針藥結合對糖尿病胃輕癱大鼠胃竇RhoA/ROCK/MLC信號通路的影響?

崔晶晶， 付 曉

(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis, DGP)是糖尿病患者常見的慢性胃腸道并發(fā)癥，是指在排除機械性梗阻情況下出現(xiàn)的胃排空延遲及胃腸動力障礙，不僅妨礙降糖藥物的吸收，還會增加糖尿病并發(fā)癥風險，部分患者會產(chǎn)生抑郁等心理問題，影響患者對糖尿病的自我管理[1]。目前，DGP的發(fā)病機制尚未明確。相關研究顯示，胃平滑肌細胞病變是DGP產(chǎn)生的關鍵環(huán)節(jié)[2]，Ras同源物基因組成員A/Rho蛋白相關卷曲螺旋激酶(ras homologous genome members A/Rho protein-related curl spiral kinase-2，RhoA/ROCK)信號通路及其下游效應分子可調(diào)節(jié)平滑肌收縮，在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3]。西醫(yī)治療DGP主要以促胃腸動力藥為主，療效不理想，不良反應大且易復發(fā)，中醫(yī)療法不僅能改善DGP癥狀，而且能在一定程度上改善血糖水平[4]。本實驗擬通過觀察針藥結合對DGP大鼠胃腸動力及RhoA/ROCK/MLC信號通路的影響，探討該治法的療效及可能的作用機制，以期為臨床治療DGP提供新方法及理論依據(jù)。本研究已通過錦州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審查。

1 材料與方法

1.1 藥物及制備

益氣健脾中藥復方組成：太子參、雞內(nèi)金、木香各15 g，茯苓25 g，白術、炙甘草、砂仁各10 g，焦麥芽、焦山楂、焦神曲各30 g。將免煎配方顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司)用去離子水配制成0.5 g/mL備用。多潘立酮片(嗎丁啉)產(chǎn)自西安楊森制藥有限公司(國藥準字 H10910003)，用去離子水配置成0.315 mg/mL備用。

1.2 動物

SPF級健康雄性SD大鼠66只，6～7周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京) 2014-0004。飼養(yǎng)于錦州醫(yī)科大學生理實驗室動物房，溫度24 ℃，濕度40%～50%。

1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(Sigma公司)貨號S0130；磷酸化肌球蛋白輕鏈(phosphorylated myosin light chain ，p-MLC)抗體(貨號#3671)、磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亞單位1(phosphorylated myosin phosphatase target subunit 1，p-MYPT1)抗體(貨號#5163)，Cell Signaling Technology公司；Ras同源物基因組成員A(ras homologous genome members A，RhoA)抗體(貨號WL02853)、Rho蛋白相關卷曲螺旋激酶2(Rho protein-related curl spiral kinase-2，ROCK2)抗體(貨號WL00550)、β-actin抗體(貨號WL01845，萬類生物科技有限公司)；580型魚躍血糖儀及血糖試紙(江蘇魚躍醫(yī)療設備公司)。

針灸針(規(guī)格0.35 mm×13 mm，華佗牌)；BX53型顯微鏡(OLUMPUS公司)；DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)移槽、WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)，北京六一公司；ELX-800型酶標儀(BIOTEK公司)；RM2235型石蠟切片機(Leica公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模及分組 大鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機選取13只作為空白組，其余53只作為造模組。造模組大鼠禁食12 h，一次性尾靜脈注射現(xiàn)配的STZ檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH 4.0，4 ℃)55 mg/kg，空白組大鼠注射等量檸檬酸緩沖液，72 h后大鼠尾尖采血測血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L則糖尿病造模成功[5]。經(jīng)檢測53只大鼠均成模,成模大鼠給予高糖高脂飼料(普通飼料、蔗糖、熟豬油、奶粉之比為55∶25∶15∶5)不規(guī)則喂養(yǎng)(單日上午，雙日下午進食)8周，空白組大鼠給予普通飼料規(guī)則喂養(yǎng)8周。8周后隨機選取空白組和造模組大鼠各3只，取材對相關指標進行檢測，檢驗DGP建模是否成功。DGP模型成功標準[6]：①空腹血糖水平≥16.7 mmol/L；②造模組與空白組比較大鼠一般狀況有明顯差別；③胃排空率、小腸推進率比空白組降低顯著。經(jīng)檢測DGP造模成功，將成模DGP大鼠隨機分為模型組、針刺組、中藥組、針藥組和西藥組每組10只，均給予普通飼料喂養(yǎng)。

