肺癌腫瘤干細(xì)胞耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

李 彤，董 明，陳 軍 （天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肺部腫瘤外科，天津300052）

0 引言

肺癌是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，在美國，肺癌的發(fā)病率在男性和女性中均居第二位，而死亡率則均高居第一位。而在我國，肺癌每年發(fā)病人數(shù)約78萬，肺癌在男性中的發(fā)病率和死亡率均位于第一，女性中發(fā)病率位于第二，死亡率位于第一。肺癌主要包括兩種病理類型，即非小細(xì)胞肺癌（non?small cell lung cancer， NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer， SCLC），NSCLC 又可以進(jìn)一步分為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌及大細(xì)胞肺癌［1］。近年來，隨著醫(yī)學(xué)和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對于肺癌的治療也取得了一些進(jìn)展。目前肺癌的治療方式主要包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，然而肺癌患者的5年生存率仍相對較低，其主要原因可能是因?yàn)榛颊咴谥委熯^程中對放化療等常規(guī)治療手段產(chǎn)生耐藥或抵抗。目前醫(yī)學(xué)上常通過應(yīng)用新藥、單獨(dú)或聯(lián)合使用化療及放療等方案解決耐藥的問題，然而耐藥的具體產(chǎn)生機(jī)制仍有待研究。

目前越來越多的學(xué)者認(rèn)為，肺癌治療中耐藥的產(chǎn)生可能是由于腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）的存在。CSC不同于一般的腫瘤細(xì)胞，它具有自我更新和分化的能力，其在腫瘤形成、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥等方面都起著重要的作用。CSC可以通過不對稱分裂擁有自我更新和分化成其他細(xì)胞的能力，除此之外，其還可以通過對稱分裂獲得膨脹發(fā)展的能力。有研究［2］顯示，單純的CSC細(xì)胞可以呈現(xiàn)兩種分裂方式，可形成大量增殖的CSC以及非CSC的腫瘤細(xì)胞，而單純的非CSC細(xì)胞培養(yǎng)僅呈現(xiàn)對稱分裂的分裂形式。此外，化療等細(xì)胞應(yīng)激條件可以促使CSC對稱性分裂而大量增殖，這種效應(yīng)在化療的過程中不斷放大，最終形成化療耐藥的腫瘤。Liu等［3］的研究顯示在裸鼠的肺癌模型中，接受鉑類的治療后，肺CSC的比例顯著增加。

常規(guī)的化療方案可以殺死大量的腫瘤細(xì)胞，但是CSC可以通過多種方式導(dǎo)致化療耐藥。首先，CSC細(xì)胞可以通過增強(qiáng)DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)從而修復(fù)化療導(dǎo)致的DNA損傷。以鉑類為基礎(chǔ)的化療方案主要通過與腫瘤細(xì)胞的DNA相互作用，形成鏈內(nèi)及鏈間的交聯(lián)，從而破壞染色體的結(jié)構(gòu)并影響細(xì)胞分裂，但與此同時(shí)細(xì)胞內(nèi)還會(huì)激活DNA損傷修復(fù)應(yīng)答反應(yīng)的信號網(wǎng)絡(luò)。對于化療敏感性的腫瘤細(xì)胞，DNA損傷的程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了細(xì)胞的修復(fù)能力，因而出現(xiàn)細(xì)胞凋亡；然而CSC可以增強(qiáng)對DNA損傷識(shí)別和修復(fù)的能力，從而使其存活，產(chǎn)生化療抗性［4］。 近期的研究［5］顯示，與DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的過表達(dá)也與CSC的化療抗性程度顯著相關(guān)。此外，化療藥物導(dǎo)致DNA損傷從而進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而CSC則可以通過啟動(dòng)抗凋亡機(jī)制增加細(xì)胞的存活。有研究［6－7］發(fā)現(xiàn)，抗凋亡蛋白Bcl?2在CSC中高表達(dá)，并且其在調(diào)節(jié)CSC的化療抵抗中起著重要的作用。CSC還可以通過多藥耐藥性外排泵促進(jìn)腫瘤細(xì)胞將化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，降低細(xì)胞內(nèi)的藥物含量從而導(dǎo)致化療抗性。ATP 結(jié)合的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP?binding cassette， ABC）家族是最具特征性的多藥耐藥性蛋白之一，研究［8］發(fā)現(xiàn)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量與多種腫瘤（NSCLC、乳腺癌、卵巢癌等）CSC的化療抗性顯著相關(guān)。

