脊柱結(jié)核動物模型建立的研究進(jìn)展

蔡則成 馬赫 戈朝暉

2017年，全球約有630萬例新發(fā)結(jié)核病患者，全球結(jié)核病的治療成功率約為83%[1]。骨與關(guān)節(jié)結(jié)核占患者總例數(shù)的5%左右，但是其中50%以上為脊柱結(jié)核[2]。近年來對于脊柱結(jié)核研究方向以藥物、內(nèi)置入物及緩釋材料居多[3]。在建立動物模型時，通常要達(dá)到一致性、反復(fù)性、穩(wěn)定性、實用性、可控性、易操作性和經(jīng)濟(jì)性。在落實到具體建立動物模型時，筆者就結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)菌株的配制、模型動物的選擇、致敏的重要性、手術(shù)方式、術(shù)后的檢測方向等加以闡述。

一、MTB菌株的實驗環(huán)境

1.實驗室條件：3級生物安全實驗室。

2.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：MTB的菌株應(yīng)來源于中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collection，CMCC)或美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)或當(dāng)?shù)氐慕Y(jié)核病研究所。

3.感染控制：嚴(yán)格按照3級實驗室生物安全規(guī)范與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實驗操作，一旦發(fā)生MTB意外感染事件，當(dāng)事人應(yīng)盡快就醫(yī)，通報疫情，關(guān)閉實驗室及消毒場所，隔離相關(guān)人員，相關(guān)部門應(yīng)立即啟動應(yīng)急預(yù)案。

二、MTB懸液的配制

在脊柱結(jié)核動物模型的建立中，大多數(shù)采用的是MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，同時也有用牛分枝桿菌作種植菌株，但是結(jié)果并不理想，在8周內(nèi)均未出現(xiàn)病變椎體的新生骨及硬化壁[4]。由于MTB的胞壁為疏水性，導(dǎo)致了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)難以滲透，決定了其為生長緩慢的菌株[5]。根據(jù)MTB的生長特性，已研究產(chǎn)生了十幾種培養(yǎng)基，但是臨床與科研上常用的有羅氏固體培養(yǎng)基和Sauton液體培養(yǎng)基兩種[6]。林旭[7]進(jìn)行菌株培養(yǎng)時同樣采用的是上述兩種培養(yǎng)基，缺點為取成熟菌落的時間為14～21 d，時間較長且后續(xù)對膿液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)也耗時較長。蘇明權(quán)等[8]在改良羅氏培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入已研究好的促生長劑配方，進(jìn)行了添加促生長劑與未添加生長劑之間MTB生長狀態(tài)的對比，發(fā)現(xiàn)菌株在含促生長劑的培養(yǎng)基上5～7 d即可形成肉眼可見的米粒狀菌落，而在普通培養(yǎng)基上需2周左右才形成。這種加入促生長劑的培養(yǎng)基可以在細(xì)菌培養(yǎng)及術(shù)后取材鑒定時為研究者節(jié)省時間。因MTB在培養(yǎng)基中的狀態(tài)為干燥顆粒狀，不便于攜帶及種植，故其應(yīng)用于動物模型種植時均配置為MTB混懸液，方法為輕柔研磨，加入生理鹽水，常用的MTB濃度為5 mg/ml[9]，即1×10-7菌落形成單位(CFU)·ml-1。喬永杰等[10]通過不同的MTB混懸液濃度對于造模的成功率做了更為詳細(xì)的對比研究，從組織病理到影像學(xué)的表現(xiàn)，通過三組不同濃度的菌量進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)1×10-6CFU·ml-1與1×10-8CFU·ml-1的死亡率及并發(fā)癥較高，而1×10-7CFU·ml-1可行性及成功率較高，但是作者只是設(shè)置了3組實驗，并未行更多不同濃度梯度之間的比較，導(dǎo)致樣本量過小。

三、模型動物的選擇

結(jié)核病的動物模型在微生物學(xué)鑒定、不同菌種的鑒別、細(xì)菌侵襲力的測定、病理學(xué)研究等均占有重要地位[11]。動物脊柱結(jié)核模型的建立需要產(chǎn)生與人類相似的病理變化，如病灶中軟組織的肉芽腫、膿腫形成，椎體中的死骨及骨缺損產(chǎn)生，以及能夠帶菌存活較長時間[12]。雖然研究者對很多不同種類的動物進(jìn)行了建立結(jié)核模型的實驗，但是由于動物對MTB的敏感性、疾病的表現(xiàn)形式、個體解剖結(jié)構(gòu)均不相同，導(dǎo)致實驗的結(jié)果在不同的動物上差異很大。以下就常見的實驗動物做一些比較。

