中藥治療腎間質(zhì)纖維化研究進展

劉言振，趙婷婷，李佳霖，林 雨，李 平?

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.中日友好臨床醫(yī)學研究所 免疫炎性疾病北京市重點實驗室，北京 100029）

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是多種病因?qū)е碌穆阅I臟病進展至終末期腎病的共同途徑。抑制RIF 被認為是保護腎臟的有效治療策略。單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）模型是研究慢性腎臟病的一種常見模型，高度契合人類腎臟疾病過程，在相對較短的時間跨度內(nèi)，基本上概括了典型的纖維化形成反應的關鍵特征。并且UUO 模型便于制作，成為眾多學者研究腎間質(zhì)纖維化常選用的動物模型。中藥在防治腎間質(zhì)纖維化方面有著其獨特的優(yōu)勢。因此，本文將介紹近年來在UUO 模型上中藥治療腎間質(zhì)纖維化的研究進展。

1 UUO 引起腎間質(zhì)纖維化的機制

腎間質(zhì)纖維化是細胞外基質(zhì)的過度積聚。在輸尿管梗阻模型中導致腎間質(zhì)纖維化主要是由這樣三個病理過程：炎癥細胞浸潤以及大量細胞因子釋放，成纖維細胞活化和增生，細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生增多和降解減少。另外腎小管萎縮，微血管減少和組織缺氧，也都促進了腎間質(zhì)纖維化的形成。以下將分別討論在UUO 以上的幾個病理過程中起到主要作用的細胞和細胞因子。

1.1 炎細胞浸潤及細胞因子增多

阻塞后靜水壓力增加導致腎小管膨脹，腎血流量顯著減少和腎小球濾過率明顯降低。腎小管上皮細胞（tubular epithelial cells，TEC）以及腎實質(zhì)細胞因機械牽張，局部缺血，或有害因子的刺激損傷后，分泌細胞因子、趨化因子等細胞因子，使炎細胞聚集在腎小管間質(zhì)周圍，聚集的炎癥細胞分泌炎癥介質(zhì)以及致纖維化因子又進一步加重腎臟的損傷。UUO 模型建立的數(shù)小時后粘附因子和趨化因子的分泌增加，并持續(xù)7～10d。

1.1.1 單核巨噬細胞

巨噬細胞浸潤于腎間質(zhì)的主要炎性細胞。在UUO 早期，TEC 表達的巨噬細胞集落刺激因子和單核細胞趨化蛋白-1 促使了單核巨噬細胞浸潤。模型建立的12h 后腎間質(zhì)浸潤的巨噬細胞進行性增加，通過合成和分泌促增殖因子和血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、白細胞介素-1 等細胞因子直接促進固有的成纖維細胞增殖活化，促進細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成增多，腎間質(zhì)單核巨噬細胞的聚集與纖維化程度高度相關。

1.1.2 肥大細胞

正常腎臟幾乎沒有肥大細胞浸潤，在病變的腎臟中肥大細胞的數(shù)量與纖維化程度呈正相關，肥大細胞是嚙齒動物UUO 模型中發(fā)生腎纖維化所必需的。在UUO 腎中發(fā)現(xiàn)成纖維細胞緊鄰肥大細胞，表達血管緊張素ⅡAT1 受體和組胺H1R 亞型。Veerappan 等的研究結(jié)果表明，肥大細胞介質(zhì)如血管緊張素Ⅱ和組胺的釋放介導了一種將肥大細胞脫顆粒與成纖維細胞活化與隨后的纖維化相結(jié)合的機制[1]。靶向肥大細胞及其產(chǎn)物可能成為預防腎纖維化的新型治療靶點。另外，中性粒細胞和T 細胞在梗阻24h后出現(xiàn)增加，一直持續(xù)至第14d。

