板栗多糖的提取、分離純化方法及其生物活性

宋磊肖，何俊平，賈曉韓，范得躍，李曉菁

(河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島 066600)

板栗(CastaneamollissimaBlume)為殼斗科栗屬植物，原產(chǎn)于中國，素稱“鐵桿莊稼，木本糧食”，國外稱之為“健康食品”。板栗具有很高的營養(yǎng)價值，富含多糖、淀粉、蛋白質(zhì)、維生素、脂肪及礦物質(zhì)元素，可供人體吸收和利用的養(yǎng)分高達(dá)98%[1]，且具有藥用價值[2], 是一種營養(yǎng)保健品。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，板栗性味甘溫，有養(yǎng)胃健脾、補(bǔ)腎強(qiáng)筋、活血、止血消腫，益于高血壓、冠心病的防治等功能[3]。近年來，板栗研究多集中于糖的提取、分離純化[4]，對多糖活性和結(jié)構(gòu)的研究少。筆者對板栗多糖的提取、分離純化、結(jié)構(gòu)研究中應(yīng)用的方法和已研究發(fā)現(xiàn)的板栗多糖的功能進(jìn)行了綜述。

1 板栗多糖的提取方法

板栗多糖的提取方法有水提取法、酸提取法、堿提取法、酶輔助法、微波提取法、超聲波提取法、亞臨界水提取法、加壓溶劑萃取法等。

1.1 水提取法

水提取法是板栗多糖提取的傳統(tǒng)方法，分為熱水提取法和冷水提取法。因冷水提取法得到的僅是存在于細(xì)胞壁之外的一些易溶于水的多糖類物質(zhì)，故常采用熱水提取法，一般將溫度控制在60～90℃。如李潤豐等人對河北省遷西縣大板紅多糖采用熱水提取法，最適條件為提取溫度60℃，時間1.5小時，料液比1∶20，多糖得率9.85%[5]；梁雪采用提取溫度65℃，提取時間1小時，液料比1∶35，提取燕龍板栗中的多糖，其得率16.94%[6]；戴成國利用熱水提取法和正交試驗(yàn)法確定了提取板栗多糖的最佳條件為浸提溫度85℃，浸提時間3小時，浸提次數(shù)3次，料液比1∶30，多糖得率12.64 %[7]。張美等人采用熱水提取法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)提取湖北荊山板栗中的多糖，提取最適溫度為90℃，時間150分鐘，料液比1∶30，多糖得率6.24%[8]。

1.2 酸提取法

酸提取法是用適宜的乙酸或鹽酸將含葡萄糖醛酸等酸性基團(tuán)的多糖提取出來的方法[9]。

王曉紅[10]、梁雪[6,11]和周艷[12]采用酸提取法提取燕山板栗中的多糖，其中王曉紅和周艷通過正交試驗(yàn)法確定了提取多糖的最佳條件為鹽酸濃度0.72mol/L，提取時間40分鐘，提取溫度70℃，料液比1∶20，多糖得率18.66%。

1.3 堿提取法

堿提取法是利用稀堿溶液對多糖進(jìn)行提取的方法。其原理是稀堿液有助于解除植物細(xì)胞壁分子間的化學(xué)和物理作用，并可轉(zhuǎn)化多糖與蛋白質(zhì)間的結(jié)合方式[13,14]。張澤俊等人采用堿提取法提取了昭通市售板栗中的多糖，在固定料液比(1∶40)和原料料徑(80目篩)的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗(yàn)法優(yōu)化了其提取條件：提取濃度0.5mol/L，提取時間90分鐘，提取溫度80℃，多糖提取率26.47%[15]。

1.4 酶輔助法

酶輔助法是利用酶反應(yīng)的高度專一性將植物細(xì)胞壁降解，使得多糖被釋放而被提取的一種方法[9,14,16]。張美利用酶輔助提取法和正交試驗(yàn)法得出板栗多糖提取的最佳條件：提取溫度45℃，提取時間240分鐘，提取料液比1∶18，多糖提取率7.36%[8]。李悅采用酶提取法提取板栗中的多糖，并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)法確定提取多糖的最佳工藝條件：提取溫度50℃，提取液pH值5.5，提取時間6小時，酶添加量3%，多糖提取率12.11%[17]。

1.5 微波提取法

微波提取法是根據(jù)微波在傳輸過程中遇到不同性質(zhì)的物質(zhì)時，會在微波的反射、穿透和吸收上產(chǎn)生差異，進(jìn)而選擇性地使細(xì)胞內(nèi)的極性分子的溫度升高，細(xì)胞內(nèi)壓增大，最終使細(xì)胞內(nèi)的有效成分自動流出，利用了微波穿透能力強(qiáng)和加熱迅速的特點(diǎn)。王曉紅[10]和周艷[12]采用微波提取法和正交試驗(yàn)提取燕龍板栗中的多糖，得最佳條件：微波功率800W，提取時間50秒，提取劑用量30mL/g，提取率11.87%；張美利用正交試驗(yàn)得出微波提取板栗多糖的最佳條件：微波功率600W，微波處理時間5分鐘，提取時間80分鐘，提取率9.34%[8]。