1. 豚鼠：豚鼠對MTB高度敏感，只需要低劑量的MTB菌量即可產(chǎn)生與人類相似的肉芽腫，繼而迅速發(fā)生液化壞死，故其肉芽腫的發(fā)生是進(jìn)行性的，如不盡快加以干預(yù)，豚鼠的生存時間會非常短[13]。但是豚鼠對于卡介苗及抗結(jié)核藥物的反應(yīng)非常敏感，故豚鼠是良好的疫苗研發(fā)和治療效果檢測的結(jié)核模型。因豚鼠自身解剖結(jié)構(gòu)的特點，體積小、椎體及椎板較薄、椎骨視野暴露困難，致使其適合以氣溶膠的形式被感染，多用于模擬免疫功能缺陷者感染MTB，以及研究結(jié)核感染引起的超敏反應(yīng)所表達(dá)的蛋白[14]。

2.小鼠：小鼠價格低廉，繁殖率較高，CD4+和(或)CD8+T淋巴細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中表達(dá)明顯，適應(yīng)力強(qiáng)，非常適合在3級生物安全實驗室中進(jìn)行實驗。大多數(shù)小鼠通過低劑量的MTB氣溶膠進(jìn)行感染，其他的感染途徑有靜脈注射、氣管內(nèi)注射等，多用于進(jìn)行肺結(jié)核診治的實驗[15]。但是MTB并不是小鼠的自然病原體，所以小鼠對于MTB的敏感性并不高，這就導(dǎo)致小鼠可以攜帶大量的MTB而不表現(xiàn)出臨床癥狀的可能性[16]。Bai等[17]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在感染MTB后巨噬細(xì)胞沒有分泌一種名為白細(xì)胞介素(IL)-32的抗MTB細(xì)胞因子，導(dǎo)致其肉芽腫的形成與人類有很大的差異。在高劑量的MTB感染后也可出現(xiàn)與人類相似的肉芽腫，但是會引起致敏T細(xì)胞與細(xì)胞因子對抗原的直接殺傷，導(dǎo)致小鼠死亡[18]。雖然小鼠有對MTB不敏感、病灶形成不典型等不足，但是小鼠對抗結(jié)核藥物的反應(yīng)與人類很相似，并且轉(zhuǎn)基因小鼠可以產(chǎn)生與人類相似的抗MTB的細(xì)胞因子；故小鼠多用于肺結(jié)核模型的建立，以及疫苗研發(fā)、抗結(jié)核藥物的實驗中[19]。高琪樂等[20]通過在混懸液中加入Matrigel Matrix基質(zhì)膠注射入骨孔內(nèi)，構(gòu)建出C57BL/6小鼠脊柱結(jié)核模型，但是存在成功率較低、骨破壞面積較小等缺點。

3.兔：兔對于不同型別的MTB均有不同的表現(xiàn)，例如MTB的Erdman和HN878型對于兔的侵襲力非常弱，在感染之后疾病進(jìn)展非常緩慢，甚至可以見到未經(jīng)任何治療措施而痊愈的兔[21]；但是選用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株時可以觀察到與人類類似的結(jié)核病理變化、疾病進(jìn)展、免疫反應(yīng)的過程[22]。種植MTB時多用牛分枝桿菌與MTB，牛分枝桿菌感染后，兔會形成干酪樣壞死、局部液化，適用于組織病理學(xué)的研究[23]。兔在感染MTB后可出現(xiàn)較典型的結(jié)核病變，在脊柱種植后可出現(xiàn)椎間隙狹窄、骨質(zhì)破壞、寒性膿腫等典型病變，且兔的脊柱解剖很有特點，由椎體、椎板、上方的棘突、兩側(cè)的橫突構(gòu)成，形似三葉草，面積較大，適合進(jìn)行鉆孔、病灶清除、放入內(nèi)置物等手術(shù)操作，但是因兔的椎體周圍血管較多、椎體矢狀徑過短，所以對手術(shù)操作要求較高，術(shù)中易出現(xiàn)大血管破裂和脊髓損傷等嚴(yán)重并發(fā)癥[24]。

