小龍蝦病毒病害研究進(jìn)展

趙楠，武秀麗，趙桂華,3

（1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400；2.句容市人民醫(yī)院，江蘇 句容 212400；3.句容市潤泰生物科技有限公司，江蘇 句容 212400）

小龍蝦養(yǎng)殖已成為我國多地經(jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)，然而，由于盲目的高密度放養(yǎng)，養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境不斷惡化的原因，使得小龍蝦病毒病害迅速蔓延，病死率高，給養(yǎng)殖者造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。多年以來，許多人一直把小龍蝦病毒病直接、單純的定義為小龍蝦白斑綜合征，實際上并非如此。引起小龍蝦病害的病毒種類較多，有的病毒已在多種宿主上產(chǎn)生?；浴Ｒ饎又参锊『Φ牟《?，以蛋白質(zhì)復(fù)制進(jìn)行繁殖，都是專性寄生物，只能生活在宿主活的細(xì)胞內(nèi)，屬于系統(tǒng)性侵染病害，具有潛伏侵染現(xiàn)象。

1 病毒分類

根據(jù)病毒的結(jié)構(gòu)，已將感染蝦類的病毒分為8類[1]。近十多年來，研究較多的有桿狀病毒科（Baculoviridae）、細(xì)小病毒科（Parvoviridae）、呼腸孤病毒科（Reoviridae）、虹彩病毒科（Iridoviridae）、小 RNA病毒科（Picornaviridae）、彈狀病毒科（Rhabdoviridae）、被膜病毒科（Togaviridae）的 15 種對蝦病毒[2]；而引起螯蝦科（Cambaridae）的病毒有7科11種，包括雙鏈DNA病毒（線頭病毒科、桿狀病毒科），單鏈DNA病毒（細(xì)小病毒科），雙鏈RNA病毒（呼腸病毒科、全病毒科）及雙 RNA 病毒科（Birnaviridae）等[3]，其中，白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus,WSSV）分布廣、危害大，幾乎遍布所有的小龍蝦棲息地。隨著分子生物技術(shù)的應(yīng)用，病毒分類學(xué)還處于不斷發(fā)展階段，一些較高級的分類方法仍在研究中[4]。不同病毒科的成員對宿主的危害程度和導(dǎo)致的小龍蝦病死率均有差異，簡介如下。

2 各科病毒與引起的蝦類病害

2.1 線頭病毒科（Nimaviridae）

白斑綜合征病毒（WSSV）原被劃為桿形病毒，因為其獨特的遺傳學(xué)特點和形態(tài)特征，2002年，在巴黎召開的國際病毒分類委員會（ICTV）第7次報告把WSSV命名為一個新的病毒科，即線形病毒科（Nimaviridae），白斑病毒屬（Whispovirus），目前白斑綜合征病毒是該屬的唯一成員[5]。

該病毒主要感染甲殼動物（含小龍蝦），自20世紀(jì)90年開始，在亞洲的對蝦養(yǎng)殖地區(qū)不斷暴發(fā)流行。WSSV已從亞洲擴(kuò)展到美國、墨西哥、厄瓜多爾等美洲對蝦養(yǎng)殖國家，給全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。國際獸疫局（OIE）、聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）以及亞太地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展網(wǎng)絡(luò)中心（NACA）早在1995年就將其列為需要報告的重要的水生動物病毒性疫病之一，白斑?。╓SD）已列入歐盟立法中，嚴(yán)控病害傳播[6]。

WSSV感染小龍蝦的明顯癥狀是大蝦活動無力，先出現(xiàn)死亡，逐漸擴(kuò)展到中等蝦和幼蝦，在甲殼上出現(xiàn)白斑沉淀。病毒粒子直徑約65～70 nm，長約300 nm，橢圓形到桿狀，具有雙層囊膜，一端帶一條細(xì)長的由囊膜延伸而來的尾。WSSV不形成包涵體，為雙鏈DNA病毒。該病毒存在于小龍蝦鰓、心肌、神經(jīng)、肝臟、腸道、肌肉等多處組織中。WSSV的宿主范圍有近40種，危害蝦蟹[6-7]。

雖然小龍蝦和其他的無脊椎動物沒有真正的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，歐洲本土小龍蝦對該病毒有一定的抗性，試圖通過養(yǎng)殖來降低對WSSV病毒囊膜蛋白或二乙烯亞胺的作用。WSSV膜蛋白VP28和VP19在一些表達(dá)介體或從肌肉注射到小龍蝦中，感染組表現(xiàn)出WSSV總體病死率低，使用二乙烯亞胺對WSSV進(jìn)行滅活，當(dāng)小龍蝦暴露在WSSV中時也能降低病死率[8-9]。

