磷脂酶Cγ?2對B細胞的作用及臨床應用

張亞玲，牛卓婭，王世偉，賈 乾，姚智燕，劉 偉

（1河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，2河北省人民醫(yī)院體檢中心化驗室，河北石家莊050051；3河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學教研室，河北省重大疾病的免疫機制及干預重點實驗室，河北石家莊050017）

0 引言

B淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對體液免疫和細胞免疫都有著重要的作用。B淋巴細胞來源于骨髓的多能干細胞，其分化過程可以分為抗原非依賴期和抗原依賴期兩個階段，抗原非依賴期包括前B細胞、不成熟B細胞的分化過程，抗原依賴期是成熟B細胞發(fā)育成活化B細胞，繼而分化成分泌抗體的漿細胞的過程。每個過程中，細胞膜表面都存在其特有的標志，主要是由免疫球蛋白基因編碼和重排的蛋白分子，稱為B細胞表面抗原受體（B cell receptor，BCR），其主要功能在于特異性識別和結合抗原，與免疫細胞和免疫分子相互作用。BCR的信號轉導對B細胞的發(fā)育和生存有著重大意義，其中磷脂酶Cγ?2是前B細胞受體（pre?BCR）和BCR信號轉導途徑的一個重要分子，所以磷脂酶Cγ?2在B淋巴細胞的形成和維持中有著重要作用［1］。

近年來，腫瘤和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫病的發(fā)病率逐年增高。研究［2］表明，B細胞連接蛋白被磷酸酸化后，使PLCγ?2活化，影響B(tài)CR介導的信號通路，改變BCR的特異性，使免疫因子和面對不同抗原的抗體持續(xù)產生，從而維持自身免疫。B淋巴細胞的受體編輯主要意義在于使自身反應性B細胞不對自身抗原產生免疫應答，使其得以存活。如果受體編輯異常，會使自身耐受得到破壞，自身反應性B細胞不斷被清除，是自身免疫性疾病產生的機制之一。此外，Chen 等［3］的研究發(fā)現(xiàn)，PLCγ?2 對于腫瘤細胞的凋亡也具有重要的影響。

1 B淋巴細胞與受體編輯

B細胞的第一階段是前B細胞，這一階段的前BCR僅僅是由Ig重鏈基因重排所表達。隨著重鏈基因的重排成功，B淋巴細胞進入第二階段，即未成熟B細胞，輕鏈在此時也開始進行重排，U蛋白隨之表達，從而使膜表面有了完整的IgM分子，并可以和抗原結合。隨后，未成熟B細胞從骨髓中流出進入脾臟及其周圍免疫器官繼續(xù)發(fā)育，先形成膜表面免疫分子為CD21的過渡型T1和CD21CD23CD44－IgD＋的過渡性T2細胞，最后成為成熟B細胞［4］。在此過程中，部分未成熟B細胞會遇到存在于骨髓微環(huán)境的自身抗原識別并與其結合，使這些膜表面存在自身抗原受體的未成熟B細胞受到負向調控，從而被巨噬細胞迅速吞噬降解而無法運出骨髓外，使其克隆丟失，不能發(fā)育成熟。

除此之外，一些未成熟B細胞還可以通過Ig輕鏈基因的重排使產生新的特異性受體，從而使這些自身反應性B細胞在體內存活下來，B細胞的這個陽性選擇的過程叫做受體編輯。

2 PLCγ?2與B淋巴細胞

2.1 PLC?γ的分類與作用 磷脂酶是一類可以水解磷脂的酶類，是存在于胞漿膜上的一個關鍵酶，起著介導細胞信號傳導通路的作用。目前發(fā)現(xiàn)在哺乳動物體內大約存在12種PLC的同工酶，包括β、γ、δ、ε和最新發(fā)現(xiàn)的ζ 5個家族，其中磷脂酶C?γ有磷脂酶Cγ?1（PLCγ?1）和磷脂酶 Cγ?2（PLCγ?2）兩種。

PLCγ?1存在于體內多種組織中，主要是起到了調節(jié)細胞的作用，PLC?γ?2主要存在于造血系統(tǒng)、T細胞、巨噬細胞等免疫細胞中，影響B(tài)CR介導的信號傳導，同時在B細胞的分化成熟中有重要作用［5］。