4.非人靈長類動物：非人靈長類動物對MTB易感，且與人類的解剖、遺傳特征等相似，理論上可以成為最理想的動物模型[25]。恒河猴(Rhesus Monkey，RMs)已經(jīng)被證明是一種非常合適的結(jié)核病動物模型，其作為動物模型可以更容易地感染MTB，并且可以顯示人類所有的結(jié)核病特點，從急性感染和主動感染到無癥狀的潛伏性感染[26]。除此之外，食蟹猴(Cynomolgus Monkey，CMs)也是非常理想的模型。Sharpe等[27]通過超低氣溶膠感染的形式對兩種不同類型的猴進(jìn)行對比試驗，發(fā)現(xiàn)RMs較CMs更容易感染MTB；故RMs多用于活動性結(jié)核病的研究，CMs可用于慢性或MTB潛伏感染的研究。但是迄今為止尚未見到用非人靈長類動物建立脊柱結(jié)核模型的報道。因其價格昂貴、飼養(yǎng)困難、容易引起疾病暴發(fā)等原因，故在結(jié)核病的研究中應(yīng)用較少。

四、致敏的重要性

對于動物結(jié)核模型的建立，John于1913 年采用下肢動脈、門靜脈分支，甚至于心臟直接注射MTB及敷料吸附MTB塞入骨孔的方式建立骨關(guān)節(jié)結(jié)核的動物模型。令人遺憾的是，這種方法得到的模型存活率低且樣本的數(shù)量較少，但是為后面的研究者建立其他部位的結(jié)核模型提供了啟發(fā)。這些建立結(jié)核模型的過程中主要存在3個問題：(1)難以獲得指定部位的結(jié)核固定病灶或病灶產(chǎn)生不明顯；(2)MTB容易經(jīng)血液播散，以致還未進(jìn)行實驗研究，動物就因全身性的MTB感染而死亡；(3)每種動物對于MTB的敏感性都是不同的。弗氏完全佐劑是一種從動物油脂中提取的乳濁液，相當(dāng)于減毒疫苗，能夠誘導(dǎo)動物體內(nèi)產(chǎn)生MTB抗體，增強(qiáng)免疫力，防止結(jié)核感染而產(chǎn)生過強(qiáng)的免疫反應(yīng)[28]。為了解決上述問題，Lindberg[29]在1967年率先采用已經(jīng)致敏的豚鼠，并在其股骨遠(yuǎn)端干骺端鉆孔，置入明膠海綿并浸注MTB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)破壞和軟組織腫脹在不到2個月的時間即可形成，一并解決了上述的問題。Smith和Harding[13]提到豚鼠對于MTB敏感的特性，但是術(shù)前致敏卻可以提高存活率，這個現(xiàn)象提示了致敏對于建立模型的重要性。2002年吳啟秋等[30]在國內(nèi)率先將MTB直接注入兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，但是與之前不同的是，兔在實驗前已用弗氏完全佐劑致敏。此法成功建立了兔膝關(guān)節(jié)結(jié)核模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)致敏的兔MTB產(chǎn)生的擴(kuò)散和免疫反應(yīng)較前明顯降低，實驗兔存活時間長，可重復(fù)性強(qiáng)，為國內(nèi)建立結(jié)核模型兔提供了新的啟示。Liu等[31]采用的是術(shù)前1個月給實驗兔注射地塞米松，1周后改為地塞米松片劑喂服，但是脊柱結(jié)核的病理變化并不是很典型。2015年Geng等[32]對于建立脊柱結(jié)核模型兔的術(shù)前弗氏完全佐劑致敏與未致敏的兩種建模方式的成功率做了詳細(xì)對比，結(jié)果證實了術(shù)前致敏組的成功率高于未致敏組；但是縱觀各個研究，均未對致敏劑的劑量做出過詳細(xì)的解釋，以及致敏劑的用量是否與體質(zhì)量、年齡等因素有關(guān)，亦未見到有不同致敏劑的劑量與建模成功率的報道。