1.1.3 血管緊張素Ⅱ

血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）在UUO 病變的腎間質(zhì)中濃度高達血漿中的幾十倍。Ang Ⅱ能直接刺激成纖維細胞的激活和轉(zhuǎn)分化形成肌成纖維細胞，并且促進炎癥反應、細胞凋亡、氧化應激加重纖維化[2]。AngⅡ的促生長效應可以通過促進結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表達、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），骨橋蛋白，和核因子-β 等的表達促進纖維化。血管緊張素也可通過影響腎小球血流動力和水電解質(zhì)平衡造成腎損傷?？梢酝ㄟ^受體拮抗劑的使用來減輕。在UUO 模型中使用AT1 受體拮抗劑（如氯沙坦）或AT2 受體拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑均可防止炎癥反應和腎纖維化的形成[3]。

1.1.4 TGF-β1

TGF-β1 是最初從血小板分離的多功能細胞因子，在它的幾種異構(gòu)體中TGF-β1 被認為是UUO 模型中引起腎纖維化的最主要因子，它的上調(diào)與腎纖維化程度成正相關。其主要通過以下幾方面在促進RIF 的過程：（1）刺激纖維細胞以及肌成纖維細胞產(chǎn)生細胞外基質(zhì)，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ各型膠原以及FN、層粘蛋白等。（2）通過降低ECM 降解酶的活性和增加降解酶抑制劑的活性減少ECM 的降解，如改變基質(zhì)金屬蛋白酶、纖溶酶原激活物、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑等的活性。（3）刺激腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，激活成纖維細胞，使生成的ECM 增多。TGF-β1 可以與細胞表面的受體結(jié)合，激活多條細胞信號通路，與腎纖維化關系比較密切的是調(diào)控Smad 信號通路，誘導靶基因的表達[4]。UUO 模型大鼠腎臟中，受體激活型信號介導分子Smad2 和Smad3 表達增高至正常水平的6 倍。受體抑制型信號分子Smad7 的蛋白水平則顯著降低，這些改變在腎間質(zhì)性纖維化的進展中起到了重要作用[5]。因此，通過抑制TGF-β1 的信號轉(zhuǎn)導以預防腎纖維化也是比較有效的手段。

1.2 肌成纖維細胞的數(shù)量增多

肌成纖維細胞數(shù)量與腎纖維化的嚴重程度密切相關。除了間質(zhì)成纖維細胞在多種細胞因子作用下由于過高的細胞反應性而導致過度增殖外，腎小管上皮細胞、周細胞、血管內(nèi)皮細胞等多種細胞均可轉(zhuǎn)分化肌成纖維細胞[6]。

1.2.1 周細胞和成纖維細胞

成纖維細胞是具有分泌功能的間充質(zhì)細胞，存在于身體的各個器官和組織，在正常的腎臟中相對較少。合成的各種蛋白水解酶和抑制劑，使它們能夠調(diào)控ECM 的生成和更新。它們的數(shù)量在腎損傷后增加，并且它們可以被多種細胞因子，生長因子特別是TGF-β1 或ECM 成分激活以分化成肌成纖維細胞。腎間質(zhì)中的成纖維細胞呈現(xiàn)收縮性肌纖維母細胞表型時，大量形成充滿間質(zhì)導致腎單位丟失和腎功能下降的纖維狀膠原豐富的細胞外基質(zhì)。肌成纖維細胞數(shù)量與腎纖維化的嚴重程度密切相關[7]。

周細胞是支持脈管系統(tǒng)的基質(zhì)細胞，在腎臟中，周細胞在血管生成，腎髓質(zhì)和皮質(zhì)血流的調(diào)節(jié)中起關鍵作用，并且在腎纖維發(fā)生中充當間質(zhì)成肌纖維細胞的祖細胞。它們通過不同的信號傳導途徑與內(nèi)皮細胞相互作用，并且在腎損傷后它的激活和從毛細血管分離對于驅(qū)動腎纖維化進展作用關鍵。Lan 等[8]的研究表明，血管損傷或血管因素是周細胞遷移和分化成肌成纖維細胞的最可能觸發(fā)因素。