1.4.2 處理方法 針刺組取“足三里”“三陰交”兩穴，參照《實驗針灸學》[7]確定位置，大鼠“足三里”位于后肢膝關節(jié)外側下方當腓骨小頭下約5 mm，“三陰交”位于后肢內(nèi)踝尖直上10 mm。穴位處常規(guī)消毒，毫針直刺3 mm，留針30 min，每10 min行針1次，采用提插捻轉(zhuǎn)手法，60～90次/min，兩側穴位交替使用；中藥組按照大鼠和人體表面積換算法，每日給予益氣健脾中藥復方5 g/kg灌胃1次；針藥組先給予中藥復方5 g/kg灌胃再行針刺(操作同針刺組)；西藥組每日給予多潘立酮3.15×10-3g/kg灌胃1次；空白組、模型組、中藥組、西藥組均在其他組針刺的同時進行抓取固定30 min，空白組、針刺組、模型組均每日給予0.9%氯化鈉溶液10 mL/kg灌胃1次，各組共治療4周。

1.4.3 標本采集 藥物干預4周結束后，記錄大鼠體質(zhì)量及空腹血糖，然后大鼠禁食24 h，禁水2 h，5 mg/L酚紅溶液2 mL灌胃，20 min后用20%烏拉坦按5 mL/kg腹腔注射麻醉處死大鼠。剖開腹部，結扎賁門和幽門，取出全胃置于冰上，沿胃大彎剪開胃體，取出胃內(nèi)容物用以測胃排空率，在胃竇部沿矢狀線取5 mm×5 mm大的胃組織多塊，分裝存于-80 ℃冰箱和4%多聚甲醛中用以做Western blot和免疫組化；游離小腸于幽門和回盲部剪斷，平鋪在冰上用以測小腸推進率。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 記錄大鼠體質(zhì)量、血糖及一般情況 每天觀察各組大鼠精神狀態(tài)、反應狀況、活動量、進食量、毛色及大小便等變化情況，治療結束后測體質(zhì)量及空腹血糖。

1.5.2 胃排空率和小腸推進率檢測 參照文獻中的方法進行檢測[8]，用蒸餾水充分沖洗胃內(nèi)容物，定容為20 mL，加入0.5 mol/L氫氧化鈉20 mL，攪拌均勻靜置1 h，取5 mL上清液加入20%三氯乙酸溶液0.5 mL去蛋白，3600 r/min離心10 min，取上清液，酶標儀560 nm波長下測定吸光度(OD)值。該OD值為實測酚紅OD值：取試管按順序加入5 mg/L酚紅溶液2 mL，雙蒸水18 ml，0.5 mol/L氫氧化鈉20 mL，20%三氯乙酸溶液4 ml，混合均勻在560 nm波長下測定標準酚紅OD值。胃排空率=(1-實測酚紅OD值/標準酚紅OD值)×100%。取出小腸鋪直于冰上，測量幽門至酚紅所到距離及幽門至回盲部全長：小腸推進率=(酚紅在小腸中移行距離/小腸全長)×100%。