五、手術(shù)方式

對于兔脊柱暴露的方法主要有兩種，即經(jīng)側(cè)方與后方入路。大多數(shù)學(xué)者均采用王非等[33]的側(cè)方肌肉間隙入路的方法對兔的脊柱進(jìn)行暴露，可以避免損傷腹膜、深入臟器等操作，但是后方入路也可以達(dá)到上述目的。王云玲等[34]對側(cè)方入路和后方入路做過比較后發(fā)現(xiàn)，側(cè)方入路較后方入路所誘發(fā)的結(jié)核癥狀出現(xiàn)的更早，術(shù)后MTB腹腔播散、竇道形成等并發(fā)癥更少，兔的存活率更高。在兔麻醉完成后，行右側(cè)臥位固定，常規(guī)消毒及鋪巾，經(jīng)橫突側(cè)腹部入路，顯露腰5～6椎體，于腰5椎體下部距腰5～6椎間盤0.5 cm處從左后方向右前方，用醫(yī)用骨鉆進(jìn)行鉆孔，深度約5 mm，直徑3 mm，此即為側(cè)方入路顯露椎間盤與椎體。骨孔在充分止血后填充明膠海綿并壓實，用注射器在明膠海綿上緩慢浸注MTB混懸液0.1 ml，以能讓明膠海綿充分填充骨孔為宜。在完成填塞后，Guo等[9]主張用骨蠟封孔，但也有未進(jìn)行封孔的方式。Geng等[35]在實驗中發(fā)現(xiàn)，若是骨孔過小、菌液有輕微溢出，則不必用骨蠟封孔，否則術(shù)后很容易脫落，造成MTB的播散，反之則可進(jìn)行封孔。實驗中用的明膠海綿相當(dāng)于MTB的載體，絕大多數(shù)研究者采用的是明膠海綿，但是高琪樂等[20]在實驗中采用了基質(zhì)膠，同樣達(dá)到了MTB種植的目的，這是一種對植入材料的新啟發(fā)。

六、術(shù)后的檢測方向

雖然尚未出現(xiàn)對于脊柱結(jié)核動物模型鑒定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但是綜合前面的實驗研究，可以從影像學(xué)、病灶解剖、組織學(xué)染色、膿腫細(xì)菌培養(yǎng)等幾個方面進(jìn)行檢測。(1)影像學(xué)：X線檢查可以發(fā)現(xiàn)病灶椎體有骨質(zhì)破壞及鄰近椎間盤變窄甚至產(chǎn)生后凸，但這些均是脊柱結(jié)核晚期的表現(xiàn)；CT可以在早期顯示椎旁膿腫、鈣化等病變，也可以清晰顯示死骨及硬化壁的形成；MRI對于脊柱結(jié)核診斷最為敏感，也是早期最準(zhǔn)確的檢測方法，可以顯示脊髓受壓、椎旁肌肉水腫、膿腫形成等變化[36]。(2)病灶解剖：對動物模型的病灶進(jìn)行解剖后可發(fā)現(xiàn)肉眼可見的膿腫，膿腫呈淡黃色、無臭味；其余部位如肺、心等未見MTB播散及膿腫形成。(3)組織學(xué)染色：取動物膿壁組織行HE染色可見較多的淋巴細(xì)胞、類上皮細(xì)胞，椎體標(biāo)本切片HE染色可見骨質(zhì)破壞，骨小梁結(jié)構(gòu)消失，周圍為炎性肉芽組織。(4)膿腫細(xì)菌培養(yǎng)：取膿液標(biāo)本進(jìn)行MTB培養(yǎng)，可在培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)生長緩慢的淡黃色菌落[37]。綜合以上幾個方面可以大致判定建模是否成功。

七、小結(jié)

選用新西蘭大白兔建立脊柱結(jié)核模型已趨于成熟和規(guī)范，但是還存在著MTB培養(yǎng)與鑒定需時較長、術(shù)前致敏劑量模糊、MTB配制的最適濃度范圍較窄、建模成功率低、吸附MTB材料種類較少等問題。在以后對模型的研究過程中，可以選用生長更快的培養(yǎng)基，條件允許下可以增加飼養(yǎng)動物的數(shù)量，從更小梯度的濃度開始配制MTB，以探索出更精確的最適MTB菌量濃度。對于致敏劑量可以準(zhǔn)確到體質(zhì)量與注射劑量之間的關(guān)系，以獲得更恰當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。在植入的吸附材料中，可以發(fā)現(xiàn)更多的不同種類的材料，并且對其進(jìn)行細(xì)致的研究，從而找出對骨組織更加有親和力的材料。對今后的結(jié)核動物模型研究時，可在多個實驗條件成熟后，制定出規(guī)范化的術(shù)前準(zhǔn)備、術(shù)中操作和術(shù)后鑒定等標(biāo)準(zhǔn)，以此提高脊柱結(jié)核動物建模的成功率。