胃癌患者腫瘤組織與外周血T細(xì)胞受體CDR3的差異分析

朱 瑩，丁順凱，林烈文，劉 松，林小聰，鐘克力，戴 勇，潘 凱

（暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院：1臨床醫(yī)學(xué)研究中心，2胃腸外科，廣東深圳518020）

0 引言

胃癌（gastric cancer，GC）是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，由于早期癥狀多缺乏特異性，早期病例僅占胃癌手術(shù)病例的10%～20%，大約三分之二的患者在確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期或已出現(xiàn)淋巴結(jié)、血行轉(zhuǎn)移，其五年生存率僅為20%～30%［1－2］。 胃癌的發(fā)病、進(jìn)展及侵襲機(jī)制涉及多種免疫、遺傳、分子機(jī)制及細(xì)胞生物等因素，研究胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制，尋找新的生物學(xué)靶標(biāo)對(duì)胃癌的診斷、治療、預(yù)后及開(kāi)展個(gè)體化治療等都具有重要意義。

免疫組庫(kù)（immune repertoire，IR）是指在任何指定時(shí)間，某個(gè)個(gè)體的循環(huán)系統(tǒng)中所有功能多樣性B細(xì)胞或者T細(xì)胞的多態(tài)性總和。研究［3－4］表明，腫瘤患者局部或者全身處于免疫抑制或者免疫缺陷狀態(tài)，是腫瘤發(fā)揮免疫逃逸的關(guān)鍵因素之一。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumour?infiltrating lymphocytes， TIL） 作為機(jī)體局部免疫狀態(tài)的標(biāo)志，在腫瘤免疫中起著重要的作用，TIL與腫瘤預(yù)后的關(guān)系在多種腫瘤中都已經(jīng)得到證實(shí)［5－6］。早期的研究技術(shù)可以鑒別 TIL中T細(xì)胞類型，在群體水平闡明效應(yīng)、輔助及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與臨床結(jié)果的關(guān)系。但只有極少量的數(shù)據(jù)研究了TIL種群在空間上是否局限于腫瘤微環(huán)境，并區(qū)分于循環(huán)T細(xì)胞庫(kù)。近年來(lái)，采用高通量測(cè)序技術(shù)研究個(gè)體免疫細(xì)胞的多態(tài)性已成為腫瘤免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)［7－9］。借助于免疫組庫(kù)高通量測(cè)序技術(shù)，直接對(duì)腫瘤組織中所有的 T細(xì)胞抗原受體（T?cell receptor，TCR）基因進(jìn)行深度序列測(cè)定，可以了解腫瘤內(nèi)TCR的克隆性變化，從整體上研究 TIL 的特性［10－13］。

本研究采用二代測(cè)序技術(shù)，采集胃癌患者的腫瘤組織、癌旁組織及外周血，提取DNA，經(jīng)多重PCR，對(duì)TCR β鏈的CDR3區(qū)進(jìn)行建庫(kù)，采用 Illumina HiSeq 2000系統(tǒng)測(cè)序，分析比較胃癌患者不同類型組織TCR CDR3組庫(kù)的組成特征。

1 材料和方法

1.1 一般資料 原發(fā)性胃腺癌病例來(lái)源于深圳市人民醫(yī)院，收集胃癌患者經(jīng)手術(shù)切除的腫瘤組織及癌旁組織，胃癌診斷經(jīng)由組織病理學(xué)檢查確認(rèn)，同時(shí)在術(shù)前采集患者外周血。7例胃癌病例中，4例男性，3例女性，年齡 26～85 歲，平均年齡（62.4±21.9）歲。

1.2 DNA提取及PCR建庫(kù) 血液及組織DNA提取采用Qiagen DNA提取試劑盒，使用Qubit fluorome?ter測(cè)定DNA濃度。取500 ng基因組DNA作為模板，采用特異的V區(qū)引物和J區(qū)引物，用QIAGEN Multiplex PCR Kit進(jìn)行多重PCR。電泳檢測(cè)并使用QIAquick Gel Extraction kit膠回收100～190 bp的多重PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物中加入End Repair Mix，進(jìn)行末端修復(fù)反應(yīng)，并用QIAquick PCR Purification Kit進(jìn)行純化。經(jīng)過(guò)末端修復(fù)后的DNA片段在其3'端連上“A”堿基，再用 Adapter oligo mix和 DNA ligase進(jìn)行接頭連接，在DNA片斷上接上接頭（adapter）。通過(guò)PCR反應(yīng)富集經(jīng)過(guò)接頭修飾的DNA片段，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收（QIAquick Gel Extraction kit）目的片段，完成文庫(kù)構(gòu)建。

