山茱萸新苷抑制EAE模型大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及VCAM-1表達(dá)的研究

張榮博 徐 彬 朱敏姿 周未瑩 吳 憂 梁順利 章水晶 李 錚 袁 強(qiáng)

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）為中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是其常用動(dòng)物模型，發(fā)病機(jī)制均為CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫[1-2]。EAE模型中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）顯著增加，在介導(dǎo)T細(xì)胞通過(guò)血腦屏障侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)程中起重要作用[1，3-5]。山茱萸新苷可以在體外抑制臍靜脈表達(dá)VCAM-1[6]，本研究擬明確山茱萸新苷能否在EAE動(dòng)物活體內(nèi)抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)VCAM-1，抑制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，緩解EAE神經(jīng)功能缺損癥狀。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性Lewis大鼠[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2010-0002]32只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（360±10）g。普通級(jí)雄性DHP豚鼠 [浙江省湖州城區(qū)西風(fēng)洋特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，許可證號(hào)：SCXK（浙）2013-0060]5只，體質(zhì)量（300±8）g。

1.2 主要試劑 山茱萸新苷（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)131015），福氏完全佐劑（Sigma公司，批號(hào)SLBK1731V），兔抗鼠VCAM-1多克隆抗體（Santa Cruz公司，批號(hào)K0212），山羊抗兔IgG二抗（Santa Cruz公司，批號(hào)B1711），Trizol（Bio Basic公司，批號(hào) 40950732），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，批號(hào)CK1010），組織總蛋白提取試劑盒（Thermo Pierce公司，批號(hào) PD199707）。

1.3 主要儀器 CFX384多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），Mini-PROTEAN電泳系統(tǒng)及Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制作 參考尹琳琳等[7]方法。取豚鼠5只，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，剝離脊髓，剪除脊膜和馬尾，研磨制作50%的豚鼠脊髓勻漿。取兩個(gè)10mL注射器，一個(gè)抽取豚鼠脊髓勻漿5mL，另一個(gè)抽取福氏完全佐劑5mL，用三通管對(duì)接，低溫下反復(fù)抽打乳化至油包水乳劑，放入4℃冰箱中備用。誘導(dǎo)EAE時(shí)，予Lewis大鼠皮下注射油包水乳劑（每只大鼠每個(gè)后足墊各注射0.1mL）。注射當(dāng)天記為免疫后第0d，第二天記為免疫后第1d。每只大鼠僅在第0d注射1次油包水乳劑。

2.2 動(dòng)物分組及處理 將Lewis大鼠隨機(jī)均分為正常對(duì)照組、模型組、強(qiáng)的松組和山茱萸新苷組，每組8只。后三組大鼠均制作EAE模型。正常對(duì)照組、模型組予灌胃生理鹽水；山茱萸新苷組予含有山茱萸新苷（135mg/kg）的生理鹽水灌胃；強(qiáng)的松組，予含有醋酸潑尼松龍（5mg/kg）的生理鹽水灌胃。以上組別均在免疫后第1d開始灌胃，1天1次，每次液體量均為1.5mL。

2.3 神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)分 采用Corrêa等[8]的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：出現(xiàn)尾巴肌張力明顯減弱甚至消失，步態(tài)笨拙；2分：可見(jiàn)尾巴麻痹無(wú)力，雙后肢肌張力明顯減弱；3分：可及尾巴麻痹無(wú)力，后肢明顯癱瘓，疼痛等刺激后能移動(dòng)；4分：前肢也出現(xiàn)癱瘓，伴大小便失禁；5分：接近死亡或者已經(jīng)死亡。比較各組大鼠免疫后第14d神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)分。

