葡萄酒中潛在有害物質(zhì)研究進(jìn)展

魏曉峰，楊臘，UWAMAHORO Francoise，陳秋崇，李雨萌，房玉林*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院/陜西省葡萄與葡萄酒工程研究中心，陜西楊凌 712100）

作為一種營養(yǎng)豐富的低度發(fā)酵酒，除水和酒精以外，葡萄酒中還含有維生素、糖、有機(jī)酸等600余種物質(zhì)[1-2]；此外，葡萄酒中存在的白藜蘆醇等活性物質(zhì)對(duì)人體健康具有諸多積極作用，可輔助消化、滋補(bǔ)養(yǎng)顏、殺菌、利尿、延緩衰老、預(yù)防血栓、清除活性氧、促進(jìn)新陳代謝[3-4]。由于這些特殊功效以及人們消費(fèi)理念的改變，葡萄酒正在迅速地被廣大消費(fèi)者所接受和認(rèn)可。

在葡萄酒的各種功效被開發(fā)利用并受到消費(fèi)者追捧的同時(shí)，其質(zhì)量往往容易被忽視。葡萄酒的質(zhì)量包括理化、感官和安全衛(wèi)生幾個(gè)方面，其中安全衛(wèi)生是其必備基礎(chǔ)[5]。原料、酵母、發(fā)酵和貯藏等條件都會(huì)影響葡萄酒的質(zhì)量，而由于原料或生產(chǎn)環(huán)節(jié)等的影響，葡萄酒中可能存在生物胺、農(nóng)藥殘留、甲醇、雜醇油、防腐劑及赭曲霉毒素等有害物質(zhì)，過多攝入這些物質(zhì)會(huì)對(duì)人體健康構(gòu)成威脅[6-7]。目前對(duì)葡萄酒功能物質(zhì)的開發(fā)利用[8]、葡萄酒營養(yǎng)與保健[9]、葡萄酒中單一有害物質(zhì)的檢驗(yàn)控制[10]常有報(bào)道，但關(guān)于葡萄酒中可能存在的有害物質(zhì)的整體分析還很少見，故本文從形成原因、危害、限量、檢測(cè)技術(shù)及控制方法等方面對(duì)葡萄酒中可能存在的有害物質(zhì)進(jìn)行了分析，旨在促進(jìn)優(yōu)質(zhì)葡萄酒生產(chǎn)，提高消費(fèi)者安全意識(shí)。

1 生物胺

生物胺（Biogenic amines,BA）具有活性，是一類低分子量的含氮有機(jī)化合物[6]，它的結(jié)構(gòu)分為脂肪族、芳香族和雜環(huán)族3類。生物胺存在于各種動(dòng)植物的組織中，奶酪、發(fā)酵香腸、啤酒、黃酒、葡萄酒等眾多發(fā)酵食品中也普遍存在[11]。

1.1 生物胺的形成原因

食品中生物胺主要是由脫羧酶催化脫羧產(chǎn)生，或者是醛和酮通過氨基化和轉(zhuǎn)胺作用產(chǎn)生。組氨酸可轉(zhuǎn)化為組胺，賴氨酸可轉(zhuǎn)化為尸胺，此外，酪氨酸、色氨酸、鳥氨酸、精氨酸等都是生物胺的主要前體物質(zhì)。產(chǎn)生生物胺需要有足夠的游離氨基酸，此外，還需要有具有氨基酸脫羧酶活性的微生物及適合微生物生長(zhǎng)和脫羧反應(yīng)的條件[12]。

1.2 生物胺的功能及毒性

微量生物胺是細(xì)胞中重要的活性成分，有助于促進(jìn)生長(zhǎng)和代謝、控制血壓、消除自由基等；此外，生物胺還是合成荷爾蒙、核酸、蛋白質(zhì)等的前體。但生物胺也是致癌物質(zhì)的前體；過量攝入生物胺會(huì)導(dǎo)致頭痛、惡心、血壓變化、呼吸紊亂等過敏反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)甚至還會(huì)危及生命[11-13]。

