線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈梗死模型的體會(huì)與造模失敗原因分析

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大鼠因其成本低、腦內(nèi)血管解剖特性與人類相似等諸多特點(diǎn)，至今仍是研究腦缺血疾病最常用的動(dòng)物。制作動(dòng)物腦梗死模型的方法有很多種，其中大腦中動(dòng)脈梗死(MCAO)線栓法模型因不開顱、易于操作而被廣泛應(yīng)用。大鼠MCAO模型是目前公認(rèn)的研究腦梗死、腦缺血的經(jīng)典模型，為研究腦缺血再灌注的機(jī)制及評(píng)估其治療方案的療效提供了可靠驗(yàn)證平臺(tái)[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，短暫性腦缺血對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用，可抵御其后發(fā)生的嚴(yán)重腦缺血，減輕缺血組織的病變程度，即誘發(fā)了腦缺血耐受(IT)[2]。腦缺血耐受是指給予短暫的亞致死性缺血后誘導(dǎo)的腦內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，從而對(duì)后續(xù)長時(shí)間缺血損傷產(chǎn)生耐受及自身保護(hù)作用。建立腦缺血耐受的模型為進(jìn)一步研究腦缺血對(duì)腦梗死神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制有重要意義。本研究旨在闡述在造模過程中的心得體會(huì)，并對(duì)造模過程中可能導(dǎo)致造模失敗的原因進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與器材 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)成年雄性SD大鼠60只，體重250 g～280 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)器材：動(dòng)脈夾，常規(guī)手術(shù)器械，顯微手術(shù)器械，碘伏，75%乙醇，眼科剪，生理鹽水，標(biāo)志筆，3號(hào)、5號(hào)外科縫合絲線，10%水合氯醛，線身直徑0.26 mm，線頭直徑(0.36±0.02)mm，線長40 mm，頭端包被有多聚賴氨酸栓線(購自北京西濃科技有限公司，型號(hào)2636-100，A4級(jí)別)。

1.2 MCAO模型制作 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d～3 d。采用線栓法經(jīng)左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈插入栓線制作大鼠MCAO模型。以10%水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔給藥麻醉后，固定于鼠板上，消毒頸前皮膚，參照文獻(xiàn)方法制作大鼠MCAO模型：備皮后沿頸部正中偏左側(cè)做切口，分離皮膚與淺筋膜，逐步暴露頸動(dòng)脈鞘，鈍性分離頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)及頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)，結(jié)扎 ECA 及 CCA 近心端，在兩個(gè)結(jié)扎端之間的CCA剪一小口，將栓線經(jīng)CCA插向ICA，調(diào)整栓線走向，直至將栓線插入至規(guī)定部位。術(shù)后傷口消毒、皮膚縫合。

1.3 觀察指標(biāo) 神經(jīng)功能缺損評(píng)分：造模后2 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，采用Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]，0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀，可正?；顒?dòng)；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈追尾；3分：行走時(shí)身體向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自主行走，意識(shí)喪失。0分和4分者剔除，1分～3分為造模成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 造模時(shí)死亡15只，造模失敗10只，造模成功35只(12 h內(nèi)死亡4只、24 h后死亡5只，3 d后死亡4只，5 d時(shí)死亡4只)。

2 體 會(huì)

2.1 關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇 選用何種品系大鼠制作模型，取決于研究者的實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)。目前經(jīng)典的動(dòng)物是 Wistar 大鼠和 SD 大鼠。雌激素能擴(kuò)張血管，增加腦血流量，減輕腦實(shí)質(zhì)損傷，具有明顯的神經(jīng)元保護(hù)作用[4]，可降低大鼠腦梗死的發(fā)生率和死亡率，因此，最好選擇雄性大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，且以 250 g～280 g的雄性大鼠最佳。避免選用老齡大鼠，老齡大鼠腦動(dòng)脈扭曲或管腔狹窄使線栓難以推進(jìn)，且其抵抗力、耐受性均較差，選用壯年大鼠制備模型，成功率較高。