2.4 組織病理學(xué)觀察 免疫后第14d（有大鼠表現(xiàn)雙后肢明顯癱瘓并累及前肢，精神非常萎靡，進(jìn)食不能的瀕死狀態(tài)，視為神經(jīng)功能缺損癥狀達(dá)到最高峰）處死所有大鼠?？焖偃〕黾顾璨⒎侄?，新鮮頸胸段脊髓（每組8段）放入液氮，每組取4段進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-PCR），另外 4段進(jìn)行Western Blotting。腰段脊髓（每組8段）制作石蠟切片，厚度4μm。每只大鼠從腰髓切片中隨機(jī)選取3張行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，低倍鏡下觀察全視野的病灶數(shù)后取平均數(shù)，即為每只大鼠的病灶數(shù)。炎性病灶判定：超過(guò)20個(gè)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或炎癥細(xì)胞圍繞小血管呈袖套樣改變[9]。

2.5 RT-PCR檢測(cè)頸胸段脊髓VCAM-1mRNA表達(dá) 使用軟件設(shè)計(jì)PCR引物。Rat VCAM-1，基因序列號(hào)NM_012889，上游引物5'-GATGTCATTGCGAGGTCGTTTAGA-3'，下游引物5'-GCATGAAGTTACAACAGTCAGTCCAAG-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度 97bp。Rat 18S（內(nèi)參），基因序列號(hào)M11188，上游引物5'-GAATTCCCAGTAAGTGCGGGTCATA-3'，下游引物5'-CGAGGGCCTCACTAAACCATC-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度105bp。

將分段好的新鮮頸胸段脊髓（每組4段）分別于液氮中研磨，提取總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 1min；40個(gè)循環(huán)：95℃，15sec；63℃，25sec；熔點(diǎn)曲線分析 55～95℃。目的基因的相對(duì)表達(dá)水平用相對(duì)表達(dá)量（2-△Ct×103）表示。

2.6 Western Blot檢測(cè)頸胸段脊髓VCAM-1蛋白的表達(dá) 新鮮頸胸段脊髓（每組4段）分別在液氮中研磨，提取總蛋白并定量，再經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜（100V恒壓下轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜）、封閉（5%脫脂奶粉），加入一抗（兔抗大鼠VCAM-1多克隆抗體，稀釋倍數(shù)1：500）4℃孵育過(guò)夜，加入二抗（山羊抗兔 IgG，稀釋倍數(shù)1:2000）室溫孵育。配置ECL工作液（約1mL），孵育轉(zhuǎn)印膜1min，保鮮膜密封，暗盒中曝光5～10min后顯影和定影。VCAM-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量=VCAM-1蛋白（光密度值）/內(nèi)參（光密度值）×103。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（±s） 表示，采用單因素方差分析。多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較方差齊時(shí)采用LSD法，若方差不齊則采用Tamhane's T2法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)分比較 免疫后第14d有3只大鼠出現(xiàn)瀕死狀態(tài)，視作癥狀達(dá)到高峰期。正常對(duì)照組、模型組、強(qiáng)的松組和山茱萸新苷組神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)分分別為：0分、（3.83±0.98）分、（0.67±0.82）分、（1.67±1.75）分，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.314，P=0.000），山茱萸新苷組與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），與強(qiáng)的松組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.126）。

3.2 各組大鼠腰髓免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及病灶個(gè)數(shù)比較模型組、強(qiáng)的松組、山茱萸新苷組大鼠腰髓均有免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，密集分布在血管周圍。山茱萸新苷組腰髓免疫細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量明顯少于模型組，稍多于強(qiáng)的松組，正常對(duì)照組腰髓極少有免疫細(xì)胞，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。四組大鼠炎性病灶個(gè)數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=40.996，P=0.000），其中山茱萸新苷組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.037），見(jiàn)表1。

圖1 各組大鼠腰髓免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及病灶個(gè)數(shù)

3.3 各組大鼠VCAM-1mRNA表達(dá)比較 四組大鼠頸胸段脊髓內(nèi)VCAM-1mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=137.485，P=0.000），其中山茱萸新苷組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012）。表明山茱萸新苷可在EAE動(dòng)物活體內(nèi)抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中VCAM-1mRNA的表達(dá)。見(jiàn)表1。

3.4 各組大鼠頸胸髓VCAM-1蛋白表達(dá)比較 四組大鼠頸胸段脊髓VCAM-1蛋白表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=54.594，P=0.000），山茱萸新苷組VCAM-1蛋白的表達(dá)明顯少于模型組（P=0.004）；山茱萸新苷組與強(qiáng)的松組VCAM-1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.082）。見(jiàn)表 1、圖2（插頁(yè)）。

