三種方法獲取胸水細(xì)胞蠟塊中腫瘤細(xì)胞進(jìn)行EGFR基因檢測

蔣金芳，任 艷，梁偉華，龐麗娟

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，腫瘤的分子檢測與臨床靶向用藥為患者提供新的治療。目前，肺癌已進(jìn)入精準(zhǔn)治療時代，方案及藥物的選擇是根據(jù)其組織學(xué)亞型和分子學(xué)檢測結(jié)果共同制定[1]。近年以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)為靶點(diǎn)的分子靶向治療已成為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的治療方案，然而只有約1/3的患者存在EGFR敏感突變位點(diǎn)，對EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)的Gefitinib和Erlotinib藥物敏感。因此，獲得足量優(yōu)質(zhì)的樣本進(jìn)行基因檢測是指導(dǎo)靶向用藥的必要前提。

相對于手術(shù)和穿刺標(biāo)本，獲取肺癌晚期患者的胸水標(biāo)本具有便捷、創(chuàng)傷小、多次取材等優(yōu)勢，針對胸水標(biāo)本是否用于基因檢測需依賴樣本中腫瘤細(xì)胞的絕對數(shù)、腫瘤細(xì)胞所占比率、腫瘤細(xì)胞保存程度及采用分子檢測方法的敏感性[2-4]。目前，大部分檢測機(jī)構(gòu)取胸水離心細(xì)胞或細(xì)胞蠟塊切蠟?zāi)ぬ崛『怂徇M(jìn)行基因檢測，并未對檢測樣本中腫瘤細(xì)胞的絕對數(shù)和腫瘤細(xì)胞所占比率進(jìn)行評估，基因檢測結(jié)果是否能真實反映腫瘤細(xì)胞的基因狀態(tài)值得進(jìn)一步分析。本實驗在胸水細(xì)胞蠟塊中應(yīng)用三種方法獲取腫瘤細(xì)胞進(jìn)行基因檢測，對腫瘤細(xì)胞的絕對數(shù)和腫瘤細(xì)胞所占比率做進(jìn)一步探討。

1 材料與方法

1.1材料收集石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2014～2015年肺來源的惡性腫瘤胸水細(xì)胞蠟塊制成切片，請兩位高年資的病理醫(yī)師對標(biāo)本HE、免疫組化閱片，挑選肺腫瘤細(xì)胞標(biāo)本30例，參照《肺癌小標(biāo)本取材相關(guān)問題的中國專家共識》，病理醫(yī)師對需要做基因檢測的胸水細(xì)胞蠟塊中腫瘤細(xì)胞數(shù)量及百分比進(jìn)行評估。

1.2細(xì)胞蠟塊取1份胸水沉淀樣本約250 mL入50 mL離心管中，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，將收集沉淀物，用擦鏡紙包好放入包埋盒中，放入10%中性福爾馬林中固定1～2 h，按小組織常規(guī)標(biāo)本處理[5]。

1.3三種方法獲取腫瘤細(xì)胞第一種常規(guī)方法：細(xì)胞蠟塊5 μm厚，連續(xù)切片5～10張蠟?zāi)ぃ占?.5 mL的EP管中。第二種激光顯微切割法：細(xì)胞蠟塊8 μm厚連續(xù)切片5～10張，自然晾干，HE染色，無水乙醇2 min，自然晾干，激光顯微切割儀(德國/AXT2022 ZEISS)選取并收集腫瘤細(xì)胞到收集蓋上(圖1)，腫瘤細(xì)胞數(shù)量大于200個[4],每例需3～4個收集蓋，將收集蓋中的腫瘤細(xì)胞經(jīng)蛋白酶K(20 mg/mL)消化12 h，收集在1.5 mL EP管中。第三種刀片刮取法：細(xì)胞蠟塊5 μm厚，連續(xù)切片5～10張，完成烤片，HE染色，在低倍鏡下觀察，結(jié)合免疫組化用記號筆在腫瘤細(xì)胞區(qū)域劃圈，消毒刀片刮去非腫瘤細(xì)胞區(qū)域，用75%乙醇把這些區(qū)域擦干凈，更換刀片刮下的腫瘤細(xì)胞，估算腫瘤細(xì)胞數(shù)量大于200個，收集到1.5 mL的EP管中。