組胺是研究最多、對(duì)人體影響最大的生物胺，歐盟規(guī)定其在魚類產(chǎn)品中含量不能超過400 mg/kg。而對(duì)于葡萄酒而言，許多國家都對(duì)其組胺含量作出了嚴(yán)格規(guī)定（2～10 mg/L）[6,11-13]，對(duì)其他生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)還不夠完善。

1.3 生物胺的影響因素

葡萄酒中生物胺含量受品種、氣候、工藝、儲(chǔ)存條件等因素影響。作為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，若葡萄生長(zhǎng)過程出現(xiàn)氮過量或者礦物質(zhì)缺乏，生物胺的含量就會(huì)增加[6]；不同品種的葡萄中生物胺含量也不相同，比如在同等條件下，‘西拉’葡萄酒中腐胺、亞精胺和精胺的濃度均高于‘歌海娜’葡萄酒；而由于不同年份的氣候條件和自然菌群差異，葡萄中的生物胺含量也會(huì)不同[12]。就生產(chǎn)過程而言，發(fā)酵過程中影響生物胺產(chǎn)生的因素主要是乳酸菌中氨基酸脫羧酶的活性；并且使用不同酵母菌發(fā)酵得到的葡萄酒生物胺含量也不同；蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）之后，組胺、酪胺和腐胺的含量都會(huì)增加；酵母可以通過自溶效應(yīng)釋放氨基酸，所以如果發(fā)酵結(jié)束后酒和酒泥接觸時(shí)間過長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致葡萄酒中生物胺含量升高[12,14]；此外，一般pH較高時(shí)，細(xì)菌繁殖較快，生物胺產(chǎn)生較多；此外，不同果膠酶種類、添加時(shí)間、添加量、發(fā)酵溫度等都會(huì)對(duì)生物胺含量產(chǎn)生影響[15-16]。

1.4 生物胺的檢測(cè)方法

生物胺缺少發(fā)色基團(tuán)，其本身沒有無紫外吸收和熒光電化學(xué)活性，所以其分離和測(cè)定都比較困難。電化學(xué)生物傳感器測(cè)定生物胺簡(jiǎn)便快捷，但成本高，不能反復(fù)使用；毛細(xì)管電泳靈敏度高、分離速度快、成本低、易操作、污染小[12,14,17]，但也存在難分離等缺陷；離子色譜法分析時(shí)間較長(zhǎng)，不適用于日常批量檢測(cè)；HPLC具有分析速度快、柱效高、檢測(cè)靈敏度高、定量分析準(zhǔn)確的特點(diǎn)，已成為生物胺測(cè)定中的主要方法，但操作相對(duì)繁瑣，衍生化時(shí)間長(zhǎng)[13]；高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法準(zhǔn)確靈敏且前處理簡(jiǎn)單，可嘗試作為葡萄酒中生物胺篩選和確認(rèn)的檢測(cè)方法[18]。

1.5 生物胺的控制

根據(jù)生物胺的產(chǎn)生原因，首先應(yīng)嚴(yán)格控制原料及商業(yè)發(fā)酵劑的質(zhì)量，嚴(yán)格避免霉變、腐爛葡萄及生物胺菌株的污染[6,12,14]；其次，要接種優(yōu)良的酵母菌株，添加活性干酵母可快速啟動(dòng)酒精發(fā)酵，同時(shí)能抑制野生酵母生長(zhǎng)，從而控制生物胺的生成量；同時(shí)，MLF結(jié)束后應(yīng)及時(shí)添加足夠SO2來終止發(fā)酵，否則乳酸菌會(huì)繼續(xù)將氨基酸脫羧產(chǎn)生生物胺，葡萄酒與酒泥接觸時(shí)間過長(zhǎng)也會(huì)增加生物胺的產(chǎn)生，在MFL后進(jìn)行轉(zhuǎn)罐、下膠、澄清等處理，并且在低溫下貯存也有利于控制生物胺的產(chǎn)生量[6,13]；此外，葡萄酒中生物胺主要由乳酸菌對(duì)氨基酸脫羧而產(chǎn)生，故在實(shí)際生產(chǎn)中，可通過接種無氨基酸脫羧酶活性的菌株進(jìn)行MLF，從而降低生物胺含量。

