竹節(jié)參提取物對(duì)慢性酒精性肝損傷模型小鼠血清生化指標(biāo)及炎癥因子水平的影響

何志剛 汪洋鵬 劉 磊 樓招歡

竹節(jié)參為五加科人參屬植物Panax jaonicus C.A.Mey的干燥根，為現(xiàn)行《中國(guó)藥典》收載品種，含有皂苷、多糖等成分，具有散瘀止血，消腫止痛，祛痰止咳，補(bǔ)虛強(qiáng)壯等功效[1]。近年研究表明，竹節(jié)參醇提取物、多糖、總皂苷等具有抗酒精[2]、四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷和棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性[3-4]、乙醇介導(dǎo)的肝細(xì)胞LO2損傷[5]等作用，顯示了良好的保肝作用。本實(shí)驗(yàn)觀察竹節(jié)參水、醇提取物對(duì)慢性酒精性肝損傷模型動(dòng)物血生化指標(biāo)及炎癥因子水平的干預(yù)作用，為進(jìn)一步研究竹節(jié)參抗酒精性肝損傷作用及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 雄性ICR小鼠40只，體質(zhì)量18～20g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：No.1610100014，許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001。于室溫23±2℃，相對(duì)濕度50%～70%飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑 竹節(jié)參提取物制備：取竹節(jié)參飲片（四川時(shí)珍堂巴東藥業(yè)有限公司，批號(hào)151103），加入10BV量70%（v/v）乙醇，回流提取2次，合并提取液，減壓回收并濃縮至適當(dāng)體積，分裝，置冰箱內(nèi)保存，得竹節(jié)參醇提取物（PJEE）；以水為提取溶劑，同法制備竹節(jié)參水提取物（PJWE）。陽(yáng)性對(duì)照藥易善復(fù)（批號(hào)6BJD130B）：將易善復(fù)膠囊溶于蒸餾水中，超聲波乳化，配成2.05 mg/mL的乳劑。造模試劑：紅星二鍋頭酒（酒精度52%，2.0L/瓶，北京紅星股份有限公司）臨用前與純水按一定體積比例稀釋至所需灌胃濃度。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批號(hào) 16052001）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST，批號(hào) 16091901）、總膽固醇（TC，批號(hào)15100801）、甘油三酯（TG，批號(hào) 16030301）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C，批號(hào)16031401）試劑盒購(gòu)自寧波美康生物科技股份有限公司；白介素-6（IL-6，批號(hào) 220661232）、白介素-1β （IL-1β，批號(hào)2201B61232）ELISA試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀 器 TBA-40FR全自動(dòng)生化儀，日本東芝醫(yī)療系統(tǒng)株式會(huì)社；Powerwave340酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-TEK公司；Heraeus Biofuge Stra冷凍離心機(jī)，德國(guó)Heraeus；XHF-D高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；wh-861渦懸混合器，太倉(cāng)市科教器材廠；DS-671電子計(jì)重秤，上海寺岡電子有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型復(fù)制及給藥 取ICR小鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、易善復(fù)組（205.2mg/kg）、竹節(jié)參醇提取物（PJEE，1.35g/kg）組、竹節(jié)參水提取物（PJWE，1.35g/kg）組，每組8只。所有小鼠均給予基礎(chǔ)飼料，自由采食飲水。除正常組外，其余各組小鼠采用梯度乙醇灌胃法復(fù)制酒精性肝損傷（ALI）小鼠模型。參照文獻(xiàn)[6]并結(jié)合預(yù)試，各造模小鼠于每天上午8:00按0.1mL/10g體質(zhì)量灌胃量，灌胃給予梯度濃度紅星二鍋頭，濃度從30%開始，按每5天5%遞增至45%后，再連續(xù)灌胃4周復(fù)制慢性酒精性肝損傷模型。自造模第1天起，除正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌服蒸餾水外，其余各給藥組按0.1mL/10g體質(zhì)量灌胃量分別灌胃給予20.5mg/mL易善復(fù)、0.135g/mL竹節(jié)參水提取物和0.135g/mL竹節(jié)參醇提取物，1天1次，連續(xù)6周。

2.2 指標(biāo)檢測(cè) （1）一般行為學(xué)觀察：每天觀察毛發(fā)、活動(dòng)情況、飲食飲水，每3天測(cè)定一次體質(zhì)量，觀察體質(zhì)量變化情況。（2）血液生化學(xué)指標(biāo)及氧化指標(biāo)的影響：于造模2、4、6周，采血，離心制備血清，全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清 ALT、AST、TC、TG、HDL-C 水平。（3）血清炎癥因子水平檢測(cè)：于造模4、6周，眼眶采血，3500r/min離心10min，分離血清，ELISA法測(cè)定血清 IL-1β、IL-6水平。（4）肝臟器指數(shù)檢查：于實(shí)驗(yàn)期末，采血后解剖小鼠，迅速分離肝臟，冰生理鹽水洗盡血漬，濾紙吸干，稱定肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)[7]。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以用（±s） 表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1各組小鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)比較 與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量呈逐漸下降趨勢(shì)，其中第4、6周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，竹節(jié)參各提取物組小鼠體質(zhì)量有上升趨勢(shì)，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組小鼠肝臟指數(shù)顯著增大（P＜0.05）；與模型組比，竹節(jié)參水、醇提取物組小鼠肝臟指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 1。

3.2 各組小鼠肝功能指標(biāo)比較 與正常組比較，自第2周起，模型組小鼠血清ALT、AST活性隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，自造模第4周起，竹節(jié)參水、醇提取物組均能有效降低模型小鼠血清ALT、AST活性，其中以竹節(jié)參醇提取物組的作用較為顯著（P＜0.05）。見圖2。