在我國，WSSV危害小龍蝦的最早報道是2006年5月29日在浙江舟山市一家小龍蝦養(yǎng)殖場的小龍蝦全部發(fā)病死亡。2007年5月，江蘇省首次發(fā)現(xiàn)WSSV在養(yǎng)殖小龍蝦中感染流行，并造成小龍蝦的批量死亡[10]，全省發(fā)病面積近 6 000× 667 m2，發(fā)病塘口病死率在5%～20%；至2008年底，全省發(fā)病面積已達(dá)8萬×667 m2[11]；2017年5月，在江蘇省句容市部分養(yǎng)殖戶的小龍蝦病死率高達(dá)80%～100%，從發(fā)病到全部死亡只需3周時間（5月5日—5月25日）。2008年5月，安徽省某些養(yǎng)殖場出現(xiàn)大批量小龍蝦死亡，病死率高峰期達(dá)到39%，2010年1 400×667 m2蝦塘全部發(fā)病，致使養(yǎng)殖戶蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失[12]。

2.2 桿狀病毒科（Baculoviridae）

2.2.1 細(xì)胞核內(nèi)桿狀病毒（Intranuclear bacilliform viruses，IBVs） 細(xì)胞核內(nèi)桿狀病毒（IBVs）是一組非閉塞的雙鏈DNA病毒，在這些病毒上，由于缺乏分子、免疫和生化數(shù)據(jù)，目前的分類地位未知。侵染小龍蝦的肝胰腺和腸道[13]。

2.2.2 高貴小龍蝦桿狀的病毒（Astacusastacus bacilliform virus，AaBV） 到目前為止，該病毒只在芬蘭的高貴小龍蝦上報道過，感染率達(dá)100%，但病死率低[14]。侵染肝胰腺，所有被感染的細(xì)胞腫大，具有微凹染色質(zhì)。在一般情況下，被侵染細(xì)胞核的核染質(zhì)被區(qū)域化。病毒粒子有1個被三角薄片封閉的核蛋白殼。病毒粒子70 nm×340 nm，核衣殼50 nm×260 nm[3]。

2.2.3 白爪小龍蝦桿狀的病毒（Austropotamobius pallipes bacilliformvirus，ApBV） 在法國，Edgerton[15]報道了該病毒引起白爪小龍蝦的死亡事件，但是，無明顯的臨床癥狀。Edgerton[16]也證明該病毒存在于白爪小龍蝦群體中，但病毒密度相對較低，不像是白爪小龍蝦死亡的主要病原。最近在英國和威爾士的一些群體中也發(fā)現(xiàn)該病毒的存在，但影響有限。侵染干細(xì)胞和中腸細(xì)胞造成過度生長。病毒粒子由核蛋白殼和電子致密的衣殼組成，大小為60 nm×260 nm，核衣殼 50 nm×220 nm[3]。

2.2.4 澳大利亞螯蝦桿狀病毒（Cherax destructor bacilliform virus，CdBV） 在澳大利亞，螯蝦桿狀的病毒和澳洲淡水龍蝦桿狀病毒（C.quadricarinatus bacilliform virus，CqBV）最初報道來自小龍蝦[17]，發(fā)病率為21%[18]，后來陸續(xù)發(fā)生在澳大利亞、美國、智利和厄瓜多爾的其他澳洲淡水龍蝦養(yǎng)殖場[18-21]。通過從澳大利亞進(jìn)口小龍蝦把侵染源進(jìn)入美國猶他州[20]，Hauck[22]測定了病毒的傳播途徑，攜帶病毒的小龍蝦已從猶他州傳播到美國的其他州及另外一些國家和地區(qū)，包括百慕大、海地、牙買加、維爾京群島、哥倫比亞、印度和沙特阿拉伯。相互矛盾的信息影響病毒的存在，隨后，Romero和 Jiménez[21]建議，CqBV侵染與死亡或病害無關(guān)；但是，CqBV會導(dǎo)致小龍蝦發(fā)育不良和低病死率[20,23]。不同發(fā)育階段的小龍蝦均易感染病毒[19]，但沒有明顯的外部癥狀，嚴(yán)重感染者體弱[18]。在光學(xué)顯微鏡下可看到侵染細(xì)胞過度生長，具有微凹染色質(zhì)和核仁，在一些情況下，細(xì)胞核內(nèi)的分隔作為核分區(qū)[18,20]。病毒粒子由三層包膜包裹的桿狀核衣殼組成，分布在整個被感染細(xì)胞核內(nèi)[18]。由于宿主或病毒株系或測量方法的不同，造成不同研究者測量病毒粒子和核蛋白質(zhì)衣殼的大小差異；病毒粒子大小分別為70 nm×（200~220）nm，100 nm×260 nm[18]和 100×290 nm[20]。同樣，核蛋白衣殼大分別為 30 nm×150 nm[17]到 40 nm×180 nm[22]，再到 50 nm×215 nm[20]。

2.2.5 信號小龍蝦桿狀病毒（Pacifastacus leniusculus bacilliform virus,PlBV） 該病毒侵染小管肝胰腺的細(xì)胞核，被侵染的所有細(xì)胞都是過度生長，腐爛成小管腔。病毒粒子桿狀，70 nm×240 nm，核衣殼190 nm×40 nm，但是，該病毒還有待正確描述[3]。