1.3 文庫(kù)檢測(cè)及測(cè)序 使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent DNA 1000 Reagents）檢測(cè)文庫(kù)的插入片段范圍；并使用 ABI StepOnePlus Real?Time PCR System（TaqMan Probe）對(duì)文庫(kù)進(jìn)行濃度的定量。

將檢測(cè)合格的文庫(kù)加入NaOH變性成單鏈，并稀釋，加入到FlowCell內(nèi)，與FlowCell上的接頭雜交，然后在簇生成平臺(tái)cBot上完成橋式PCR擴(kuò)增。最后將制備好的FlowCell采用Illumina HiSeq 2000測(cè)序系統(tǒng)測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析 原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)過(guò)濾、拼接得到合并序列，用miTCR軟件自動(dòng)校正序列錯(cuò)誤。比對(duì)完成后，統(tǒng)計(jì)TCRβ鏈CDR3克隆的表達(dá)及插入缺失情況，并統(tǒng)計(jì)CDR3序列的長(zhǎng)度分布。

根據(jù)比對(duì)分析得到的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)每一個(gè)克隆的表達(dá)情況，分別統(tǒng)計(jì)DNA序列、氨基酸序列、V?J組合的表達(dá)情況。采用方差分析評(píng)價(jià)三組樣品的VJ基因取用及氨基酸取用差異。同時(shí)統(tǒng)計(jì)每一個(gè)樣品中每個(gè)克隆的表達(dá)情況，進(jìn)行樣品多樣性差異分析和克隆表達(dá)差異分析。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)匯總 統(tǒng)計(jì)腫瘤組織（TIL組）、癌旁組織（adjacent normal tissues， ADJ）、外周血（periph?eral blood mononuclear cell，PBMC）三組標(biāo)本的測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)出情況，其中，ADJ獲得的克隆數(shù)為（41 188±29 417）、PBMC 組的克隆數(shù)為（32 184±16 054），TIL 組則為（36 038±18 999）?？梢钥闯?，癌旁組樣品的平均克隆類型最高，其次是腫瘤組，最少的是外周血（無(wú)顯著差異）。

2.2 VJ基因取用差異分析 通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析在每個(gè)分組里面有不少于3個(gè)樣品有表達(dá)的VJ基因，采用方差分析（Aov）比較了 TIL、ADJ、PBMC三組的 VJ基因取用差異，得到了23種具有顯著差異（P＜0.05）的VJ基因（表 1）。

2.3 CDR3的氨基酸（aa）差異分析 根據(jù)測(cè)序得到的CDR3區(qū)氨基酸序列，將每個(gè)樣品的總克隆型（total clonotype）均一到1M總量，此外，至少有一個(gè)分組里面有3個(gè)樣品有表達(dá)的克隆型才會(huì)用于檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)得到TIL、ADJ、PBMC3組標(biāo)本的CDR3的氨基酸差異取用情況。其中41種氨基酸序列具有顯著差異（P＜0.05，表 2）。

表1 三組樣品間23種差異取用的VJ基因

2.4 組間差異及高表達(dá)克?。╤yper express clono?type，HEC）分析 每個(gè)樣品中表達(dá)比例高于1%的克隆型被認(rèn)為是超高表達(dá)的克隆，用方差分析及成對(duì)T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析三組樣品的總克隆型（total clono?type）、單一克隆型（uniq clonotype）、高表達(dá)克隆、D50等數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，除了外周血與腫瘤組織的香儂多態(tài)性差異顯著（P＝0.029）之外，三組之間的統(tǒng)計(jì)值無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明胃癌患者不同組織間的TCR克隆多態(tài)性及分布頻率差異不明顯。

2.5 組間共有克?。╯hared clonotype）分析 將每個(gè)樣品的克隆型總表達(dá)量歸一到1 M，其中平均表達(dá)量不小于1的克隆型視為高質(zhì)量的克隆型，統(tǒng)計(jì)分析三組樣品中共有的總克隆型（圖1）及高質(zhì)量克隆型（圖2）。圖1可見(jiàn)，ADJ的總克隆型種類數(shù)最高，TIL其次。與圖1比較，圖2中顯示癌旁組的高質(zhì)量的克隆型并未明顯增多，表明癌旁組克隆型多數(shù)為低表達(dá)，此外，在組間共有的高質(zhì)量克隆型種類上，癌旁組織與腫瘤組織（12 842）明顯多于癌旁組織與外周血（1211）及腫瘤組織與外周血（1925）。