1.6 超聲波提取法(超聲波輔助提取法)

超聲波提取法是通過超聲波的空化效應(yīng)和強(qiáng)烈震動，破碎原料細(xì)胞壁，促進(jìn)多糖的溶出，提高多糖得率的一種方法[9,15,16,18,19]。楊芳等用超聲波提取板栗中的多糖，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上運(yùn)用正交試驗(yàn)法確定了提取多糖的最佳工藝條件：超聲波功率100W，超聲處理時間35分鐘，水浴提取時間60分鐘，多糖提取率13.94 %[20]；伍小紅等人用此法提取板栗多糖，通過正交試驗(yàn)法得：超聲波功率200W，超聲處理時間24分鐘，提取溫度80℃，提取時間2.5小時，料液比1∶25(g/ml)，多糖得率14.20%[21]；李潤豐等用超聲波法提取多糖，其優(yōu)化的提取條件為超聲波功率160W，提取時間45分鐘，提取溫度65℃，料液比1∶35，多糖得率10.34%[5]。

1.7 亞臨界水萃取法

亞臨界水萃取法是在一定的壓力下，將水加熱到100～374℃時，水仍然保持液體狀態(tài)，與常溫常壓水相比更近似于有機(jī)溶劑，水的極性在較大范圍內(nèi)變化，可實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物中有效成分從水溶性成分到脂溶性成分的連續(xù)提取[22,23]。邵亭亭等人利用此法提取板栗多糖，通過正交試驗(yàn)確定了提取板栗多糖的優(yōu)化條件：提取壓力5.0MPa，提取溫度150℃，提取時間10分鐘，料液比1∶20(g/ml)，多糖提取率14.89%[24]。

1.8 加壓溶劑萃取法

加壓溶劑萃取法是在較高溫度(50～200℃)和壓力(1000～3000Pa)下，用有機(jī)溶劑萃取固體或半固體的自動化方法。梁雪等人采用加壓溶劑萃取法提取燕龍板栗中的多糖，通過正交試驗(yàn)確定了提取板栗多糖的優(yōu)化條件：萃取壓力6MPa，靜態(tài)萃取時間8分鐘，萃取溫度70℃，循環(huán)2次，多糖提取率20.14%[11]。

除以上方法之外，多糖的提取方法還有超臨界萃取法[15,16,19]、超高壓提取法[16]、超濾法[19]、氨水浸泡法[25]、微波-超聲波輔助提取法、緩凍協(xié)同微波輔助提取法、超聲-酶輔助提取法[9]等，但這些方法在板栗多糖的提取中未見報道。

2 板栗多糖分離純化

在板栗多糖提取、分離純化、含量測定、結(jié)構(gòu)分析及活性測定中，分離純化是最關(guān)鍵的一步，關(guān)系到其后對多糖的結(jié)構(gòu)分析及活性研究[26]。

2.1 板栗多糖的分離

2.1.1 脫蛋白 Sevage法[16,18,26-28][Sevage試劑是氯仿∶正丁醇(體積比)=4∶1混合而成]是最常用的脫蛋白的方法，其原理是利用蛋白質(zhì)在三氯乙烷等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn)。板栗多糖脫蛋白的操作方法是將提取液與Sevage試劑按體積1∶1混合，劇烈振蕩，靜置，分層，除去中間層變性蛋白，多次重復(fù)直至無中間層出現(xiàn)[6,10-12]。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是條件溫和，不會引起多糖的變性。三氯乙酸法(TCA)是以三氯乙酸做有機(jī)溶劑，使樣品中的蛋白質(zhì)因有機(jī)酸的作用而變性沉淀。楊利劍應(yīng)用此法去除板栗多糖中的蛋白質(zhì)，但未明確用量[29]。在板栗多糖脫蛋白中還未應(yīng)用到的脫蛋白方法有三氯乙酸-正丁醇法、三氯三氟乙烷與Sevage聯(lián)用法、氯仿-正丁醇-甲醇-乙醇-氯化鈉法、等電沉淀法、酶解法、綜合法(酶-三氯乙酸-正丁醇法、酶-三氯醋酸、酶-Sevage法)、徑向色譜新技術(shù)等[16,27,28]。

2.1.2 脫色素 多糖脫色法有活性炭法、雙氧水法[28]和大孔樹脂法[9,16,26]。在板栗多糖脫色中常采用大孔樹脂脫色法，其原理是以大孔樹脂為吸附劑，利用其對不同成分的選擇性吸附和篩選作用，通過選用適宜的吸附和解吸條件，分離、提純某一種或某一類有機(jī)化合物的技術(shù)[29,30]。

2.2 板栗多糖的純化

多糖純化的方法多，如層析法(按層析過程的機(jī)理分吸附層析法、分配層析法、離子交換層析法、凝膠層析法、親和層析法等；按操作形式分柱層析法、紙層析法和薄層層析法等)、沉淀法(季銨鹽沉淀法、分級沉淀法)、透析法、金屬絡(luò)合物法等[31-34]。