2.3 雙鏈RNA病毒科（Birnaviridae）

雙鏈RNA病毒是魚類的重要病原，鮭魚死亡與感染性胰腺壞死病毒（IPNV）有關(guān)。Halder和Ahne[18]認(rèn)為高貴小龍蝦傳播IPNV病毒有不同的途徑，它們可以把病毒傳播到本地蝴蝶（na?ve rainbow trout fry）和卵上。IPNV在小龍蝦肝胰腺的血細(xì)胞檢測到，但在小龍蝦上無明顯癥狀，可在小龍蝦中存在數(shù)年。在病毒傳播給魚的過程中，小龍蝦起著重要作用。核分區(qū)與其他的IBVs病毒相同，病毒粒子由一個核衣殼核蛋白質(zhì)核心和較低的電子致密衣殼組成。病毒粒子大小60 nm×260 nm，核衣殼50 nm×220 nm[3]。

2.4 細(xì)小病毒科（Parvoviridae）

澳洲淡水龍蝦胰腺細(xì)小病毒（C.quadricarinatus parvo-like virus,CqPlV），屬于細(xì)小病毒是單鏈DNA病毒。在澳大利亞的澳洲淡水龍蝦養(yǎng)殖場里，報道了胰腺細(xì)小病毒和感染。它侵染鰓的細(xì)胞核，顯示出典型的微凹染色質(zhì)和外圍核仁。在被感染的細(xì)胞核中，觀察到超微結(jié)構(gòu)的二十面體病毒顆粒，直徑為20 nm。病死率和發(fā)病率與該病毒的侵染有關(guān)。目前缺乏對這種病毒的分子描述詳細(xì)資料[24]。

2.5 小DNA病毒科（Parvoviridae）

在澳大利亞昆士蘭北部的農(nóng)場里能導(dǎo)致大規(guī)模死亡例證，被侵染的小龍蝦和澳洲淡水龍蝦（C.quadricarinatus）表現(xiàn)出垂死、軟殼、厭食和體弱癥狀，鰓細(xì)胞核內(nèi)有包涵體與微凹染色質(zhì)。對造血組織、上皮細(xì)胞和卵巢間質(zhì)組織影響較小。檢測證明，不侵染肝胰腺細(xì)胞（hepatopancreatocytes）和神經(jīng)元或心臟組織；超微結(jié)構(gòu)觀察，病毒顆粒六邊形，平均直徑19.5 nm。同時也證明該病與細(xì)小病毒的大小和侵染位置非常相似，它門在相同寄主和相同地理區(qū)域被發(fā)現(xiàn)[24]。但是，認(rèn)為它們是不同的病毒，因為沒有發(fā)現(xiàn)小DNA病毒引起鰓壞死癥狀。分子數(shù)據(jù)需要確定這種病毒和細(xì)小病毒的關(guān)系[24]。

澳大利亞螯蝦胰腺細(xì)小病毒（Cherax destructor systemic parvo-like virus,CdSPV）在澳大利亞南部的農(nóng)場里發(fā)現(xiàn)，感染澳大利亞螯蝦鰓組織、肝胰腺、中腸、心外膜、腹部肌肉和結(jié)締組織。細(xì)胞核內(nèi)的考德里（cowdry）包涵體存在于所有被侵染組織中，包涵體與核有微凹染色質(zhì)有關(guān)。病毒顆粒是二十面體，大小為 21 nm[25]。

2.6 呼腸病毒科（Reoviridae）

屬于雙鏈RNA病毒，是侵染澳洲淡水龍蝦（Cherax quadricarinatus）的呼腸孤樣病毒（reolike）。在澳大利亞昆士蘭北部，Edgerton[24]報道被侵染澳洲淡水龍蝦肝胰腺上的嗜酸性胞質(zhì)包涵體，細(xì)胞核有大小一致的無包膜六角和五角形狀的病毒粒子，大小為35～40 nm。

2.7 全病毒科（Totiviridae）

屬于雙鏈RNA病毒。賈第蟲狀病毒（Giardialike，CGV）的最早報道是在澳洲淡水龍蝦肝胰腺上，影響宿主細(xì)胞輕度肥厚性[26]。幼小的小龍蝦感染更突出，但導(dǎo)致的病死率相對較低[27]。無包膜病毒粒子直徑25 nm，六角或五角，一個二十面體形狀。相繼出現(xiàn)在昆士蘭，但引起澳洲淡水龍蝦的病死率低[28]。Poulos et al.[29]認(rèn)為，因為沒有病毒特征描述，暫無明確分類位置。

雖然在小龍蝦上報道了多種病毒，但有些病毒描述不完整，或未進(jìn)行種的鑒定，因此，迫切需要充分利用臨床癥狀，組織學(xué)，超微結(jié)構(gòu)和分子工具正確描述、識別和鑒定小龍蝦病毒。