可見/近紅外高光譜成像技術(shù)對(duì)冷藏過(guò)程中原料乳細(xì)菌總數(shù)的無(wú)損檢測(cè)

□ 趙文靜 內(nèi)蒙古自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院 崔騰飛 陳錦華 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院

1 引言

在單一食品中，牛乳被稱為為數(shù)不多的營(yíng)養(yǎng)完全食品之一[1-2]。原料乳（生鮮牛奶）含有蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖和各種維生素以及礦物質(zhì)等一百多種人體需要的營(yíng)養(yǎng)元素，但也正是因?yàn)槿绱?，原料乳中蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)極易被微生物分解利用，在貯藏過(guò)程中生長(zhǎng)、繁殖，導(dǎo)致原料乳品質(zhì)變化。原料乳位于奶業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈的最上游，所以其質(zhì)量安全將直接影響到乳制品的質(zhì)量與安全，而原料乳細(xì)菌總數(shù)是衡量生牛乳原料的重要指標(biāo)，所以檢測(cè)原料乳細(xì)菌總數(shù)對(duì)控制原料乳質(zhì)量與安全至關(guān)重要。

傳統(tǒng)檢測(cè)原料乳中細(xì)菌總數(shù)指標(biāo)按照GB478.2-2010方法進(jìn)行的，此檢測(cè)方法是基于平板培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)，需耗時(shí)48 h，且檢測(cè)結(jié)果也存在著嚴(yán)重的滯后性，并且容易導(dǎo)致在原料奶的儲(chǔ)藏和運(yùn)輸環(huán)節(jié)造成二次污染，無(wú)法滿足原料乳快速、安全等的驗(yàn)收要求。因此，實(shí)時(shí)、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)原料乳中細(xì)菌總數(shù)對(duì)加強(qiáng)原料乳質(zhì)量控制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。現(xiàn)今用于原料乳快速檢測(cè)方法有顯微鏡檢測(cè)、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法45、還原實(shí)驗(yàn)法光電法、ATP熒光計(jì)數(shù)法、PCR技術(shù)等。各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但沒(méi)有一項(xiàng)技術(shù)同時(shí)具有快速、準(zhǔn)確、無(wú)需樣品預(yù)處理、實(shí)時(shí)、無(wú)損等優(yōu)點(diǎn)，高光譜成像技術(shù)是基于非常多窄波段的影像數(shù)據(jù)技術(shù)，具有非常豐富的吸收譜帶，能夠識(shí)別樣品的大量信息，并將圖譜合二為一，是單一的光譜或者圖譜無(wú)法比擬的，最大的特點(diǎn)是能夠?qū)资畟€(gè)乃至幾百個(gè)窄波段以進(jìn)行連續(xù)的光譜覆蓋，而且光譜分辨率高、操作方便等[2-3]，用平均光譜反映樣本，建立原料乳檢測(cè)模型、相關(guān)性好，能夠滿足方便、快速、無(wú)損、準(zhǔn)確等檢測(cè)原料乳細(xì)菌總數(shù)的要求。

本文以原料乳為研究對(duì)象，利用可見/近紅外高光譜成像技術(shù)采集樣品400～1 000 nm的光譜數(shù)據(jù)，選取正交信號(hào)校正法（orthogonal signal correction，OSC）、多元散射校正（Multiple Scattering Correction，MSC）、 卷 積平 滑（Savitzky－ Golay，SG） 3種預(yù)處理方法減少噪音干擾，結(jié)合PLSR建模方法優(yōu)選最佳的預(yù)處理方法；使用連續(xù)投影算法（Successie Projection Algorithm，SPA）、 無(wú) 信息消除變量（Uninformative Variable Elimination，UVE）等2種數(shù)據(jù)降維方法，結(jié)合使用偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR） 建模方法分別對(duì)全波段和特征波段建模；選取最優(yōu)模型，為原料乳中細(xì)菌總數(shù)的快速檢測(cè)奠定理論基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 材料與試劑