1.5.3 免疫組化法測定胃竇組織中RhoA、ROCK2含量 取4%多聚甲醛固定的大鼠胃竇組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋制備蠟塊，切成5 μm的切片。按步驟脫蠟至水、抗原修復、3%過氧化氫孵育、山羊血清封閉，一抗(RhoA抗體、ROCK2抗體用PBS按1∶200稀釋)4 ℃孵育過夜，二抗(HRP標記山羊抗兔IgG1∶500)37 ℃孵育60 min，DAB顯色、復染、脫水、透明、封片，顯微鏡下采集圖像，棕黃色及褐色顆粒狀或片狀物為陽性反應產(chǎn)物，采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算圖像的OD值。

1.5.4 Western blot法測定胃竇組織中p-MYPT1、p-MLC蛋白表達 取-80 ℃凍存的大鼠胃竇組織100 g，按全蛋白提取試劑盒進行蛋白質(zhì)提取、BCA蛋白濃度測定、蛋白定量、SDS-PAGE凝膠電泳(80V，2.5 h)、PVDF膜轉(zhuǎn)印(80V，1.5 h)、5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗p-MLC(1∶500)、p-MYPT1(1∶600)、β-actin(1∶1000)4 ℃過夜，常規(guī)洗膜；二抗IgG-HRP(1∶5000)37 ℃孵育1.5 h，ECL發(fā)光顯影。Image J軟件進行灰度值分析，用目的蛋白與內(nèi)參比值作為蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大鼠一般情況

實驗期間空白組大鼠精神狀態(tài)佳、活動靈敏、反應正常，毛色有光澤且整潔，進食及大小便無明顯改變。造模大鼠從第4周開始出現(xiàn)精神倦怠、活動減少、反應遲鈍，毛色暗淡無光且雜亂；至第5周時出現(xiàn)大便質(zhì)稀不成型，食量逐漸減少，腹部脹滿。經(jīng)過4周治療后，各治療組大鼠精神狀態(tài)有所恢復，大便稀溏有所緩解，食量呈漸增趨勢；模型組大鼠以上癥狀無緩解。

2.2 治療后各組大鼠血糖、體質(zhì)量比較

表1示，與空白組比較，模型組大鼠血糖顯著升高，體質(zhì)量顯著減輕(P<0.01)；與模型組比較，各治療組血糖顯著降低，體質(zhì)量顯著增加(P<0.05或P<0.01)；與針藥組比較，針刺組、中藥組及西藥組血糖顯著升高，體質(zhì)量顯著降低(P<0.05或P<0.01)；針刺組與中藥組、西藥組比較體質(zhì)量變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 治療后各組大鼠胃排空率及小腸推進率比較

表1示，與空白組比較，模型組胃排空率及小腸推進率顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，各治療組胃排空率及小腸推進率均顯著升高(P<0.01)；與針藥組比較，針刺組、中藥組、西藥組的胃排空率及小腸推進率均降低(P<0.05或P<0.01)，其中針刺組與中藥組、西藥組之間小腸推進率變化比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠治療結束后血糖、體質(zhì)量、胃排空率及小腸推進率比較

2.4 治療后各組大鼠胃竇組織中RhoA、ROCK2蛋白陽性表達比較

圖1～3示，空白組大鼠胃竇組織中棕褐色顆粒分布范圍廣且著色深，RhoA、ROCK2蛋白表達量多。與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織中棕褐色顆粒分布范圍少且著色較淡，RhoA、ROCK2蛋白表達明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，各治療組RhoA、ROCK2蛋白表達明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與針藥組比較，針刺組、中藥組、西藥組大鼠胃竇組織中RhoA、ROCK2蛋白表達降低(P<0.05或P<0.01)。

注：A.空白組；B.模型組；C.針刺組；D.中藥組；E.針藥組；F.西藥組

注：A.空白組；B.模型組；C.針刺組；D.中藥組；E.針藥組；F.西藥組

注：A.空白組；B.模型組；C.針刺組；D.中藥組；E.針藥組；F.西藥組。與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；與針藥組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.5 治療后各組大鼠胃竇組織中p-MYPT1、p-MLC蛋白表達水平比較