2.2 關(guān)于麻醉劑的選擇 國外研究者制備MCAO模型采用步驟繁瑣且價(jià)格昂貴的氟烷誘導(dǎo)麻醉。國內(nèi)學(xué)者多用2%戊巴比妥鈉(0.10 mL/100 g)或10%水合氯醛(0.30 mL/100 g)進(jìn)行腹腔麻醉。對(duì)體重相同的大鼠進(jìn)行麻醉，戊巴比妥鈉所用劑量較水合氯醛小，其麻醉劑量與致死量接近，易引起大鼠死亡；另外戊巴比妥鈉可使腦內(nèi)溫度下降明顯[3]，能夠減輕腦組織損傷，影響造模效果。故而選用10%水合氯醛作麻醉劑，其給藥濃度應(yīng)控制在0.40 mL/100 g，濃度過高，容易麻醉過深，產(chǎn)生呼吸抑制，甚至死亡。

2.3 關(guān)于造模時(shí)手術(shù)操作 目前絕大多數(shù)研究者采用大鼠頸前正中切口。本實(shí)驗(yàn)采用頸部外側(cè)切口[5]，方便鈍性分離肌肉，較好暴露手術(shù)視野，分離血管，同時(shí)避免對(duì)氣管造成機(jī)械刺激，減少對(duì)迷走神經(jīng)的刺激。結(jié)扎血管、動(dòng)脈夾夾閉 ICA 時(shí)，需遠(yuǎn)離頸動(dòng)脈竇及迷走神經(jīng)節(jié)，防止大鼠猝死。在結(jié)扎準(zhǔn)備完畢之后再用血管夾夾閉 ICA，縮短刺激血管及迷走神經(jīng)的時(shí)間。插線時(shí)保留適當(dāng)長度線頭在血管外，用于充當(dāng)牽引線，保證線栓進(jìn)入血管后成功向顱內(nèi)推進(jìn)，操作中適當(dāng)調(diào)整血管及線栓進(jìn)入角度，可提高插入成功率。

2.4 關(guān)于線栓選擇及插入深度 線栓制備方法直接關(guān)系到模型制備成功率。Longa等是將線栓頭端融成球形[6]，Koizumi等是在線栓頭端涂以硅樹脂，而Belayev等則是先加熱使線栓頭端變鈍，然后涂以多聚賴氨酸溶液。國內(nèi)研究者的處理方法也都不盡相同[7]。本實(shí)驗(yàn)選用頭端包被有多聚賴氨酸栓線，以提高模型的穩(wěn)定性。體重與MCA的粗細(xì)在一定范圍內(nèi)存在正相關(guān)性，但大鼠體重超過400 g時(shí)，這種相關(guān)性明顯降低[8]。栓線過粗，易插破ICA或難以入顱；栓線過細(xì)，插入血管內(nèi)留有間隙不能完全阻塞血管，達(dá)不到梗死效果[9]。直徑大于0.3 mm的線栓在進(jìn)入 ICA 和經(jīng) ICA入顱時(shí)易插破血管導(dǎo)致出血，導(dǎo)致造模失敗或動(dòng)物死亡。而直徑為 0.28 mm時(shí)，模型制作成功率高、重復(fù)性好、對(duì)動(dòng)物血管影響較小。因此對(duì)于體重 250 g～280 g 的大鼠，線栓的最佳直徑為 0.25 mm～0.28 mm。當(dāng)栓線插入深度為1.0 cm～1.5 cm時(shí)，大鼠未出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損；栓線插入深度為1.8 cm～2.2 cm時(shí)，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，而插入深度超過2.2 cm時(shí)，大鼠極易昏迷不醒，造模后24 h內(nèi)死亡率高達(dá)37.33%。故而建議線栓插入深度以2.0 cm左右為最佳。

3 造模失敗原因分析

3.1 術(shù)中出血過多 造模過程中出血過多：包括分離頸部血管時(shí)出血、血管破裂出血、血管夾閉不全出血、線栓頭脫落出血、反復(fù)多次插入線栓出血等?？赡茉颍孩賹?shí)驗(yàn)造模時(shí)用眼科剪在 CCA剪開一斜形開口，在插入魚線時(shí)被剪開部分容易被拽斷，同時(shí)血管原有的生理形態(tài)扭曲改變，難以將線栓送入顱內(nèi)，即便勉強(qiáng)將線栓送入，也因血管斷開、出血過多，不能保證線栓插入的深度，導(dǎo)致造模成功率下降，死亡率增高。②不熟悉大鼠解剖結(jié)構(gòu)，造模時(shí)間較長，線栓插入不順，反復(fù)推送不能進(jìn)入規(guī)定位置，使得血管塌陷，難以區(qū)分頸動(dòng)脈鞘及血管，線栓多次刺激血管壁，甚至刺穿血管壁，致使造模過程中出血量增多，引起大鼠死亡。