總之，肺癌中CSC的存在使得腫瘤細(xì)胞對于常規(guī)化療、放療等方案產(chǎn)生耐藥，因此，針對CSC的靶向藥物對于化療耐藥的治療、抑制腫瘤的進(jìn)展及復(fù)發(fā)顯得尤為重要。目前關(guān)于肺癌CSC導(dǎo)致化療耐藥的內(nèi)在機(jī)制還不是很明確，但是肺癌CSC的很多標(biāo)志物已經(jīng)被證實(shí)，其中包括乙醛脫氫酶?1（aldehyde de?hydrogenase?1， ALDH1 ）、 CD133， CD166、 CD87 和CD117等，這些標(biāo)志物的存在均與肺癌的治療抵抗密切相關(guān)。

1 ALDH家族與腫瘤耐藥

ALDH家族是可以將細(xì)胞內(nèi)的乙醛氧化成乙酸的酶類物質(zhì)，其在正常的造血干細(xì)胞中高表達(dá)，除此之外，其已經(jīng)成為多種惡性腫瘤CSC的表面標(biāo)志物［9］。ALDH1陽性的細(xì)胞其干性特征顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為增殖能力、自我更新及分化能力的增強(qiáng)和對化療藥物的抵抗程度增強(qiáng)等特征。將低劑量的ALDH1陽性的腫瘤細(xì)胞注射至裸鼠體內(nèi)，可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但是ALDH陰性的腫瘤細(xì)胞并沒有這種能力［10－11］。ALDH陽性的肺癌細(xì)胞系增殖能力顯著升高，并且可以產(chǎn)生ALDH陽性與陰性的混雜細(xì)胞群，而ALDH陰性的細(xì)胞只能繼續(xù)分裂成ALDH陰性的細(xì)胞群，這就說明ALDH陽性的細(xì)胞具有自我更新和分化的能力。在NSCLC患者中，ALDH在腫瘤組織的表達(dá)量要顯著高于癌旁組織［12］。一項(xiàng)針對1926例肺癌患者的薈萃分析［13］顯示，ALDH1高表達(dá)的患者，其總生存期和無病生存期均顯著下降。Notch通路是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信息傳導(dǎo)通路，研究［14］顯示，該通路參與維持ALDH1陽性肺癌CSC的干細(xì)胞特性。應(yīng)用γ?分泌酶抑制劑抑制Notch通路后，ALDH1陽性的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，并且腫瘤細(xì)胞的增殖能力大大減弱。ALDH1高表達(dá)后，CSC和EMT的標(biāo)志物均明顯增加，對于鉑類藥物的耐藥程度也大大增加［15］。

化療可以誘導(dǎo)ALDH1陽性的CSC產(chǎn)生增多。肺癌細(xì)胞系經(jīng)紫杉醇治療后，ALDH1陽性的CSC細(xì)胞數(shù)量大大增加。肺癌動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)［16］中，單用紫杉醇治療后，雖然腫瘤大小有所縮小，但是轉(zhuǎn)移灶增多，并且ALDH1陽性的CSC數(shù)目也有所增加。與此同時(shí)，增多的ALDH1陽性腫瘤細(xì)胞對多種化療藥物的耐藥程度顯著增加，如鉑類、吉西他濱、阿霉素、柔紅霉素、多西他賽等［15］。 一項(xiàng)最近的研究［17］顯示，使用靶向ALDH1的藥物二乙氨基苯甲醛和雙硫侖后，可以使順鉑耐藥的肺癌細(xì)胞系重新恢復(fù)對順鉑的敏感性。除此之外，放療也可誘導(dǎo)ALDH1陽性的CSC增加，重復(fù)的4Gy放射治療可誘導(dǎo)耐藥性A549細(xì)胞系的產(chǎn)生，表現(xiàn)出大量的ALDH1陽性細(xì)胞的增加，腫瘤的增殖能力以及對治療的耐藥程度大大增加［16］。