ABC圖1 用激光顯微切割法從胸水細(xì)胞蠟塊中獲取腫瘤細(xì)胞:A.切割前肺腺癌胸水細(xì)胞塊切片;B.切割后肺腺癌胸水細(xì)胞塊切片;C.收集蓋上的肺腺癌細(xì)胞

1.4DNA提取Qiagen法石蠟組織提取DNA步驟詳見說明書，提取好的DNA用核酸蛋白測定儀(Thermo scientific ND 2000)測定DNA質(zhì)量及濃度，調(diào)整DNA濃度為2 ng/μL備用。

1.5EGFR基因檢測使用廈門艾德醫(yī)藥公司提供試劑(人類EGFR基因突變21種檢測試劑盒)的8聯(lián)管加入樣本DNA，使用實時定量PCR儀(美國/ABI 7500 Fast)檢測EGFR基因。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析EGFR基因檢測所得數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各組間率比較應(yīng)用χ2檢驗。以P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1胸水細(xì)胞蠟塊中獲取腫瘤細(xì)胞進(jìn)行基因檢測成功率比較30例胸水細(xì)胞蠟塊用三種方法獲取腫瘤細(xì)胞進(jìn)行基因檢測成功率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.912，P=0.019)，常規(guī)切蠟?zāi)し▋?yōu)于刀片刮取法(χ2=6.667，P=0.024)，有6例細(xì)胞蠟塊切片上腫瘤細(xì)胞和間皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞混雜，用刀片無法刮?。欢Ｒ?guī)切蠟?zāi)しㄅc激光顯微切割法、激光顯微切割法與刀片刮取法基因檢測成功率，差異均無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.286，0.480，P>0.05，表1)。

表1 胸水細(xì)胞蠟塊中獲取腫瘤細(xì)胞進(jìn)行基因檢測成功率比較(n=30)

△常規(guī)切蠟?zāi)しㄅc激光顯微切割法相比，△△常規(guī)切蠟?zāi)しㄅc激光顯微切割法相比，△△△激光顯微切割法與刀片刮取法相比

2.2胸水細(xì)胞蠟塊進(jìn)行分類將血性胸水、腫瘤細(xì)胞大于30%的胸水、腫瘤細(xì)胞大于10%且小于30%的胸水標(biāo)本、腫瘤細(xì)胞大于1%且小于10%的胸水標(biāo)本、腫瘤細(xì)胞小于1%的胸水五組標(biāo)本進(jìn)行檢測，其中前兩組用三種方法獲取腫瘤細(xì)胞EGFR檢測成功率一致；腫瘤細(xì)胞大于10%且小于30%的胸水標(biāo)本用刀片刮取法有1例未成功；腫瘤細(xì)胞大于1%且小于10%胸水標(biāo)本用激光切割法和刀片刮取法均有2例未成功；小于1%的胸水標(biāo)本組3例，用激光切割法僅1例成功。刀片刮取法均未成功(即腫瘤細(xì)胞小于10%胸水標(biāo)本兩組9例，用激光切割法和刀片刮取法只有5例和4例成功，表2)

表2 胸水細(xì)胞蠟塊進(jìn)行分類[n(%)]

Ⅰ：血性胸水；Ⅱ：腫瘤細(xì)胞大于30%的胸水；Ⅲ：腫瘤細(xì)胞大于10%且小于30%的胸水標(biāo)本；Ⅳ：腫瘤細(xì)胞大于1%且小于10%的胸水標(biāo)本；Ⅴ：腫瘤細(xì)胞小于1%的胸水標(biāo)本

2.3三種方法獲取胸水細(xì)胞蠟塊中腫瘤細(xì)胞EGFR基因檢測血性胸水、腫瘤細(xì)胞大于30%的胸水細(xì)胞蠟塊組和大于10%且小于30%的細(xì)胞蠟塊組，應(yīng)用三種方法獲取腫瘤細(xì)胞進(jìn)行EGFR檢測分別有2、2和3例陽性；但腫瘤細(xì)胞大于1%且小于10%的胸水細(xì)胞蠟塊組使用常規(guī)切蠟?zāi)しā⒓す怙@微切割法、刀片刮取法，EGFR基因檢測陽性例數(shù)分別為1/6、2/4、2/4(表3，圖2)；腫瘤細(xì)胞小于1%的胸水細(xì)胞蠟塊組，三種方法均未檢測出EGFR陽性。