樣品來(lái)源于寧夏銀川市平吉堡牧場(chǎng)乳樣，每份原料乳為100 mL。將獲得的奶罐新鮮乳樣快速置于滅菌取樣瓶中，4 ℃恒溫保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室，編號(hào)之后置于冰箱中4 ℃冷藏。每天測(cè)試一次（貯藏期1～7 d，共計(jì)七次），每次隨機(jī)取20個(gè)乳樣作為試驗(yàn)樣本，用于高光譜數(shù)據(jù)采集和測(cè)定細(xì)菌總數(shù)。

2.2 儀器

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的儀器主要為：Hyper Spec VIS/NIR 高光譜成像系統(tǒng)（美國(guó)Headwall Photonics 公司），如圖1所示。

2.3 高光譜信息采集

為避免圖像采集時(shí)環(huán)境光的干擾，獲得更加精確的數(shù)據(jù)，高光譜圖像數(shù)據(jù)采集前，預(yù)先根據(jù)光源的照度設(shè)定好高光譜攝像頭曝光時(shí)間以保證圖像清晰，并調(diào)整好輸送裝置的速度以避免圖像空間分辨率失真。采集光譜圖像前需對(duì)高光譜進(jìn)行預(yù)熱[3]和參數(shù)設(shè)定，半小時(shí)后應(yīng)對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)[4]。通過(guò)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了最終光譜掃描的參數(shù)：物距為400 mm，輸送裝置的步距為180 μm/s，成像光譜儀的曝光時(shí)間為35 ms，掃描起始位置90 mm，掃描線實(shí)際長(zhǎng)度為60 mm。

圖像采集前，為減弱成像光譜儀暗電流和室內(nèi)照明對(duì)圖像的影響，應(yīng)在暗室進(jìn)行操作儀器，避免雜散光對(duì)采集樣本的干擾。同時(shí)需對(duì)儀器進(jìn)行黑白校正[5]，如公式（1）所示。

圖1 VIS/NIR 高光譜成像系統(tǒng)

式（1）中：RO是樣本原始的漫反射光譜圖像，W是白板的漫反射圖像（反射率約100%），D是暗圖像（反射率0%），R是校正后的漫反射光譜圖像。

2.4 細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定

2.4.1 測(cè)定方法

參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2-2010[6]，采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)乳中細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行測(cè)定。具體方法如下。

（1）稀釋：取原料乳，充分搖混，使樣品呈均勻狀態(tài)。以十倍稀釋法，將原料乳稀釋成10-1、10-2、l0-3、l0-4、10-5系列。

（2） 接種：從最大稀釋度開始，各取l mL l0-3、10-4、10-5的原料乳稀釋液，分別放入已標(biāo)記好的培養(yǎng)皿內(nèi)。培養(yǎng)基融化，待冷至45 ℃左右時(shí)，在火焰旁倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，細(xì)菌總數(shù)對(duì)應(yīng)PCA培養(yǎng)基，倒完迅速蓋好，放在桌面上輕輕搖轉(zhuǎn)，使稀釋的樣品與培養(yǎng)基均勻混合，待平板冷卻固化后，倒置。

（3）培養(yǎng)：于合適的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)一定的時(shí)間，對(duì)應(yīng)細(xì)菌總數(shù)選擇PCA合成培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48小時(shí)。

（4） 計(jì)數(shù)：所有平板在培養(yǎng)到足夠的時(shí)間后，選擇每皿出現(xiàn)30～300個(gè)菌落的稀釋度為準(zhǔn)，計(jì)算出每毫升牛奶中含細(xì)菌總數(shù)。計(jì)算公式如下。① 若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，N每毫升樣品中總活菌數(shù)=同一稀釋度兩次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10；②若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式（2）計(jì)算：N= ∑ C/(n1+0.1n2)d 。

式（2）中：N——樣品中菌落總數(shù)；∑C——（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）；n1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)），n2——第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))，d——稀釋因子（第一稀釋度）。