2 側(cè)群（side population，SP）細(xì)胞與腫瘤耐藥

研究者應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤細(xì)胞中分選出了一批Hoechst 33342染色陰性的細(xì)胞群，其具有干細(xì)胞特性，大部分的腫瘤細(xì)胞可以保留住 Hoechst 33342染料，而該細(xì)胞群將該染料完全轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外，呈現(xiàn)出Hoechst 33342染色陰性，這些細(xì)胞稱為SP細(xì)胞［18］。SP細(xì)胞可展現(xiàn)出增殖能力、自我更新和分化能力的增強(qiáng)等干性特征。SP細(xì)胞表面高表達(dá)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如 ABCG2、MDR1、ABCA2等，在這類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下，腫瘤細(xì)胞可以將化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致化療抵抗。通過分析六種 NSCLC 細(xì)胞（H460、H23、HTB?58、H441、H2170和A549）的SP細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)，SP細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例為1．5%～6．1%，并且SP細(xì)胞亞群展現(xiàn)出ABCG2的高表達(dá)，以及較強(qiáng)的增殖潛能和致瘤性，在應(yīng)用ABCG2抑制劑維拉帕米處理后，SP細(xì)胞的數(shù)量則大大減少［19］。

Yang等［20］從A549肺癌細(xì)胞系中分離出SP細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)量與非SP細(xì)胞相比顯著升高，克隆形成能力及對順鉑的抵抗程度顯著增強(qiáng)；但是SP細(xì)胞中自噬小體的表達(dá)顯著降低，在順鉑治療后，其表達(dá)量則有明顯增加，通過抑制SP細(xì)胞的自噬則可以增強(qiáng)鉑類藥物的治療效果。由于SP細(xì)胞的藥物泵出作用使SP細(xì)胞存在的腫瘤對于多種治療均產(chǎn)生耐藥，因此針對這種泵出效應(yīng)的治療是目前研究的一種治療方法。Pelitinib是一種不可逆的表皮生長因子受體（epidermal growth factor recep?tor，EGFR）抑制劑，其已用于治療肺癌的臨床試驗(yàn)中。有研究［21］發(fā)現(xiàn)Pelitinib可以競爭性抑制ABCB1和ABCG2，可以濃度依賴性的方式顯著抑制ABCB1和ABCG2介導(dǎo)的藥物外排，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。除此之外，近期的一項(xiàng)研究［22］顯示對鉑類化療產(chǎn)生耐藥的NSCLC患者表現(xiàn)出較高的膽固醇含量和ABCG2的表達(dá)。體外模型研究［22］證實(shí)，膽固醇可以增加肺癌細(xì)胞對于治療的耐藥程度，而ABCG抑制劑尼卡地平可以治療由膽固醇所致的化療耐藥。同樣，用他汀類藥物聯(lián)合化療也可以增加腫瘤對于化療的敏感性。

吸煙是肺癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，研究［23］顯示吸煙可以通過增加SP細(xì)胞的數(shù)量來增加腫瘤的耐藥程度。當(dāng)用香煙煙霧冷凝液處理A549肺癌細(xì)胞系后發(fā)現(xiàn)，SP細(xì)胞的數(shù)量增加，ABCG2的表達(dá)提高，并且多柔比星的流出量也大大增加，這一效應(yīng)則是通過PI3K／Akt通路介導(dǎo)的，因此使用PI3K／Akt通路抑制劑可以通過抑制該通路增加細(xì)胞內(nèi)多柔比星的含量使得腫瘤細(xì)胞對于化療藥物再次敏感［24］。

3 CD133與腫瘤耐藥

CD133是由prom基因編碼的120 kD大小的跨膜蛋白，其在未分化的細(xì)胞（造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞）和包括肺癌在內(nèi)的大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平較高［25－26］，是最常用的細(xì)胞表面抗原，用于檢測和分離各種實(shí)體瘤的CSC，包括腦、結(jié)腸、胰腺、前列腺、肺和肝臟。然而，最近有研究［27］表明，使用CD133作為CSC檢測和分離標(biāo)記物的準(zhǔn)確性。CD133已被假定為鑒定多種實(shí)體腫瘤類型中的CSC群體，包括幾種形式的腦癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、肝細(xì)胞癌和卵巢癌，其中前3種癌癥研究最多。研究［28］表明，表達(dá)CD133的CSC在移植入免疫缺陷小鼠后表現(xiàn)出自我更新潛力和再生組織學(xué)上相似的腫瘤塊的能力。一篇針對11項(xiàng)研究的meta分析［29］納入了1004例NSCLC患者的組織標(biāo)本，證實(shí)較高的CD133表達(dá)預(yù)示著患者較差的5年生存率，并且與患者的腫瘤分期、分化、淋巴轉(zhuǎn)移情況均密切相關(guān)。