圖2 三種方法獲取腫瘤細(xì)胞進(jìn)行EGFR基因檢測陽性率比較

組織分類常規(guī)切蠟?zāi)し栃躁幮约す怙@微切割法陽性陰性刀片刮取法陽性陰性Ⅰ2(8)62(8)62(8)6Ⅱ2(6)42(6)42(6)4Ⅲ3(7)43(7)43(6)3Ⅳ1(6)52(4)22(4)2Ⅴ0(3)30(1)10(0)0合計8(30)229(26)179(24)15

Ⅰ：血性胸水；Ⅱ：腫瘤細(xì)胞大于30%的胸水；Ⅲ：腫瘤細(xì)胞大于10%且小于30%的胸水標(biāo)本；Ⅳ：腫瘤細(xì)胞大于1%且小于10%的胸水標(biāo)本；Ⅴ：腫瘤細(xì)胞小于1%的胸水標(biāo)本

3 討論

隨著胸水細(xì)胞蠟塊技術(shù)的不斷完善，胸水標(biāo)本在肺癌EGFR基因檢測中發(fā)揮越來越重要的作用，與手術(shù)標(biāo)本和穿刺標(biāo)本在病理診斷及基因檢測等方面相比，具有創(chuàng)傷小、可以實時檢測患者是否出現(xiàn)耐藥基因或者查找其他藥物敏感基因均無法替代的優(yōu)勢。

胸腹水脫落細(xì)胞檢查是細(xì)胞病理學(xué)診斷的有效手段之一，但常規(guī)胸腹水涂片上腫瘤細(xì)胞量少，無法精確提供組織學(xué)來源，且不適用于免疫組化鑒別診斷。細(xì)胞蠟塊技術(shù)不僅能夠富集腫瘤細(xì)胞且多次取材，同時HE細(xì)胞無皺縮和變性，染色鮮艷，免疫組化標(biāo)記染色理想，細(xì)胞蠟塊可長期保存并反復(fù)切片，進(jìn)行后續(xù)各種檢測，大大提高細(xì)胞病理學(xué)診斷的敏感性和特異性[6]。

研究證實：EGFR體細(xì)胞突變對Gefitinib 和Erlotinib 藥物治療后的潛在臨床反應(yīng)起決定作用，EGFR-TKI結(jié)構(gòu)域的前4個外顯子(18～21)其中18、19、21外顯子突變的患者對這兩種藥物的反應(yīng)性更好[7-8]，而20外顯子突變使腫瘤細(xì)胞對EGFR-TKI產(chǎn)生抵抗，該突變主要見于EGFR-TKI治療后復(fù)發(fā)者。2017年NCCN指南建議，對于EGFR-TKI治療進(jìn)展期的NSCLC患者在二線治療前，推薦進(jìn)行二次活檢以明確EGFR-TKI耐藥機(jī)制。因此臨床醫(yī)師針對進(jìn)展期的肺癌患者更傾向于抽取胸水進(jìn)行基因檢測，以選擇更有效的治療方案。

胸水標(biāo)本制成細(xì)胞蠟塊行HE、免疫組化染色確診為 NSCLC后，常規(guī)使用切蠟?zāi)ぬ崛『怂徇M(jìn)行EGFR基因檢測。文獻(xiàn)報道有高達(dá)12%的胸水標(biāo)本出現(xiàn)間皮細(xì)胞與癌細(xì)胞難以鑒別并同時存在的狀況[9]，本實驗證實：胸水細(xì)胞蠟塊通過免疫組化抗體CK5/6和(或)CK7、TTF-1、Napsin A 表達(dá)以及WT1、Calretinin不表達(dá)，可明顯區(qū)分腫瘤細(xì)胞和間皮細(xì)胞，并確定腫瘤細(xì)胞百分比。