3.2 術(shù)前及術(shù)中、術(shù)后可能存在的原因 ①造模前24 h未予禁食，大鼠體內(nèi)過高的血糖水平可能增加術(shù)后腦梗死面積[10]；進(jìn)食影響體重使得水合氯醛給藥總量過多造成死亡。②水合氯醛配制時(shí)間太久，沒有進(jìn)行避光保存，使得給藥劑量偏差加大。水合氯醛不穩(wěn)定，久置、光照、高溫等條件均可促進(jìn)其分解，用其進(jìn)行腹腔麻醉，需現(xiàn)配現(xiàn)用，否則給藥劑量過大引起大鼠麻醉過深，呼吸道分泌物增多，若合并分離血管時(shí)損傷迷走神經(jīng)，則更易導(dǎo)致大鼠窒息死亡，所以術(shù)中必須精確麻醉，小心操作。③動(dòng)物蘇醒后出現(xiàn)狀態(tài)不佳，不欲進(jìn)食、進(jìn)水、甚至出現(xiàn)腹瀉、精神萎靡等癥狀，造模后24 h內(nèi)死亡率極高，原因可能是水合氯醛麻醉過量，對(duì)胃腸道造成一定影響，加之腹瀉脫水、術(shù)中失血過多，導(dǎo)致低血容量休克死亡。④腹腔麻醉時(shí)麻醉藥注射入腸腔造成麻醉不足及術(shù)后腸梗阻。腹腔注射時(shí)注意將針頭向外回抽。⑤造模、麻醉期間、造模后沒有注意保溫，導(dǎo)致低體溫及亞低溫?fù)p傷增加了大鼠死亡率[11]。⑥手術(shù)時(shí)間過長，手術(shù)部位大量體液不顯性揮發(fā)、術(shù)中失血，術(shù)后未予以及時(shí)補(bǔ)液，導(dǎo)致體液丟失嚴(yán)重，影響造模成功。⑦手術(shù)過程中沒有嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，術(shù)前、術(shù)后預(yù)防感染不及時(shí)。應(yīng)在術(shù)后手術(shù)縫合部位撒少量青霉素粉劑，也可術(shù)前予以腹腔注射青霉素G 20×104U～30×104U(溶于1 mL～2 mL生理鹽水中)預(yù)防感染。

3.3 其他可能原因 ①術(shù)中血栓形成：線栓插入損傷血管內(nèi)皮，可能導(dǎo)致血栓形成，堵塞重要血管，阻礙線栓插入，栓線方向應(yīng)盡量與血管走行方向保持一致；②線栓頭端不平整光滑、插線用力過猛或反復(fù)多次調(diào)整栓線角度，使得線栓進(jìn)入蛛網(wǎng)膜，形成蛛網(wǎng)膜下隙出血；③造模時(shí)間過長，使得線栓在阻斷MCA時(shí)，同時(shí)影響下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞循環(huán)，導(dǎo)致腦缺血后高溫，影響造模結(jié)果的可靠性。

4 結(jié) 語

MCAO模型是研究腦梗死疾病的基礎(chǔ)[1，12]，雖然其造模方法仍在不斷的改進(jìn)，但線栓法制備MCAO模型以其可重復(fù)性強(qiáng)、造模成功率高等優(yōu)點(diǎn)，仍為多數(shù)研究者首選的經(jīng)典造模方法。線栓法制備MCAO模型的環(huán)節(jié)眾多，故而影響造模成功的因素頗多，每一步都應(yīng)重視。造模前需考慮存在的各種干擾因素，積極尋找應(yīng)對(duì)措施，提高造模成功率，盡可能制備出最大程度接近于人類腦梗死的MCAO模型，為研究人類腦梗死的發(fā)病機(jī)制和驗(yàn)證臨床治療手段發(fā)揮更大的作用?？傊谥苽浯笫驧CAO模型過程中，處理好實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇，線栓的制備，線栓插入深度和插入方法，麻醉劑的選擇，手術(shù)操作手法，術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后合理干預(yù)等步驟，保證并提高模型的成功率，使實(shí)驗(yàn)差異性進(jìn)一步減小。另外，線栓法制備MCAO模型還存在許多不足，需不斷改進(jìn)完善，實(shí)驗(yàn)中可以不斷地解決問題、摸索創(chuàng)新，確保模型的成功。

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