2 農(nóng)藥殘留

農(nóng)藥殘留是指由于不易分解，在施用后殘留在土壤、作物以及環(huán)境中的一部分農(nóng)藥農(nóng)殘被人進(jìn)食后在體內(nèi)積累，引起中毒反應(yīng)[19]。

2.1 農(nóng)殘的形成及危害

在葡萄的田間管理過程中，尤其在黃河故道、京津塘、環(huán)渤海等夏秋多雨產(chǎn)區(qū)，經(jīng)常噴施大量的農(nóng)藥包括殺蟲劑、殺菌劑和除草劑等來防治病害，這些農(nóng)藥首先進(jìn)入葡萄果實(shí)中，然后通過發(fā)酵進(jìn)入葡萄酒中。由于田間管理不規(guī)范和過量農(nóng)藥的使用，導(dǎo)致部分果實(shí)中農(nóng)藥殘留量過高，這會(huì)影響酵母的正常生長(zhǎng)代謝，延遲發(fā)酵，甚至產(chǎn)生一些不良代謝產(chǎn)物和異味物質(zhì)，影響葡萄酒的感官質(zhì)量[7,20]。這不僅給葡萄酒的質(zhì)量安全帶來了巨大隱患，阻礙了中國葡萄酒在世界貿(mào)易中的發(fā)展，更在一定程度上對(duì)人身健康產(chǎn)生潛在的威脅，同時(shí)這也是衡量社會(huì)管理水平和國家法制建設(shè)的一個(gè)重要方面[21]。

2.2 檢測(cè)方法

目前葡萄酒中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法很多，以色譜法為主。氣相色譜法靈敏、效率高、速度快、選擇性好，但不能準(zhǔn)確測(cè)定熱穩(wěn)定性差的農(nóng)藥[20]；而相反，高效液相色譜法對(duì)于熱穩(wěn)定性差的農(nóng)藥更加適用，但其對(duì)檢測(cè)器選擇要求較高[19,22]；GC-MS分離效能高，且能夠準(zhǔn)確鑒定結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可定性定量檢測(cè)農(nóng)藥；LC-MS具有靈敏度高、選擇性好、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，但價(jià)格昂貴，目前在葡萄酒農(nóng)殘分析中的應(yīng)用還較少[7,19]。

2.3 控制手段

葡萄酒中的農(nóng)藥殘留來自于葡萄果實(shí)，所以必須從葡萄栽培管理開始著手，做到既要保證葡萄的正常生長(zhǎng)，減小葡萄病害的發(fā)生，又要保證葡萄酒中的農(nóng)藥殘留低于相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)[19,21]；同時(shí)，應(yīng)致力于更優(yōu)質(zhì)農(nóng)藥和更有效檢測(cè)手段的研究上，研發(fā)高效低毒農(nóng)藥[23]，開發(fā)多組分同時(shí)檢測(cè)技術(shù)，樣品制備實(shí)現(xiàn)微量、自動(dòng)、無毒、快速和低成本化；相關(guān)部門也應(yīng)盡早制定出更加嚴(yán)格、規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)及法規(guī)并切實(shí)有效地付諸實(shí)施；積極推行GMP和HACCP[24]認(rèn)證，規(guī)范葡萄酒釀造工藝，建立葡萄酒安全性質(zhì)量可追溯體系。

3 甲醇及雜醇油

甲醇（Methanol）對(duì)血管有麻痹作用及有導(dǎo)致神經(jīng)變性的作用[25]，自釀葡萄酒由于發(fā)酵等條件控制不好，常會(huì)發(fā)生甲醇含量超標(biāo)的情況，根據(jù)我國GB 15037—2006《葡萄酒》規(guī)定紅葡萄酒中甲醇含量最高不得超過400 mg/L。雜醇油（Fusel Oil）是指高級(jí)醇的混合物，主要包括異丁醇和異戊醇[10]。

3.1 作用和危害

高級(jí)醇是葡萄酒的呈香物質(zhì)之一，由蛋白質(zhì)、氨基酸和糖類分解而成。適量高級(jí)醇能夠使葡萄酒中的果香更加優(yōu)雅、和諧，酒體更加豐滿；但含量過高則會(huì)影響葡萄酒的風(fēng)味和口感甚至人體健康；它能使人頭痛、惡心、嘔吐[26]。而甲醇含量高會(huì)引起失明等癥狀，甲醇含量是評(píng)判葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)[27]。