1.2.2 腎小管上皮細胞

其中不少于1/3 的肌成纖維細胞是由腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化而來。在損傷的腎臟中，腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的過程中，E-鈣粘蛋白的表達減少，粘附和極性的喪失[9]，腎小管上皮細胞中肌成纖維細胞標志物α-SMA 的表達增加，逐漸分化成間質(zhì)中的肌成纖維細胞[10]。在EMT 過程中，上皮細胞呈現(xiàn)間質(zhì)表型，通過降解基底膜和產(chǎn)生細胞外基質(zhì)降解酶破壞上皮層。另外還有許多因素促進腎小管EMT的發(fā)生，包括氧化應激、炎癥、成纖維細胞增殖和激活以及細胞凋亡等[11]。過去十幾年中關于EMT 是否能促進腎間質(zhì)的纖維化一直存在爭議，現(xiàn)在一些新的研究結(jié)果表明EMT也是導致腎間質(zhì)纖維化的重要因素[12，13]。

1.3 腎間質(zhì)纖維化

在大鼠或小鼠完成UUO 手術(shù)后，進展到嚴重腎實質(zhì)腎損傷發(fā)生在1～2 周。在TGF-β1 等多種因子作用下，成纖維細胞活化，纖溶酶原激活物抑制劑等基質(zhì)降解抑制酶激活，ECM 合成增多，基質(zhì)金屬酶和纖溶酶原激活物等基質(zhì)降解酶的活性受抑制，ECM 降解減少。最終細胞外基質(zhì)在腎小球和間質(zhì)區(qū)域中的異常和過度沉積，導致腎間質(zhì)纖維化的不可逆進展，纖維連接蛋白、膠原蛋白等大量表達。此外，腎小管萎縮、毛細血管稀少和組織缺氧也加劇了纖維化的形成[14]。

2 基于UUO 模型的中藥研究進展

近年來基于UUO 模型對于腎間質(zhì)纖維化的研究更加深化了我們對于其機制的認識，但是目前我們?nèi)匀狈Ω行У姆乐文I纖維化的方法。中藥的使用起到了不錯的效果，近年來一些有代表性的單味中藥和有效提取物以及中藥復方在UUO 模型上的研究如下。

2.1 抑制TGF-β1 水平及其下游信號轉(zhuǎn)導

鄭龍等[15]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷能降低單側(cè)輸尿管梗阻后血清和腎組織中的TGF-β1 的水平，并抑制大鼠腎組織中的Smad2/3 磷酸化。體外研究也發(fā)現(xiàn)黃芩苷可以抑制Smad2/3 在相同TGF-β1 濃度下的磷酸化。使用大鼠建立的UUO 腎纖維化模型中，黃芩苷被證明通過抑制TGF-β1產(chǎn)生及其下游信號轉(zhuǎn)導能降低纖連蛋白和膠原I mRNA表達水平，上調(diào)N-和E-鈣粘蛋白表達水平以及下調(diào)α-平滑肌肌動蛋白和波形蛋白的表達，能抑制EMT 并顯著改善腎纖維化。

錢輝軍等[16]的研究證明，傳統(tǒng)的中草藥黃芪處理可減少TGF-β1 誘導的Smad2/3 磷酸化，抑制Smad 信號通路，顯著降低UUO 小鼠腎臟梗阻誘導的α-平滑肌肌動蛋白上調(diào)和E-cadherin 下調(diào)，抑制EMT 的誘導和細胞外基質(zhì)的沉積。在體外試驗中，黃芪共處理也能逆轉(zhuǎn)TGF-β1 刺激的小鼠腎近端腎小管細胞系的α-SMA 高表達。