本實驗收集30例胸水標(biāo)本中29例為肺腺癌，1例為腺鱗癌，有22例間皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞并存的病例，8例血性胸水標(biāo)本。參考《肺癌小標(biāo)本取材相關(guān)問題的中國專家共識》及相關(guān)文獻(xiàn)[10]將肺癌胸水標(biāo)本分成血性胸水、腫瘤細(xì)胞大于30%的胸水、腫瘤細(xì)胞大于10%且小于30%的胸水標(biāo)本、腫瘤細(xì)胞大于1%且小于10%的胸水標(biāo)本、腫瘤細(xì)胞小于1%的胸水五組標(biāo)本，用三種方法獲取腫瘤細(xì)胞進(jìn)行基因檢測，其中在血性胸水、腫瘤細(xì)胞大于30%和大于10%且小于30%三組中，檢測2、2和3例EGFR陽性；在腫瘤細(xì)胞小于1%的3例胸水標(biāo)本中用刀片刮取法無法獲取腫瘤細(xì)胞，激光顯微切割法僅1例成功獲取腫瘤細(xì)胞，用常規(guī)切蠟?zāi)し?例成功，但均未檢測出EGFR陽性；在腫瘤細(xì)胞大于1%且小于10%胸水標(biāo)本有6例，使用激光顯微切割法和刀片刮取法成功4例，進(jìn)行基因檢測均檢測出2例EGFR陽性，核對患者信息，其中1例用三種方法獲取腫瘤細(xì)胞基因檢測陽性患者信息一致，另1例EGFR陽性的患者用激光顯微切割法和刀片刮取法成功檢測，而使用常規(guī)切蠟?zāi)しㄎ礄z測出EGFR陽性，由此推斷在腫瘤細(xì)胞所含百分比小于10%的樣本中用常規(guī)切蠟?zāi)さ姆椒?，至少?例未檢測出EGFR陽性。

三種方法獲取腫瘤細(xì)胞中，常規(guī)切蠟?zāi)しㄟm用于所有樣本，而對于間皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞混雜且腫瘤細(xì)胞含量小于1%的樣本刀片刮取法無法完成；激光顯微切割法也適用于所有樣本，選用細(xì)胞數(shù)在200個以上，有4例由于提取核酸的量小于1 ng/μL未能成功檢測，可能由于激光切割后，收集蓋上的腫瘤細(xì)胞未能完全消化，核酸提取時損耗等方面原因，需要在后續(xù)的研究中針對收集蓋上的腫瘤細(xì)胞消化時間、消化液濃度及核酸提取等流程進(jìn)一步優(yōu)化。

三種獲取腫瘤細(xì)胞方法中以常規(guī)切蠟?zāi)しㄗ顬楹唵?，刀片刮取法次之，激光顯微切割法操作步驟最為復(fù)雜，成本最高。對血性胸水、腫瘤細(xì)胞大于10%(包含大于30%和大于10%且小于30%胸水細(xì)胞蠟塊)常規(guī)切蠟?zāi)ぬ崛『怂岜容^方便；對成巢或成團(tuán)的胸水細(xì)胞蠟塊用刀片刮取法比較實用，在腫瘤細(xì)胞和間皮細(xì)胞混雜并且間皮細(xì)胞豐富、腫瘤細(xì)胞百分比小于1%胸水標(biāo)本中激光顯微切割法能獲取散在、單個腫瘤細(xì)胞，比刀片刮取法更具有明顯優(yōu)勢。

本實驗進(jìn)一步證實大于200個腫瘤細(xì)胞可用于EGFR基因檢測，同時對血性胸水和腫瘤細(xì)胞大于10%的胸水細(xì)胞蠟塊推薦使用切蠟?zāi)し?，刀片刮取法更加精確獲取腫瘤細(xì)胞比較實用。對于腫瘤細(xì)胞小于10%的胸水細(xì)胞蠟塊可以依據(jù)其特點(diǎn)選擇刀片刮取法或激光顯微切割法，本實驗中基因檢測成功率以及獲取腫瘤細(xì)胞準(zhǔn)確性方面推薦使用激光顯微切割法?；驒z測可以依據(jù)細(xì)胞蠟塊以及組織標(biāo)本特點(diǎn)，結(jié)合實驗室條件選擇獲取腫瘤細(xì)胞最合適的方式，為臨床精確治療提供參考。

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