2.4.2 平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）

胰蛋白胨5.0 g/L，酵母浸粉2.5 g/L，葡萄糖瓊脂1.0 g/L，瓊脂15.0 g/L,加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，調(diào)pH值7.0，分裝三角瓶，121 ℃高壓滅菌15分鐘，備用。取適宜稀釋得樣品液1 mL，加入無(wú)菌平皿中心，傾入冷至44～46 ℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂，混勻，待瓊脂凝固后，放置36 ℃培養(yǎng)48小時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)菌落。

2.5 圖像處理

利用高光譜成像系統(tǒng)采集樣品圖像后，使用ENVI4.6（ Research System Inc，USA）軟件選取感興趣區(qū)域（Region of Interest，ROI），計(jì)算出的平均光譜值作為反射光譜。

2.5.1 模型建立

樣本在采集光譜時(shí)，由于儀器噪音、暗電流等因素的影響，導(dǎo)致光譜曲線產(chǎn)生不重復(fù)和基線漂移等現(xiàn)象[7-8]，本文采用 MSC[9]、SG[10]、OSC[11]三種預(yù)處理方法對(duì)原始光譜進(jìn)行處理，多元散射校正（MSC）去除高光譜漫反射光譜中樣品的鏡面反射及不均勻性造成的噪聲，消除漫反射光譜的基線漂移及光譜不重復(fù)性，在光譜與濃度線性關(guān)系較好和組分性質(zhì)相似的情況下，MSC校正的效果較好；卷積平滑（SG）盡可能減小平滑對(duì)有用信息的影響；SG+MSC兩種預(yù)處理方法相結(jié)合，可以更好地減少干擾，因此，獲得更多有用信息。光譜預(yù)處理后采用偏最小二乘回歸（PLSR）法建立模型。其PLSR方法是一種全新的回歸模型方法，在模型預(yù)測(cè)研究中應(yīng)用較為廣泛。PLSR方法結(jié)合了多元線性回歸（MLR）與主成分分析（PCR）兩種方法的優(yōu)勢(shì)。在光譜矩陣中，對(duì)自變量X相互正交方向上最大方差主成分提取，同時(shí)對(duì)應(yīng)變量實(shí)測(cè)值剪切力Y中光譜矩陣進(jìn)行冗余信息降維處理，并將Y光譜矩陣引入X矩陣中進(jìn)行快速分解，同時(shí)計(jì)算每一個(gè)新的主成分?jǐn)?shù)前，將X得分與Y得分進(jìn)行交換，使得X主成分?jǐn)?shù)與剪切力Y最大程度的直接相關(guān)聯(lián)，其作用是消除變量多重共線性，也充分利用了光譜數(shù)值、吸收值與剪切力之間的線性關(guān)系，使得模型預(yù)測(cè)能力最大程度提高。

2.5.2 模型評(píng)判

采用PLSR建立乳中細(xì)菌總數(shù)預(yù)測(cè)模型。通過(guò)校正集相關(guān)系數(shù)（Rc）與校正集均方根誤差（rootmean-square error of calibration set，RMSEC）、預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)（Rp）與預(yù)測(cè)集均方根誤差（rootmean-square error of prediction set,RMSEP）以及交互驗(yàn)證均方根誤差（RMSECV）指標(biāo)進(jìn)行模型的性能評(píng)價(jià)。Rc、Rp值越高，其模型相關(guān)性越好；RMSEC、RMSECV、RMSEP值 越低，其模型預(yù)測(cè)能力越好。因此，利用PLSR方法所建立效果較好的模型應(yīng)具有較高的Rc、Rcv、Rp與較低的RMSEC、RMSECV、RMSEP 值[12]。除此之外，也可以利用Rc+Rp說(shuō)明模型總體的乳中細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)精度[13]。

2.6 數(shù)據(jù)分析

The Unscrambler X 10.4軟件對(duì)光譜預(yù)處理，圖像分析軟件為ENVI 4.6，Matlab R2014a軟件進(jìn)行建模、劃分樣本集，繪圖軟件為origin 8。