在耐藥方面，肺癌中CD133陽性CSC的存在增加了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG2的表達(dá)，從而導(dǎo)致肺癌對于鉑類、吉他西濱、紫杉醇等一線藥物的耐藥。研究［3］顯示，低劑量的鉑類治療可以導(dǎo)致DNA的損傷而不是細(xì)胞死亡，可以誘導(dǎo)ABCG2的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步導(dǎo)致CD133陽性細(xì)胞增多。用特異性的ABCG2抑制劑泮托拉唑或ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑維拉帕米可以降低腫瘤對于鉑類的耐藥程度［3］。另一方面，缺氧狀態(tài)在多種實(shí)體腫瘤均存在，近期的研究［30］證實(shí)，缺氧狀態(tài)可以誘導(dǎo)CD133陽性和Oct4過表達(dá)的細(xì)胞產(chǎn)生，從而導(dǎo)致腫瘤對吉非替尼的耐藥，并且吉非替尼耐藥細(xì)胞的產(chǎn)生與HIF?1α和胰島素樣生長因子受體的表達(dá)相關(guān)，抑制HIF?1α和胰島素樣生長因子受體的表達(dá)可以減少CD133陽性的細(xì)胞數(shù)，緩解吉非替尼的耐藥。

4 CD166與腫瘤耐藥

CD166也稱之為活化的白細(xì)胞粘附分子，是一種膜糖蛋白，可表達(dá)于間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞表面。其可以介導(dǎo)白細(xì)胞的外滲、T細(xì)胞的活化和增殖。除此之外，CD166的高表達(dá)與多種惡性腫瘤的不良預(yù)后顯著相關(guān)，近年來也被認(rèn)為是肺癌CSC的標(biāo)志物之一。研究［31］發(fā)現(xiàn)，CD166陽性的NSCLC細(xì)胞體內(nèi)的成瘤能力以及體外的成球能力均顯著高于CD166陰性的細(xì)胞群，并且CD166的表達(dá)與甘氨酸脫羧酶（glycine decarboxylase，GLDC）、干細(xì)胞因子Lin28B顯著相關(guān)，下調(diào)GLDC和Lin28B后，細(xì)胞的增殖和呈瘤能力顯著下降；較高的 GLDC表達(dá)以及CD166陽性也預(yù)示著 NSCLC患者的不良預(yù)后。CD166也與肺癌的化療抵抗密切相關(guān)。研究［32］發(fā)現(xiàn)化學(xué)缺氧可以導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的干性增強(qiáng)以及對化療的敏感性降低，其中CD166陽性的細(xì)胞群對化療的抵抗程度要顯著高于CD166陰性的細(xì)胞群。SLC27A2是一類可以將長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的跨膜蛋白，Su等［33］研究發(fā)現(xiàn) SLC27A2在 CD166陽性的肺癌細(xì)胞群中低表達(dá)，并且其低表達(dá)可以通過負(fù)性調(diào)節(jié)Bmi1?ABCG2信號從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化療抵抗，體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)上調(diào)SLC27A2的表達(dá)后，CD166陽性的肺癌細(xì)胞對化療的敏感性顯著增加。

5 CD117與腫瘤耐藥

CD117是一種III型受體酪氨酸激酶，通過與其配體——干細(xì)胞因子結(jié)合來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和粘附。最近的研究［34］發(fā)現(xiàn)CD117在各種人類惡性腫瘤中異常過表達(dá)，并且它可能在致癌和轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵作用。在肺腺癌中，干細(xì)胞因子和CD117的過表達(dá)與患者的預(yù)后不良、低生存率和化療耐藥密切相關(guān)。癌癥中CD117的激活可導(dǎo)致許多下游信號傳導(dǎo)途徑的激活，例如 RAS／ERK、PI3?激酶、SRC、JAK／STAT、WNT和NOTCH，并且已知這些途徑的激活誘導(dǎo)“干性”或莖樣表型。例如，活化的酪氨酸激酶SRC與急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）細(xì)胞中Akt?mTOR相互作用，從而增強(qiáng)了AML細(xì)胞的干性［35］。NSCLC細(xì)胞系在CSC選擇性培養(yǎng)基中形成腫瘤球，其CD117的表達(dá)升高對化療的耐藥能力增加。