2.2 PLCγ?2對 B 細胞的調節(jié)作用 PLCγ?2 的活化主要是通過蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）的途徑?；罨腜LCγ?2可以水解細胞膜表面的磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol diphosphate 2，PIP2）生成第二信使三磷酸肌醇（inositol triphos?phate， IP3）和二酰甘油（diacylglycerol， DAG）［6］。 在Sherwood等［7］的研究中發(fā)現(xiàn)，IP3是一種鈣離子調節(jié)信號，可與內質網(wǎng)上的IP3受體結合，從而促進鈣離子的釋放，調節(jié)細胞內鈣離子的通路。DAG可以激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），產生一系列生化反應，對細胞進行生長調節(jié)，促使B細胞的成熟和分化。因此磷脂酶Cγ?2是B細胞生長發(fā)育信號通路上的重要調節(jié)分子。

BCR是由重鏈（heave chain，H）和輕鏈（light chain，L）組成，其中編碼L鏈的基因是κ和λ座位的基因，通過野生型和PLCγ?2缺失型小鼠的實驗研究表明，PLCγ?2缺失會引起Igλ和Igκ基因第二次重排的損傷，此外，還發(fā)現(xiàn)PLCγ?2缺失損傷了BCR誘導的RAG的表達，而RAG是Ig基因重排過程中所需要的酶。

最近研究［8］發(fā)現(xiàn)，缺乏 PLCγ?2 的小鼠、骨髓和脾臟中B細胞的輕鏈表達均減少，其原因是PLCγ?2的缺陷不能激活調節(jié)輕鏈的基因，同樣前B細胞輕鏈的重排也會受到影響。從而使表達前B細胞受體（pre?BCR）基因的二次重排（即受體編輯）受到影響，自身反應性B細胞的BCR不能發(fā)生特異性的改變，使與自身抗原結合的自身反應性B細胞被巨噬細胞吞噬。

3 PLCγ?2與臨床常見疾病及其靶向治療

磷脂酶Cγ?2是B淋巴細胞分化發(fā)育信號傳導中的關鍵分子，尤其在前BCR和BCR形成過程中起著重要的信號傳導作用，而且其靶向幾種促增殖因子，如核因子 κB（NFκB），Ras 和 Akt，此外，PLCγ?2還涉及B細胞表面受體的耦合［9］。

研究［10］發(fā)現(xiàn)，在SLE等自身免疫性疾病患者的T、B細胞、漿細胞和其他免疫細胞中，酪氨酸激酶活性異常。在對BCR的反應中，Src和Syk相關激酶能夠調節(jié)部分重疊蛋白的酪氨酸磷酸化，而PLC?γ2是形成Src的特定底物。信號通路異常在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，倘若可以從抑制PLCγ?2活性入手，靶向治療可能將成為治愈相關疾病患者的一個重要的突破口。

3.1 PLCγ?2 與 SLE 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種慢性自身免疫性疾病，以產生多種自身抗體、免疫復合物、多器官免疫性炎癥為特征，外周血單個核細胞凋亡增加，但凋亡小體清除障礙。SLE患者中T、B細胞異?；罨瘜е录毎蜃印⒆陨砜贵w持續(xù)產生，這對自身免疫反應的啟動及維持至關重要［11］。

當B細胞連接蛋白（如SLP?65、BASH）被Syk磷酸化后，可激活Bruton酪氨酸激酶（Btk）、活化PLCγ?2進行信號傳導。Kitaura等［12］研究發(fā)現(xiàn)SLE中Syk的酪氨酸磷酸化及 PLCγ?2表達增強。 PLCγ?2表達增強與皮膚損害具有相關性，這是因為PLCγ?2的活化在Fc?γ受體介導的皮膚免疫反應中起到了不可缺少的作用。

目前已有十多種信號轉導抑制藥用于臨床治療SLE，多為酪氨酸酶抑制劑，從而抑制了PLCγ?2的活化，影響了BCR的二次重排，例如Syk抑制藥R406、R788，在動物實驗中狼瘡鼠蛋白尿的發(fā)生時間延長，減少了腎損傷，避免了皮膚損害，有確定的治療作用；表皮生長因子（epidermal growth factor）抑制藥甲磺酸伊馬替尼同樣可以使狼瘡鼠腎蛋白尿延期出現(xiàn)，生存期延長［13］，但是酪氨酸激酶抑制藥在 SLE治療中仍存在局限性，如用藥后嚴重副作用，治療不穩(wěn)定性等。

3.2 PLCγ?2 與 DLBCL Huynh 等［9］發(fā)現(xiàn) PLCγ?2在63%的彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma， DLBCL）病例中表達上調，而且 PLCγ?2 的高表達與更高的總生存率相關。因此，抑制PLCγ2可能是淋巴瘤治療的新靶點。

