微生物是引發(fā)是源性疾病的根源，在豬肉進(jìn)入市場(chǎng)之前，就有必要對(duì)其進(jìn)行致病微生物檢測(cè)，從而減少食品安全問(wèn)題事件的發(fā)生。

目前，檢測(cè)豬肉中微生物的主要技術(shù)有PCR技術(shù)、DNA探針?lè)ā⒒蛐酒?。傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)存在檢測(cè)效率低而成本高的弊端，使用受到了限制。PCR技術(shù)因高特異性、高靈敏性和簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)成為其中一種最常用的檢測(cè)方法。

1 PCR微生物檢測(cè)技術(shù)的原理

PCR技術(shù)主要是由變性、退火、延伸3個(gè)熱循環(huán)步驟構(gòu)成，即在95℃高溫下，DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃詾閮蓷lDNA單鏈，在37～55 ℃的低溫下，兩條寡核苷酸引物與DNA單鏈結(jié)合，形成部分雙鏈，然后以單核苷酸為原料，沿DNA鏈從5’端向3’端延伸，合成DNA新鏈。這樣，每個(gè)雙鏈的DNA模板經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸3個(gè)步驟的熱循環(huán)之后，形成了兩條雙鏈DNA分子，如此循環(huán)往復(fù)。

2 PCR技術(shù)在食源性微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 PCR技術(shù)檢測(cè)豬肉中的沙氏菌

沙氏菌占美國(guó)食源性疾病的30%，沙氏菌病原體也是引發(fā)我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)食源性疾病的首要病菌。沙氏門菌主要存在于豬肉中，所以對(duì)豬肉中的沙氏菌進(jìn)行快速而有效的檢測(cè)可以有效防止沙氏菌引起的食物中毒。研究者王靜等人發(fā)現(xiàn)，在脫氧膽酸鈉和疊氮溴化丙錠（PMA）的共同作用下，可以大幅度地抑制沙氏菌死菌DNA的PCR擴(kuò)增，活菌DNA的擴(kuò)增不受影響。把疊氮溴化丙錠（PMA）與微滴數(shù)字PCR技術(shù)相結(jié)合，可以針對(duì)性地對(duì)豬肉中的沙氏菌進(jìn)行有效檢測(cè)。

2.2 PCR技術(shù)檢測(cè)豬肉中的大腸桿菌

腸出血性大腸桿菌可以引發(fā)腸炎和出血性腹瀉，又被稱為大腸埃希氏菌。其中最主要的菌型是大腸桿菌，它是一種新型的腸道致病菌，是全世界公認(rèn)的人獸致病微生物，主要寄生在豬、牛、羊等動(dòng)物中。國(guó)內(nèi)研究者針對(duì)大腸桿菌的菌體抗原基因、鞭毛抗原基因、溶血素基因、緊密黏附素基因和和志賀祥毒素基因的序列，設(shè)計(jì)了6對(duì)特異性的引物和探針，快速、特異性的檢測(cè)大腸桿菌。

2.3 PCR技術(shù)檢測(cè)豬肉中金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌可以引發(fā)動(dòng)物和人體的化膿感染，產(chǎn)生的腸毒素可以造成食物中毒，腸毒素具有極高的熱穩(wěn)定性，在幾百攝氏度的高溫下也不會(huì)失活，所以，即使感染的食物經(jīng)過(guò)高溫烹煮仍然存在致病的風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)過(guò)市場(chǎng)檢測(cè)，生豬肉中金黃色葡萄球菌的檢出率接近20%，應(yīng)引起食品監(jiān)管部門的高度重視。國(guó)內(nèi)研究者李苗云等人把金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因作為靶基因，再與BP平板計(jì)數(shù)法相結(jié)合，在20℃條件下PCR熒光測(cè)定生豬肉中的金黃色葡萄球菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在穩(wěn)定期之后傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法低于熒光測(cè)定。

2.4 PCR技術(shù)檢測(cè)豬肉中的單核李斯特菌

李斯特菌是一種單核細(xì)胞增生菌，也是一種易引發(fā)人畜共患的食源性病菌。單核細(xì)胞增生菌具有嚴(yán)重的致病性，可以引發(fā)敗血癥、腦膜炎等。該病菌在5℃左右的低溫下仍然可以生長(zhǎng)和繁殖，所以大量存在于未殺菌的冷藏食品中。國(guó)內(nèi)研究者李丹丹用iap基因作為靶基因，合成引物和探針，用實(shí)時(shí)熒光定量的PCR快速檢測(cè)方法，靈敏度為6.5CFU/mL。國(guó)外研究者采用了RT-PCR法檢測(cè)低溫冷凍的豬肉中的單核李斯特菌，省掉了預(yù)富集的步驟，與其他幾十種菌株沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)，而且特異性良好。

3 結(jié)語(yǔ)

目前，PCR技術(shù)在食源性致病微生物、轉(zhuǎn)基因成分以及動(dòng)物源成分檢測(cè)中得到了非常廣泛地應(yīng)用。該技術(shù)一旦被推廣使用，將會(huì)大大縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率，食品檢測(cè)水平也隨之提高。但是，PCR技術(shù)也存在一定的缺陷：如果致病微生物發(fā)生高度變異，會(huì)使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性；用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品不同，結(jié)果沒(méi)有參考價(jià)值。PCR技術(shù)可以對(duì)豬肉中的微生物進(jìn)行定量檢測(cè)，還可以應(yīng)用拓展到更多的食品安全領(lǐng)域。