3.2 影響因素

酵母菌種及接種量不同，甲醇及雜醇油產(chǎn)量不同，發(fā)酵不完全會(huì)導(dǎo)致高級(jí)醇含量偏高；不同品種葡萄的總氮含量不同，氮含量不足會(huì)影響酵母合成代謝，產(chǎn)生較多的高級(jí)醇；發(fā)酵溫度越高，加糖量越大，高級(jí)醇含量就越高[25]；而與分次分批加糖相比，一次性加糖生成的雜醇油稍高；添加果膠酶，有害物質(zhì)甲醇及雜醇油均有增加，葡萄果膠含量越大，甲醇含量就越高[28]。

3.3 測(cè)定方法

目前常利用氣相色譜技術(shù)對(duì)葡萄酒中的甲醇進(jìn)行測(cè)定，該方法相對(duì)繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，且蒸餾過程中甲醇容易揮發(fā)損失[10]。而頂空氣相色譜法處理簡(jiǎn)單、操作方便、檢測(cè)時(shí)間短，但加入內(nèi)標(biāo)會(huì)導(dǎo)致時(shí)間延長(zhǎng)、誤差增大[26]；頂空氣相色譜外標(biāo)法則不需加內(nèi)標(biāo)，避免了內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)，被認(rèn)為是一種較為簡(jiǎn)便、高效的測(cè)定葡萄酒甲醇的方法[29]。

3.4 控制方法

首先要加強(qiáng)葡萄栽培管理，提高其原料的內(nèi)在品質(zhì)；釀造時(shí)再選擇合適酵母菌種及接種量的同時(shí)，要嚴(yán)格控制發(fā)酵溫度、浸漬時(shí)間和加糖量，可以考慮結(jié)合冷浸漬發(fā)酵和桃紅工藝；在釀酒輔料的使用中，對(duì)果膠酶的使用應(yīng)根據(jù)不同活性的果膠酶進(jìn)行測(cè)試，從而有效控制發(fā)酵中甲醇及雜醇油的產(chǎn)生；在貯存容器方面，采用橡木桶貯藏有利于葡萄酒中各類物質(zhì)的締合，同時(shí)有利于甲醇含量的降低[26-30]。

4 氨基甲酸乙酯

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）在工業(yè)生產(chǎn)中是重要的化工原料，可作農(nóng)藥、醫(yī)藥等有機(jī)合成的中間體，人的每日最大無毒劑量為0.3 ng/kg體重[31]。EC可能會(huì)誘發(fā)肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等疾病，并且高含量的乙醇可能對(duì)EC的致癌性具有促進(jìn)作用，國際癌癥機(jī)構(gòu)（IARC）已將EC列為“2A”類致癌物，同時(shí)世界衛(wèi)生組織又將其列為重點(diǎn)監(jiān)控物質(zhì)之一[32]。

4.1 合成途徑

EC的合成途徑有：焦碳酸二乙酯和氨反應(yīng)、氨甲酰磷酸和乙醇反應(yīng)、瓜氨酸和乙醇反應(yīng)、氰酸和乙醇反應(yīng)以及尿素和乙醇反應(yīng)等5條途徑。目前普遍認(rèn)為，葡萄酒中EC的形成主要與兩種前體物質(zhì)有關(guān)，即尿素和瓜氨酸。尿素和瓜氨酸在葡萄汁和葡萄酒中的積累分別是葡萄酒酵母和葡萄酒蘋果酸-乳酸菌（MLB）對(duì)葡萄汁中精氨酸代謝的結(jié)果。尿素、瓜氨酸和乙醇自發(fā)反應(yīng)生成EC[31]。

4.2 影響因素

醇的反應(yīng)是葡萄酒中形成EC的主要途徑。葡萄酒發(fā)酵和貯藏過程中都存在形成EC的前體物質(zhì)。作為EC形成前體物質(zhì)之一的尿素一部分由葡萄原料帶入，但絕大部分是由酵母菌代謝產(chǎn)生。若含量超標(biāo)，在發(fā)酵、運(yùn)輸和貯藏過程中，尿素會(huì)與乙醇反應(yīng)生成EC[33]；此外，酵母品種、原料同化氮及α-氨基酸含量、發(fā)酵條件等也會(huì)影響EC形成，加熱可促進(jìn)EC形成[34]。