目前研究［14］發(fā)現(xiàn)PLC抑制劑U73122可以抑制PMA誘導的人類促細胞U937細胞分化成巨噬細胞，誘導凋亡和G0/G1細胞周期停滯，加入enzastaurin或Src抑制劑pp2共同治療與單獨使用U73122相比，對細胞增殖具有調節(jié)作用［12］。

3.3 PLCγ?2與慢性淋巴細胞性白血病 慢性淋巴細胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL）是一種淋巴細胞克隆性增殖的腫瘤性疾病，其特征在于微環(huán)境依賴性B細胞受體組成了通路的活化［9，12］。新型靶向治療消除BCR整合激酶已經顯示出了明顯的臨床效果［15］。

Ibrutinib是一種BCR靶向治療藥物（在一線設置中可能用于年輕患者［16］），其在半胱氨酸481處共價結合Bruton丙種球蛋白血癥酪氨酸激酶（Bruton's tyrosine kinase，BTK），防止了其SH3結構域的LYN和SYK定向自動磷酸化，從而防止PLCγ?2的下游激活，進而阻止下游BCR信號。然而，由于BTK和/或PLCγ?2 的突變可能會導致 Ibrutinib 的耐藥性［17］，在少數(shù)情況下BTK及其直接下游PLCγ?2獲得性突變導致Ibrutinib受阻［18］。BTK中的 C481S突變阻礙Ibrutinib共價結合，從而抑制該藥物發(fā)揮作用［19］。鑒于傳統(tǒng)PLCγ?2的激活需要BTK14的合作，潛在的分子機制可使突變的PLCγ?2繞過BTK抑制來治療對抗Ibrutinib耐藥性。

根據(jù)實驗［20］發(fā)現(xiàn) PLCγ?2的 R665W 突變體對SYK和LYN的功能依賴性與突變型PLCγ?2配合形成BTK旁路途徑，這一發(fā)現(xiàn)提供了Ibrutinib耐藥性的潛在機制，并確定針對這種突變的替代療法。研究結果［21］表明，復發(fā)患者中存在PLCγ?2R665W的錯義點突變，過表達PLCγ?2R665W突變使BCR擴增下游信號傳導的能力增強，超表達PLCγ?2不再需要BCR信號通路中的BTK，藥物靶向SYK和LYN可以消除超型PLCγ?2，SYK和LYN靶向治療可防止Ibrutinib產生耐藥性，從而阻斷BCR信號傳導。

3.4 PLCγ?2 與其他腫瘤 有研究［22］發(fā)現(xiàn)， PLCγ?2在喉癌組織中的表達較癌旁組織中的表達明顯增高，兩者間差別有統(tǒng)計學意義（P≤0.05），即 PLCγ?2 在喉癌組織中高表達，且與喉癌的臨床分期、病理分級和淋巴轉移關系親密，與年齡有關。腫瘤的臨床侵占規(guī)模越廣，伴隨淋巴轉移，PLCγ?2表達越高?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)癌細胞功能可被PLCγ?2調節(jié)，如PLC抑制鱗狀細胞癌腫瘤起始細胞的增殖和存活［23］，PLCγ?2在 TPA誘導胃癌細胞凋亡等，這也表明它代表了抗癌藥物開發(fā)的重要治療靶標。

目前中藥在治療腫瘤方面正發(fā)揮積極的作用［24］，例如：黃連，黃連中主要活性成分為黃連素（berberine，BBR）。研究證實，黃連素對肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）具有抑制作用，其機制與誘導細胞凋亡有關。Western Blot實驗證實，BBR可以抑制PLC?γ的表達，提示黃連素可能通過抑制PLC?γ的磷酸化過程，抑制信號通路的傳導以阻止肝癌細胞的侵襲。

4 小結與展望

B淋巴細胞組群是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，B細胞在發(fā)育過程中通過Ig重鏈和輕鏈基因的二次重排改變了B淋巴細胞膜上表面受體的特異性，從而豐富了整個B細胞庫。同樣那些存在于胞漿膜上重要的通路調節(jié)分子的正常運作也非常重要，磷脂酶Cγ?2作為這些調節(jié)分子的一個重要組成部分，同時也影響B(tài)細胞的受體編輯。如果能正確利用這一點進行靶向治療，有效控制B細胞群的受體編輯，并結合臨床實際情況，那么對于治療由于基因錯誤的重排所導致的各種疾病，如腫瘤、免疫缺陷病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫病將具有重大意義。

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