3.3 各組小鼠血脂水平比較 與正常組比較，模型組小鼠血清TC、HDL-C水平隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)而呈逐漸降低趨勢(shì)（P＜0.05）；TG水平在第2周有上升趨勢(shì)，但在造模后期呈下降趨勢(shì)。與模型組比較，竹節(jié)參醇提取物組在第2周能顯著降低模型小鼠血清TG水平（P＜0.05），第6周能逆轉(zhuǎn)模型小鼠血清TC、TG及HDL-C水平的降低（P<0.05）。見圖3。

3.4 各組小鼠血清炎癥因子水平比較 與正常組比較，在造模第4、6周，模型組小鼠血清IL-6、IL-1β水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，在不同觀察點(diǎn)，竹節(jié)參水、醇提取物均能顯著降低ALI小鼠血清 IL-6、IL-1β 水平（P＜0.01），其中，在第 4周以水提取物作用相對(duì)顯著，在第6周以醇提取物的作用較為明顯。見圖4。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量（A）及肝臟指數(shù)（B）比較

圖2 各組小鼠肝功能指標(biāo)比較

圖3 各組小鼠血脂水平比較

4 討 論

已知酒精性肝損傷中存在脂代謝紊亂和轉(zhuǎn)氨酶活性改變，血清ALT、AST活性及TG、HDL-C水平是急、慢性酒精性肝損傷的敏感觀察指標(biāo)[8-9]。血清ALT等指標(biāo)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)有助于了解慢性酒精性肝損傷發(fā)生發(fā)展過程及病變程度，為合適的藥物干預(yù)點(diǎn)的確定提供借鑒。本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠血清ALT、AST活性在造模2、4、6周均顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05，P<0.01），而竹節(jié)參醇提取物組在給藥第4、6周顯示出顯著的降A(chǔ)LT和AST作用（P<0.05）；竹節(jié)參水提取物降A(chǔ)LT、AST活性的作用不如醇提取物顯著。造模第2周模型小鼠血清TC、HDL-C水平下降，至第4周呈上升趨勢(shì)，第6周則又顯著性下降；血清TG水平呈現(xiàn)先升后降變化。與模型組比，在各觀察時(shí)間點(diǎn)，竹節(jié)參醇提取物組在第2周能顯著降低ALI小鼠血清TG水平（P＜0.05），且在給藥第6周均顯示了拮抗 TC、HDL-C 水平下降作用（P＜0.05），提示竹節(jié)參對(duì)酒精性肝損傷后期具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂的作用。

圖4 竹節(jié)參提取物對(duì)酒精性肝損傷模型小鼠血清炎癥因子水平的影響。

過量酒精攝入產(chǎn)生的腸源性內(nèi)毒素可活化核因子κB（NF-κB）炎癥信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-1β、IL-6等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，促進(jìn)酒精性肝損傷的發(fā)生和進(jìn)展[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中，造模第4周起，模型小鼠血清IL-1β、IL-6的水平顯著升高，并持續(xù)至第6周（P<0.01）；與模型組比，竹節(jié)參水、醇提取物組在4周、6周均能顯著降低模型小鼠血清IL-1β、IL-6水平（P<0.01，P<0.05），其中在第 4周以竹節(jié)參水提取物的作用較為顯著，第6周以竹節(jié)參醇提取物的抗炎作用較為明顯。

綜上所述，竹節(jié)參水、醇提取物均有一定的抗慢性酒精性肝損傷作用，但兩者作用側(cè)重點(diǎn)及作用時(shí)間和強(qiáng)度間存在一定的差異。系統(tǒng)深入的成分結(jié)合藥效研究，將有助于進(jìn)一步闡述竹節(jié)參抗酒精性肝損傷的作用及其藥效物質(zhì)，促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)。

［1］中國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2015版［S］.中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，北京，2015：138.

［2］王洪武，李守超，賀海波，等.竹節(jié)參提取物對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2012，17（9）：961-966.

［3］楊小林，陳平.竹節(jié)參多糖、總皂苷對(duì)小鼠急性肝損傷保護(hù)作用的研究［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2011，17（1）：65-66.

［4］覃玉娥，張長(zhǎng)城，王婷，等.竹節(jié)參多糖對(duì)肝細(xì)胞損傷的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息，2014，21（11）：59-62.

［5］李有貴，計(jì)東風(fēng)，鐘石，等.竹節(jié)人參皂苷對(duì)乙醇致肝細(xì)胞L-O2損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2011，25（3）：289-295.

［6］ J u nWe i Wa n g，X i nY i C h e n，P e i Y a n gH u，e t a l.E f fects of Linderae radix extracts on a rat model of alcoholic liver injury［J］.Experimental and Therapeutic Medicine，2016，11（6）：2185-2192.

［7］吳偉青，陳靜，劉超群，等.綠茶多酚對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用［J］.食品科學(xué)，2011,32（13）：310-313.

［8］趙敏，黃俊明，譚劍斌，等.小鼠急性酒精性肝損傷模型的動(dòng)態(tài)研究［J］.毒理學(xué)雜志，2010，24（5）：378-380.

［9］劉明，陳紹紅，鐘贛生，等.葛花枳椇子配伍對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝臟功能及病理形態(tài)的影響［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，31（2）：147-151.

［10］P e t r a s e kJ，M a n d r e k a r P，S z a b o G.T o l l-l i k e r e c e p t o r s i nt h e pathogenesis of alcoholic liver disease［J］.Gastroenterol Res Pract，2010，Volume，2010（1687-6121）：70-80.

［11］ S z a b oG.G u t-l i v e r a x i si na l c o h o l i cl i v e r d i s e a s e［J］.G a stroenterology，2015，148（1）：30-36.