3 結(jié)果與分析

3.1 篩選最佳預(yù)處理方法

本文中采用Galvao等[14]提出的 SPXY（sample set partitioning based on joint x-y distances）法，將剔除異常值的原料乳樣本按3∶1劃分為校正集樣本和驗(yàn)證集樣本。

表1為原始光譜以及預(yù)處理光譜的PLSR建模結(jié)果，由相關(guān)系數(shù)、均方根誤差評(píng)價(jià)模型穩(wěn)定性，圖2為原始光譜圖?？梢钥闯鍪褂肙SC預(yù)處理方法，建模效果降低，因此，經(jīng)過(guò)預(yù)處理的光譜建模效果不一定高于原始光譜模型效果；使用其他幾種預(yù)處理方法，模型相關(guān)系數(shù)均高于原始光譜，均方根誤差低于原始光譜，說(shuō)明這幾種預(yù)處理方法可以消除噪音干擾，提高建模效果；經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)和圖像對(duì)比分析，確定SG為最佳預(yù)處理方法。

3.2 光譜數(shù)據(jù)降維

3.2.1 SPA算法選取特征波長(zhǎng)

SPA[15]算法可以在很大程度上精簡(jiǎn)模型，應(yīng)用SPA選取特征波長(zhǎng)時(shí)，設(shè)置變量范圍為5-25，歸一化處理后得到前五個(gè)波長(zhǎng)變量下的RMSECV值，分別為 413、469、525、671、703 nm，特征波長(zhǎng)占總波長(zhǎng)的4%。

3.3.2 UVE提取特征變量

使用UVE[16]提取原料乳光譜特征波長(zhǎng)，運(yùn)行程序得到輸入變量的穩(wěn)定性結(jié)果，如圖4所示。

圖4豎線左右兩側(cè)各為125個(gè)變量（左邊為波長(zhǎng)變量，右邊為隨機(jī)變量）。用此方法共選取了13個(gè)特征波長(zhǎng)，分別為 416、479、501、503、517、598、634、658、667、692、711、852、981 nm，特征波長(zhǎng)占總波長(zhǎng)的10.4%。

表1 不同預(yù)處理方法的PLSR模型

圖2 原始光譜圖

圖3 SPA提取的特征波長(zhǎng)數(shù)

圖4 UVE-PLSR穩(wěn)定性分布曲線

表2 不同波長(zhǎng)提取方法建立的PLS模型的結(jié)果

3.4 建立模型

對(duì)全波段和特征波段分別建立PLSR模型，見表2。整體來(lái)看，使用SPA算法提取特征變量數(shù)后的建模效果稍高于全波段模型，而UVE建模效果不如全波段建模效果；對(duì)比分析3種模型，建模效果最優(yōu)的是SPA+PLAR，Rc、Rp分別為0.91 95、0.821 4。

4 結(jié)論

本文以原料乳為研究對(duì)象，采集原料乳400～1 000 nm的光譜圖像，提取反射光譜，同時(shí)采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)乳中細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行測(cè)定，對(duì)光譜值和化學(xué)值建立PLSR模型，高光譜成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)原料乳中細(xì)菌總數(shù)預(yù)測(cè)。主要結(jié)論如下。

（1）對(duì)原始光譜采用3種方法進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)對(duì)比分析數(shù)據(jù)和圖像信息，確定SG為最佳預(yù)處理方法，該預(yù)處理方法降低了噪音，去掉了無(wú)用信息，提高了建模效果，結(jié)果：Rc、Rp為0.9190、0.8109。

（2）基于最優(yōu)預(yù)處理方法，使用了2種數(shù)據(jù)降維方法，提取特征波長(zhǎng)數(shù)分別為5、13，占到全波段的4%、10.4%。

（3）對(duì)以上2種降維處理數(shù)據(jù)分別建立PLSR模型，SPA+PLAR為最優(yōu)模型，Rc、Rp分別為0.919 5、0.821 4，提取特征波長(zhǎng)可減少冗長(zhǎng)數(shù)據(jù)，降低維數(shù)，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。