張娜等[17]研究證實，通心絡及其某些成分在UUO 模型上抑制腎纖維化或EMT 方面具有積極的作用。降低TGF-β1 和α-SMA的表達，抑制UUO引起的腎臟中smad2/3 的激活，恢復smad7 的表達，減少腎組織膠原沉積，減輕UUO 小鼠腎臟纖維化。姜黃素可以通過抑制TGFβ1 的下游介質(zhì)結(jié)締組織生長因子減緩成纖維細胞增殖，使其在細胞周期G1 期停滯，減少了ECM 積累，成為更有希望的治療纖維化藥物[18]。

中藥復方黃芪煎劑能改善UUO 小鼠腎纖維化，不僅能 下 調(diào)TGF-β1、TβRI、TβRII，Smad2/3，P-Smad2/3 的 表達，同時也能通過誘導Smad7 抑制TGF-β/Smad3 介導的腎纖維化[19]。綠茶多酚降低細胞外基質(zhì)積累減輕腎間質(zhì)纖維化，也是通過降低TGF-β1 和磷酸化Smad2 降低的水平實現(xiàn)的[20]。

2.2 抑制炎癥細胞因子

An 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒對UUO 誘導的腎纖維化的治療，是通過降低炎癥細胞浸潤，降低TNF-α 和IL-1β，TGF-β1 以及纖連蛋白的表達，抑制多種炎癥因子的介導，降低炎癥反應實現(xiàn)的。

黎穎等[22]的研究證實，補腎活血排毒法配伍的中藥復方各劑量組均明顯下降血肌酐、尿素氮。減輕腎小管上皮細胞凋亡、壞死、脫落，炎性細胞浸潤等病理損傷。TUNEL法檢測，補腎活血排毒法中藥各劑量組可顯著減少細胞凋亡數(shù)目，明顯上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax 水平，升高iBcl-2／Bax比值，并且以上結(jié)果均呈劑量依賴性。改善了UUO 模型的腎臟損害，減輕了纖維化。

孟力強等[23]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪當歸合劑的腎保護作用從病變早期治療后3d 開始，明顯減輕大鼠的腎間質(zhì)炎性細胞浸潤、腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化，同時可使腎組織中的TGF-β1 分泌減少，治療后7d 開始可減少腎間質(zhì)的α-SMA 表達、下降FN 表達，下降減少腎臟固有細胞轉(zhuǎn)化、分化及細胞外基質(zhì)成分沉積并持續(xù)發(fā)揮作用，特征是通過減輕腎間質(zhì)纖維化從而改善腎功能。

同時也有研究[24]證明了當歸補血湯可顯著減輕間質(zhì)膠原沉積和腎小管間質(zhì)損傷，降低膠原和α-SMA 水平。NLRP3、pro-caspase-1、白細胞介素-1β 的前體，白細胞介素-1β 同步表達降低。與依那普利相比，當歸補血湯顯著減少腎小管間質(zhì)損傷、間質(zhì)膠原沉積以及I 型膠原和白細胞介素-1β 的表達。當歸補血湯在UUO 大鼠中提供的腎保護作用，與抑制NLRP3 炎性體表達和減少細胞因子白細胞介素-1β 的分泌有關。

3 展望

自20 世紀70年代以來，UUO 的動物模型就已經(jīng)用于進行腎纖維化的研究，能模擬腎纖維化主要機制，制作簡單，重復性好?；赨UO 模型，對RIF 的發(fā)病機制又有了一些新的認識，明確了轉(zhuǎn)分化等機制在細胞外基質(zhì)形成中的重要作用。很多中藥及中藥復方及單體能顯著抑制腎間質(zhì)的纖維化，減少細胞外間質(zhì)的累積，且大多通過抑制TGF-β1 和其下游信號轉(zhuǎn)導以及炎癥細胞因子發(fā)揮抗纖維化的作用，更多中藥抗纖維化的作用機制有待進一步探究。腎間質(zhì)纖維化的機制錯綜復雜，是絕大多數(shù)慢性腎臟病的病理基礎，中藥抗纖維化的多靶點作用在腎纖維化的防治上有著很大的潛力。