4.3 檢測(cè)方法

EC的提取和檢測(cè)方法也在不斷發(fā)展進(jìn)步，經(jīng)過柱前衍生之后，利用HPLC-FLD檢測(cè)EC的方法準(zhǔn)確度和精確度都很低，且檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)偏差較大；HPLC/MS方法精確度相對(duì)較高，但所需儀器昂貴，不適合大量樣品檢測(cè)；傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR）檢測(cè)快速，但僅適合定性或半定量檢；FUR方法的靈敏度和精密度較髙，但目前還不能滿足酒精飲料限量精準(zhǔn)的測(cè)定要求[35]。GC-MS法是目前最常用且分析效果最好的檢測(cè)EC的方法，但萃取方法有差別，液-液萃取無需貴重儀器，但乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，系統(tǒng)誤差較大；固-液萃取法和固相萃取法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，但前者溶劑用量大；固相微萃取法雖簡(jiǎn)便快速環(huán)保，且不需萃取溶劑，是目前應(yīng)用最多的方法[32]。

4.4 控制方法

控制EC，應(yīng)適當(dāng)降低發(fā)酵溫度；防止發(fā)酵過程中污染雜菌（乳酸桿菌、乳酸球菌等）；適當(dāng)選用尿素和精氨酸含量低的原料。選擇合適的酵母菌和乳酸菌，微生物代謝精氨酸的能力越強(qiáng)，生成的尿素就越多，導(dǎo)致生成的EC就越多；另外，當(dāng)酒中尿素含量過高時(shí)適量添加脲酶可以有效清除尿素，但要慎重考慮此操作對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響[36-37]。

5 問題與展望

除以上所述外，實(shí)際生產(chǎn)中還存在眾多安全隱患，如由于生態(tài)環(huán)境、農(nóng)藥肥料和釀酒設(shè)備等的影響而導(dǎo)致的重金屬污染；葡萄種植、釀造過程中容易出現(xiàn)的赭曲霉毒素污染；防腐、防霉等食品添加劑的問題等，若不加注意，都可能對(duì)葡萄酒質(zhì)量甚至人體安全構(gòu)成威脅。而目前自釀葡萄酒的現(xiàn)象也越來越廣泛，釀酒人員缺乏專業(yè)培訓(xùn)，純手工操作也使成品穩(wěn)定性得不到保證，此外，安全意識(shí)的缺乏也為自釀葡萄酒的安全埋下隱患。針對(duì)此現(xiàn)狀，應(yīng)從以下幾點(diǎn)進(jìn)行防治：

（1）重點(diǎn)提高葡萄原料質(zhì)量，合理進(jìn)行葡萄園選址、釀酒設(shè)備選擇，正確適量使用農(nóng)藥；適時(shí)采收、嚴(yán)格篩選，從根源上減少安全隱患。

（2）建立健全葡萄酒質(zhì)量安全追溯體系；加強(qiáng)葡萄酒質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)方面的研究，建立健全葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)體系和安全操作規(guī)范，不斷改進(jìn)釀酒工藝，提高釀酒技術(shù)水平。

（3）加大《食品安全法》宣傳，貫徹實(shí)施力度，繼續(xù)深入推進(jìn)葡萄酒市場(chǎng)準(zhǔn)入制度，建立一個(gè)長(zhǎng)效的葡萄酒安全管理體制。重點(diǎn)建立葡萄及葡萄酒質(zhì)量安全溯源體系，嚴(yán)厲打擊制售假酒等違法犯罪行為，加強(qiáng)對(duì)重點(diǎn)消費(fèi)環(huán)節(jié)的監(jiān)管力度。

（4）加強(qiáng)安全知識(shí)普及，加強(qiáng)技術(shù)推廣，使人們?cè)谙硎茏葬勂咸丫茽I養(yǎng)價(jià)值和飲用價(jià)值的同時(shí)，對(duì)自身的健康和安全負(fù)責(zé)。