圖2 各組大鼠脊髓VCAM-1蛋白表達(dá)比較

4 討 論

MS中醫(yī)辨證以肝腎陰虛為主，滋補(bǔ)肝腎貫穿治療始終[10-11]。山茱萸補(bǔ)肝益腎、澀精固脫，在治療MS中發(fā)揮重要作用[12]。含山茱萸的湯劑及山茱萸環(huán)烯醚帖苷均有緩解MS/EAE癥狀的作用[9，13-14]。山茱萸新苷屬于山茱萸環(huán)烯醚萜苷，本研究證實(shí)在癥狀高峰期，山茱萸新苷組神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于模型組（P<0.01），說(shuō)明山茱萸新苷具有緩解EAE神經(jīng)缺損癥狀作用。

表1 各組大鼠脊髓炎性病灶個(gè)數(shù)、VCAM-1mRNA、VCAM-1蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 各組大鼠脊髓炎性病灶個(gè)數(shù)、VCAM-1mRNA、VCAM-1蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；VCAM-1：血管細(xì)胞黏附分子-1

組別正常對(duì)照組模型組強(qiáng)的松組山茱萸新苷組F值P值鼠數(shù)8888炎性病灶個(gè)數(shù)（個(gè)）08.75±2.23△△2.33±1.03△**4.83±1.47△△*40.9960.000VCAM-1mRNA相對(duì)表達(dá)量5.602±0.76137.762±4.560△△17.143±1.521△△**28.042±3.147△△*137.4850.000VCAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量7.958±2.26522.433±1.829△△15.725±1.338△△**18.625±0.874△△**54.5940.000

MS/EAE主要由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)，髓鞘特異性的CD4+T細(xì)胞輸注入正常小鼠體內(nèi)，可誘導(dǎo)EAE[15]。髓鞘特異性CD4+T細(xì)胞在淋巴器官中發(fā)育成熟后釋放到血液中，隨血液到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，穿過(guò)血腦屏障浸潤(rùn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)并由抗原提呈細(xì)胞激活，通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞接觸、分泌促炎細(xì)胞因子來(lái)活化抗原提呈細(xì)胞，促炎細(xì)胞因子的分泌可以誘發(fā)大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中激活、分泌大量炎癥因子，進(jìn)而導(dǎo)致周圍神經(jīng)組織損害[2]。本研究應(yīng)用HE染色，在EAE大鼠的腰髓切片上，可觀察到大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。山茱萸新苷組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)明顯少于模型組大鼠，說(shuō)明山茱萸新苷可以抑制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)EAE大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

CD4+T細(xì)胞通過(guò)血腦屏障浸潤(rùn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)是致病關(guān)鍵，阻止該過(guò)程可抑制EAE病理過(guò)程。VCAM-1蛋白與配體整合素α4β1結(jié)合，介導(dǎo)白細(xì)胞招募、淋巴細(xì)胞歸巢，在EAE發(fā)病過(guò)程中表達(dá)增多，并在介導(dǎo)T細(xì)胞通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)程中起重要作用[1，3-5]。針對(duì) VCAM-1配體的 α4亞單位的抗體那他珠單抗可減輕MS的癥狀[16]。因此抑制VCAM-1的表達(dá)有望抑制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)而緩解EAE癥狀。本研究證實(shí)，山茱萸新苷可以在EAE大鼠體內(nèi)在mRNA及蛋白水平抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá) VCAM-1（P<0.05，P<0.01）。

本研究顯示，山茱萸新苷可以顯著緩解EAE大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，抑制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，以及抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)VCAM-1。然而，山茱萸新苷抑制VCAM-1表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。研究證實(shí)，激活核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）可以上調(diào) VCAM-1的表達(dá)，抑制 NF-κB的活性可抑制TNF-α誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)[17-18]。既往有研究顯示山茱萸新苷可抑制NF-κB的活性[19]。所以，山茱萸新苷有可能通過(guò)抑制NF-κB的活性，從而抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)VCAM-1，進(jìn)一步抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，緩解EAE癥狀，但仍需實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

［1］ Domingues HS，Mues M，Lassmann H，et al.Functional and pathogenic differences of Th1and Th17cells in experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.PLoS One，2010，5（11）：e15531.