表2 三組樣品間41種差異取用的氨基酸序列

圖1 TIL、ADJ、PBMC中共有的總克隆型分布

圖2 TIL、ADJ、PBMC中共有的高質(zhì)量克隆型分布

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其分子機(jī)制的研究及靶向藥物的開(kāi)發(fā)對(duì)于早期診斷、治療及預(yù)后具有重要意義。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞作為重要的抗腫瘤免疫細(xì)胞，能夠直接反映腫瘤微環(huán)境中的免疫狀態(tài)，并與腫瘤預(yù)后相關(guān)［5－6］。 其中，T淋巴細(xì)胞是參與特異性免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞，其細(xì)胞表面的抗原受體是由2條多肽鏈αβ或γδ通過(guò)二硫鍵連接而成的異二聚體，其中αβ T細(xì)胞占絕大多數(shù)。在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，TCR β鏈的V、D、J基因片段發(fā)生重排，形成具有高度多樣性的可變區(qū)——互補(bǔ)決定區(qū)3（complementarity?determining region， CDR3），其序列決定了一個(gè)獨(dú)特的TCR克隆型，因此可通過(guò)檢驗(yàn)CDR3的長(zhǎng)度或序列來(lái)判斷T細(xì)胞的克隆性。

Luo等［14］分析了不同分化程度的胃腸道腫瘤患者外周血中CD4＋/CD8＋T細(xì)胞亞群的CDR3譜型，發(fā)現(xiàn)復(fù)雜性積分（the complexity scores，反映TCR庫(kù)的多樣性）與腫瘤組織分化程度顯著相關(guān)。此外，研究［15］證實(shí)預(yù)后較差的胃癌患者外周血中往往能發(fā)現(xiàn)特異性的T細(xì)胞沒(méi)有被充分的誘導(dǎo)或者作用被抑制。近年來(lái)，采用高通量測(cè)序技術(shù)直接針對(duì)腎癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌等腫瘤組織中TIL的克隆特性的研究也有報(bào)道［10－13］。 在胃癌的研究上，Jia等［16］研究了28例胃癌病例的腫瘤組織、正常粘膜及外周血中T細(xì)胞的多樣性，發(fā)現(xiàn)CDR3的氨基酸克隆型分布在不同組織中無(wú)顯著差異。Kuang等［17］則檢測(cè)了19例不同階段胃癌患者的41個(gè)組織樣品，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞克隆的多樣性及分布頻率在胃癌發(fā)展過(guò)程中沒(méi)有變化。但胃損傷及相鄰組織T細(xì)胞克隆的重疊隨腫瘤發(fā)生過(guò)程降低。

本研究對(duì)7例胃癌病例的腫瘤組織、癌旁組織、外周血共20個(gè)樣品分別進(jìn)行了TCR β鏈CDR3區(qū)測(cè)序，獲得了一些差異性取用的VJ基因序列及氨基酸序列。而CDR3全部克隆型、單一克隆型、高表達(dá)克隆的分布在不同組織間沒(méi)有顯著差異。在三組樣品的總克隆型及高質(zhì)量克隆型的重疊情況上，癌旁組織的總克隆型種類數(shù)最高，腫瘤組織其次，推測(cè)腫瘤組織內(nèi) TIL可能受到腫瘤相關(guān)抗原（tumor?associated antigen，TAA）的影響，其CDR3庫(kù)呈現(xiàn)限制性表達(dá)的特點(diǎn)。此外，癌旁組織的TIL克隆型多數(shù)為低表達(dá)，癌旁組織與腫瘤組織的高質(zhì)量的共有克隆型明顯多于外周血，提示腫瘤組織T細(xì)胞向癌旁組織滲透的可能，即這些差異克隆型可能參與了胃癌細(xì)胞的遷徙及擴(kuò)散過(guò)程，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

由于個(gè)體免疫系統(tǒng)存在龐大的復(fù)雜性及個(gè)體差異性，不同組織樣品間同樣存在異質(zhì)性，TIL TCR克隆型的表達(dá)豐度及克隆型種類水平上的差異均可能受到影響。Jia等［16］指出，胃癌患者的TIL庫(kù)及 PB?MC庫(kù)均不代表抗腫瘤反應(yīng)的總體質(zhì)量，因此不能預(yù)測(cè)疾病結(jié)果，而腫瘤鄰近粘膜組織TCR庫(kù)的多樣性指數(shù)（diversity index）則是胃癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。同樣的，本研究結(jié)果顯示，雖然不同類型組織樣品的克隆分布特性沒(méi)有顯著差異，癌旁組織的總克隆型在三種組織中種類數(shù)最高，多為低表達(dá)克隆型，提示癌旁組織的T細(xì)胞可能受到腫瘤組織及循環(huán)血液的共同影響，多樣性更高。為了消除個(gè)體差異及病例數(shù)的影響，仍需要進(jìn)一步研究癌旁組織的TCR克隆型特征，以明確胃癌腫瘤微環(huán)境的特性，對(duì)胃癌特異性抗原的鑒定可能具有重要意義。

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