圖4示，與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織中p-MYPT1、p-MLC蛋白相對表達量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，各治療組大鼠胃竇組織中p-MYPT1、p-MLC蛋白表達明顯升高(P<0.01)，其中針藥組優(yōu)于針刺組、中藥組和西藥組(P<0.05或P<0.01)；針刺組與中藥組之間p-MYPT1蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注：A.空白組；B.模型組；C.針刺組；D.中藥組；E.針藥組；F.西藥組。與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；與針藥組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

DGP屬于中醫(yī)學“痞滿、胃痞、反胃、胃緩”等范疇[9]。益氣健脾中藥復方是由香砂六君子湯加減化裁而來，考慮到糖尿病多為陰虛燥熱所致，所以用性略偏寒的太子參易人參，與白術、茯苓、砂仁、木香、炙甘草共奏益氣健脾、燥濕行滯、養(yǎng)陰和胃之功。方中去半夏、陳皮以防其辛燥太過傷及胃陰，加焦三仙、雞內(nèi)金以助其消食化滯、健脾和胃之職。因DGP病位主要在脾胃，按臟腑經(jīng)脈的陰陽表里配伍關系，本研究選用表里經(jīng)配穴法，取胃經(jīng)“足三里”及脾經(jīng)“三陰交”穴。《靈樞·邪氣臟腑病形第四》中記載:“胃病者，腹月真脹……食飲不下，取之三里也?！弊闳餅槲覆∈走x穴，可補中益氣、消積除滿、調(diào)理脾胃。三陰交穴具有健脾祛濕之功，主治腹脹、腹瀉等脾胃虛弱諸證，又為足三陰經(jīng)交會穴，可運化水液、益氣養(yǎng)血，主陰虛諸證，兩穴配伍共奏健脾和胃、益氣養(yǎng)陰、化濕行滯之功。

現(xiàn)代醫(yī)學對于DGP的發(fā)病機制尚不十分清楚。近年來研究顯示，胃平滑肌病變在此病中占據(jù)核心地位，平滑肌細胞是負責產(chǎn)生胃腸道運動的最終效應器，胃排空功能主要受平滑肌收縮能力的影響。MLC(肌球蛋白輕鏈)磷酸化水平的高低決定著平滑肌細胞的收縮功能[10]。MLC的磷酸化受MLCK(肌球蛋白輕鏈激酶)和MLCP(肌球蛋白輕鏈磷酸酶)的影響，主要由鈣敏化和鈣依賴兩條途徑調(diào)節(jié)，其中鈣敏化機制由RhoA/ROCK介導。

RhoA是Ras超家族中單體小分子G蛋白之一，RhoA活化后可以激活多種效應器，其在平滑肌組織中主要參與調(diào)控平滑肌細胞的收縮、運動和分裂等[11]。ROCK是絲/蘇氨酸蛋白激酶家族的主要成員，目前被認為是RhoA重要的下游靶目標之一，ROCK包括ROCK1和ROCK2兩種亞型,其中ROCK1主要在應力纖維的形成中起重要作用，ROCK2主要在細胞收縮中起重要作用[12]。在胃平滑肌組織中，被RhoA激活的ROCK2與MLCP的亞基MYPT1結合，對MYPT1的特定位點進行修飾，使其發(fā)生磷酸化，p-MYPT1的形成導致MLCP活性被抑制，使MLCP對已經(jīng)磷酸化的MLC去磷酸化能力減弱，間接導致p-MLC的水平增高，進而促進胃平滑肌的收縮，加快胃排空，改善胃動力。

本研究結果顯示，針藥結合治療能夠顯著增強胃平滑肌組織中RhoA、ROCK2、p-MYPT1、p-MLC的表達，改善DGP大鼠的一般狀況，提高胃排空率及小腸推進率，促進胃腸動力，其機制可能與上調(diào)RhoA/ROCK/MLC信號通路的表達、促進胃平滑肌收縮有關。