［2］Rostami A，Ciric B.Role of Th17cells in the pathogenesis of CNS inflammatory demyelination［J］.J Neurol Sci，2013，333（1-2）：76-87.

［3］Rossi B，Angiari S，Zenaro E，et al.Vascular inflammation in central nervous system diseases：adhesion receptors controlling leukocyte-endothelial interactions［J］.Journal of Leukocyte Biology，2011，89（4）：539-556.

［4］Wilson EH，Weninger W，Hunter CA.Trafficking of immune cells in the central nervous system［J］.J Clin Invest，2010，120（5）：1368-1379.

［5］Cook-Mills JM，Marchese ME，Abdala-Valencia H.Vascular cell adhesion molecule-1expression and signaling during disease：regulation by reactive oxygen species and antioxidants［J］.Antioxid Redox Signal，2011，15（6）：1607-1638.

［6］Kang DG，Moon KM，Lee AS，et al.Cornuside suppresses cytokine-induced proinflammatory and adhesion molecules in the human umbilical vein endothelial cells［J］.Biol Pharm Bull，2007，30（9）：1798-1799.

［7］尹琳琳，林麗莉，王蕾，等.實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠模型的建立及病理特征［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32（1）：84-89.

［8］Corrêa JO，Aarestrup BJ，Aarestrup FM.Effect of thalidomide and pentoxifylline on experimental autoimmune encephalomyelitis（EAE）［J］.Exp Neurol，2010，226（1）：15-23.

［9］李勇，宋興偉，代允義，等.山茱萸總苷抗實(shí)驗(yàn)性變態(tài)性腦脊髓炎大鼠免疫作用的初步研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（3）：611-613.

［10］樊永平，吳畏.500例多發(fā)性硬化患者中醫(yī)證候研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，37（1）：68-72.

［11］樊永平.多發(fā)性硬化的中醫(yī)藥病證結(jié)合治療［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（5）：289-292.

［12］鄭曉丹，郭鈺琪，張洪海，等.輻射損傷后T細(xì)胞亞群的免疫重建特點(diǎn)及中藥山茱萸的調(diào)節(jié)作用［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2015，31（6）：769-773.

［13］ Yin L，Chen Y，Qu Z，et al.Involvement of JAK/STAT signaling in the effect of cornel iridoid glycoside on experimental autoimmune encephalomyelitis amelioration in rats［J］.J Neuroimmunol，2014，274（1-2）：28-37.

［14］樊永平，宋麗君，龔海洋，等.左歸丸和右歸丸對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)IFN-γ、MMP-9免疫組化表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（11）：1446-1450.

［15］ Stromnes IM，Goverman JM.Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis［J］.Nat Protoc，2006，1（4）：1952-1960.

［16］Schwab N，Schneider-Hohendorf T，Wiendl H.Therapeutic uses of anti-α4-integrin（anti-VLA-4）antibodies in multiple sclerosis［J］.Int Immunol，2015，27（1）：47-53.

［17］ Gao JJ，Hu YW，Wang YC，et al.ApoM suppresses TNF-α-induced expression of ICAM-1and VCAM-1through inhibiting the activity of NF-κB［J］.DNA Cell Biol，2015，34（8）：550-556.

［18］ Zhu YP，Shen T，Lin YJ，et al.Astragalus polysaccharides suppress ICAM-1and VCAM-1expression in TNF-αtreated human vascular endothelial cells by blocking NF-κB activation［J］.Acta Pharmacol Sin，2013，34（8）：1036-1042.

［19］Choi YH，Jin GY，Li GZ，et al.Cornuside suppresses lipopolysaccharide-induced inflammatory mediators by inhibiting nuclear factor-kappa B activation in RAW264.7macrophages［J］.Biol Pharm Bull，2011，34（7）：959-966.