李清宇采用柱層析法對所得板栗多糖粗品進(jìn)行了分離純化，DEAE-52纖維素柱層析結(jié)果表明，用0.1mol/L NaCl洗脫得到板栗多糖CPS1，用0.2mol/LNaCl洗脫得到板栗多糖CPS2[4]。戴成國對其試驗(yàn)所得的粗多糖采用季銨鹽沉淀法分離純化得到酸性多糖CP-1、中性多糖CP-2及堿性多糖CP-3[7]。何玲玲采用80%乙醇沉淀法從板栗中提取到板栗多糖CPS，再經(jīng)DEAE-纖維素柱層析分離純化得到純化多糖組分CPS1[33]。

3 生物活性

研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、抗凝血、降血脂、降血糖、抗菌消炎、抗輻射、防止心血管疾病等功能[35-45]，被廣泛應(yīng)用于功能性食品、保健品和臨床上。作為藥食兩用的板栗，對其多糖活性的研究現(xiàn)已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。

3.1 抗氧化性

何玲玲分析了從遼寧省丹東市寬甸滿族自治縣板栗中提取的多糖，發(fā)現(xiàn)CPS對羥基自由基、超氧陰離子自由基、過氧化氫的清除作用及還原能力均強(qiáng)于純化后的CPS1[33]。邵亭亭發(fā)現(xiàn)在板栗多糖相同濃度下，亞臨界水萃取的板栗多糖對羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力優(yōu)于熱水提取法的[27]。李潤豐以維生素C(Vc)為對照，對比分析發(fā)現(xiàn)，遷西板栗多糖在相同濃度下，其還原能力、清除羥基自由基和亞硝酸根離子及抗卵磷脂脂質(zhì)體氧化能力均低于Vc[46]。戴成國對鎮(zhèn)安1號板栗中的多糖進(jìn)行活性研究，發(fā)現(xiàn)其具有還原能力和清除羥基自由基、超氧陰離子自由基的能力，但都弱于Vc[7]。

3.2 提高白細(xì)胞、抗凝血

楊利劍研究發(fā)現(xiàn)，湖北羅田板栗多糖明顯升高昆明種小白鼠白細(xì)胞，延長小白鼠凝血時間[29]。聶牧對板栗多糖進(jìn)行抗動脈血栓形成研究，發(fā)現(xiàn)板栗多糖(200、300 mg/kg)可延長小鼠的出血時間(剪斷尾尖開始至血流停止的時間)、凝血時間(從采血開始至挑起血絲的時間)及血栓形成時間(從取下濾紙條至頸總動脈血流量降至并穩(wěn)定在120PU下保持1分鐘的時間)，降低血流波動性，表明板栗多糖抗動脈血栓機(jī)制與其抗血小板和抗凝血有關(guān)[47]。

3.3 抗腫瘤

梁雪采用體外MTT試驗(yàn)法對從燕龍板栗中提取純化的多糖進(jìn)行了抗腫瘤研究，發(fā)現(xiàn)板栗多糖對人肝癌細(xì)胞 Bel-7402、子宮癌細(xì)胞HCT-8和肺癌細(xì)胞 A-549都有明顯的抑制增殖作用，其中對人肝癌細(xì)胞 Bel-7402的生長抑制作用最為明顯。當(dāng)板栗多糖濃度為300μg/mL時，對上述3種人癌細(xì)胞的生長抑制率分別為69.54%、55.27%和51.38%，并對劑量有依賴性[6]。李紅艷等對板栗多糖及硒酸化修飾后的板栗多糖進(jìn)行活性測試，結(jié)果為多糖CP0-1和sCP0-1在體外均可誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡；硒酸化修飾后多糖對腫瘤細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)[46,48]。

3.4 抗疲勞

李清宇對購于陜西鎮(zhèn)安縣板栗中的多糖進(jìn)行抗疲勞活性研究，結(jié)果顯示，低劑量、中劑量和高劑量的板栗多糖均降低了運(yùn)動后小鼠體內(nèi)血乳酸和血尿素氮的含量，提高了肌糖原和肝糖原的含量，且顯著提高了小鼠的運(yùn)動耐力，其中以中劑量200mg/(kgod)效果最佳[4]。

4 展望

活性多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、抗凝血和提高白細(xì)胞等生物活性。板栗是藥食兩用的果實(shí)，主要成分是多糖和淀粉。最新數(shù)據(jù)顯示，中國板栗總面積達(dá)到180萬hm2，年產(chǎn)板栗195萬t，占世界板栗總產(chǎn)量的84%[49]。加大對板栗深加工的研究，尤其加大對板栗多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性的研究，可推進(jìn)板栗由單一的食品功能向保健品和醫(yī)藥用品等功能延伸,滿足市場對天然物品的需求，提高人民的身體素質(zhì)、增進(jìn)健康；增加板栗的附加值，推動中國板栗資源的利用和發(fā)展。