6 CD87與腫瘤耐藥

大多數(shù)的實(shí)體腫瘤表現(xiàn)出尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）和其受體（uPAR）表達(dá)的升高，該受體也稱之為CD87。uPA及其受體CD87水平升高與許多腫瘤患者的預(yù)后不良密切相關(guān)。CD87有助于控制膜相關(guān)的細(xì)胞外蛋白水解和跨膜信號傳導(dǎo)，從而影響細(xì)胞在生理和病理?xiàng)l件下的遷移和侵襲［36－37］。惡性細(xì)胞中的CD87過表達(dá)是由幾種致癌途徑的激活引起的，包括MAPK、RTK、ERK2和 FAK。 在 NSCLC和其他腫瘤的小鼠模型中，抑制CD87可以抑制腫瘤生長、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移［38］。CD87水平升高與鱗狀細(xì)胞癌和NSCLC患者的死亡率升高相關(guān)［39］。Gutova等［40］從SCLC細(xì)胞系中分離出了CD87陽性的細(xì)胞系，證實(shí)了其高表達(dá)CSC的標(biāo)志物，并且具有干細(xì)胞特性。CD87陽性的細(xì)胞可以增加腫瘤的分化潛能，增加腫瘤對于傳統(tǒng)化療藥物（鉑類、依托泊苷、紫杉酚）的耐藥程度。

一線化療方案聯(lián)合特異性靶向CSC的藥物可以作為治療腫瘤化療耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的有效方案，然而目前針對肺癌干細(xì)胞的藥物還沒有廣泛應(yīng)用于臨床。CSC標(biāo)志物的抑制劑，比如ABCG2抑制劑可以顯著提高CSC對于化療藥物的敏感性。阿西替尼是一種靶向酪氨酸激酶的小分子口服藥物，它可以抑制CD117和ABCG2的表達(dá)，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)［41］均證實(shí)，其可以改善腫瘤對于化療藥物的多重耐藥。阿西替尼和多柔比星的聯(lián)合治療可以增加SP細(xì)胞內(nèi)多柔比星的細(xì)胞內(nèi)含量，并且增強(qiáng)多柔比星的細(xì)胞毒作用。此外，有研究［42］通過抑制 ALDH1在 CSC中的表達(dá)緩解腫瘤化療的耐藥程度。傳統(tǒng)的化療方案對于惡性胸膜間皮瘤療效甚微，應(yīng)用ALDH1抑制劑（二乙基氨基苯）可以增加腫瘤對于鉑類化療的敏感性，在A549和H522肺癌細(xì)胞系中，沉默ALDH1A1的表達(dá)或者應(yīng)用ALDH1抑制劑也可以顯著減少細(xì)胞的增殖能力和遷移能力［42］。 除此之外，有研究［43］發(fā)現(xiàn)了另一種ALDH1的抑制劑雙硫侖，既往通常將雙硫侖用于慢性酒精中毒的治療，而雙硫侖可以特異性抑制CSC的ALDH1的表達(dá)，從而增加鉑類的細(xì)胞毒性，增強(qiáng)腫瘤對于放療、化療的敏感性。一項(xiàng)針對轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的臨床試驗(yàn)［44］證實(shí)，雙硫侖聯(lián)合鉑類或者長春瑞濱的治療表現(xiàn)出良好的患者耐受性，并且可以顯著提高患者的總生存率。

7 結(jié)論與展望

盡管目前靶向藥物治療不斷發(fā)展，但是其對于改善肺癌患者預(yù)后的效果并不明顯。CSC在腫瘤的治療耐藥中起著重要的作用。針對干細(xì)胞信號通路的藥物可以緩解腫瘤的耐藥程度，預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)，延緩腫瘤的進(jìn)展并提高患者的生存率。但是目前針對CSC的藥物尚未大規(guī)模應(yīng)用于臨床，大部分還處于臨床前研究和臨床試驗(yàn)階段，相信在不久的將來，CSC的靶向藥可以廣泛應(yīng)用于臨床，有效緩解肺癌患者對于傳統(tǒng)治療方案的耐藥，為腫瘤患者的治療提供新策略和新方法。