重視分子病理診斷新技術(shù)提高結(jié)核病病理學(xué)診斷水平

車南穎

中國是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，在結(jié)核病診斷中面臨很多問題。分析2018年WHO發(fā)布的全球結(jié)核病報(bào)告[1]，中國結(jié)核病診斷在以下3個方面需要繼續(xù)加強(qiáng)：(1)肺結(jié)核細(xì)菌學(xué)確診率低，僅為31%，遠(yuǎn)低于世界平均水平57%；(2)耐藥結(jié)核病發(fā)現(xiàn)率低，不到20%耐多藥或利福平耐藥患者被發(fā)現(xiàn)；(3)肺外結(jié)核發(fā)現(xiàn)率低，全球報(bào)告的結(jié)核病患者中15%為肺外結(jié)核，但中國報(bào)告的肺外結(jié)核患者僅占5%。

病理學(xué)是診斷結(jié)核病的重要途徑，在疑難性結(jié)核病，尤其在菌陰肺結(jié)核(痰涂片及培養(yǎng)陰性)及肺外結(jié)核的診斷中發(fā)揮著非常重要的作用。近年來，分子病理學(xué)新技術(shù)發(fā)展迅猛，結(jié)合傳統(tǒng)病理學(xué)可以做到確診結(jié)核病、鑒別診斷結(jié)核病與非結(jié)核分枝桿菌病，以及診斷耐藥結(jié)核病，為解決以上3個結(jié)核病診斷所遇到的突出問題提供了新的途徑。如何將這些新技術(shù)應(yīng)用到臨床實(shí)際工作中，提高疑難性結(jié)核病的診斷水平是擺在我們面前的重要問題。

病理學(xué)診斷結(jié)核病的方法及標(biāo)準(zhǔn)

一、病理學(xué)診斷結(jié)核病的主要方法

病理學(xué)診斷結(jié)核病的主要方法包括常規(guī)病理學(xué)、特殊染色、免疫組織化學(xué)染色，以及分子病理學(xué)等。2017年發(fā)表的《中國結(jié)核病病理學(xué)診斷專家共識》[2](以下簡稱“《共識》”)，對上述4種方法的原理、特點(diǎn)及注意事項(xiàng)等做了詳細(xì)的介紹。

1. 常規(guī)病理學(xué)：常規(guī)病理學(xué)通過大體和鏡下觀察組織細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行診斷，具有針對性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)。對結(jié)核病與其他一些非肉芽腫性疾病(如肺結(jié)核與肺癌)的鑒別診斷具有很好的優(yōu)勢。但肉芽腫或壞死等結(jié)核病常見的病理改變亦可出現(xiàn)在其他感染性和非感染性肉芽腫性病變中[3-4]，《共識》中明確指出常規(guī)病理學(xué)診斷手段不能作為診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，必須通過其他方法找到明確的結(jié)核病病原學(xué)依據(jù)方可確診。

2. 特殊染色：特殊染色中，抗酸染色是病理科最為常用的查找抗酸桿菌的方法，對于診斷結(jié)核病有非常重要的作用。需要注意的是，抗酸染色無法鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌，而且除了分枝桿菌外其他一些種屬的細(xì)菌也可呈抗酸染色陽性[5]，因此抗酸染色陽性并不能確診結(jié)核病，形態(tài)典型的情況下只能診斷分枝桿菌病。真菌病是除了分枝桿菌病以外最為常見的感染性肉芽腫性疾病。如果僅憑常規(guī)病理，有時這兩類疾病容易誤診，因此《共識》建議將抗酸染色和真菌染色作為感染性肉芽腫性疾病鑒別的常規(guī)項(xiàng)目開展。真菌染色中六胺銀(Grocott’s methenamine silver，GMS)染色和過碘酸希夫染色(periodic acid-Schiff stain，PAS染色)是最常用的識別真菌的染色方法[6]。

3. 免疫組織化學(xué)染色：免疫組織化學(xué)染色是病理科非常常見的技術(shù)，但在結(jié)核病診斷中應(yīng)用不多，主要原因是沒有可以應(yīng)用于臨床的商業(yè)化一抗。但最近的研究表明，免疫組織化學(xué)檢查操作簡便，陽性信號易于觀察，不需要使用油鏡，可以有效地提高檢測敏感度和工作效率[7-8]。因此，《共識》建議未來開展更多的臨床轉(zhuǎn)化及評估研究。

4. 分子病理學(xué)：分子病理學(xué)診斷技術(shù)發(fā)展迅速?；诨驒z測的分子病理學(xué)新技術(shù)具有準(zhǔn)確、快捷等優(yōu)點(diǎn)，可有效提高組織標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的檢出率[9-10]，可幫助鑒別結(jié)核病與非結(jié)核分枝桿菌病[11]，還可以幫助診斷耐藥結(jié)核病[12]，為結(jié)核病病理學(xué)精準(zhǔn)診斷提供了更多的輔助手段。目前，臨床上常用的技術(shù)有實(shí)時熒光定量PCR、核酸分子雜交技術(shù)，以及熒光PCR探針熔解曲線法等[2]。

二、 病理學(xué)診斷結(jié)核病的標(biāo)準(zhǔn)

2018年開始實(shí)施的新的《肺結(jié)核診斷》衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[13]中首次將病理學(xué)作為確診依據(jù)。這也進(jìn)一步說明了病理學(xué)在結(jié)核病診斷中的重要地位。為了讓臨床醫(yī)師更加了解結(jié)核病病理學(xué)診斷內(nèi)涵，同時規(guī)范結(jié)核病病理學(xué)診斷報(bào)告，2017年發(fā)表的《共識》中明確規(guī)定了結(jié)核病病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會編著的《臨床技術(shù)操作規(guī)范：病理學(xué)分冊》所規(guī)定的病理學(xué)診斷基本類型，結(jié)核病診斷也分為4個級別：(1)Ⅰ類診斷屬于明確診斷，主要有2個因素，即形態(tài)學(xué)符合并且找到結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群病原學(xué)證據(jù)。(2)Ⅱ類診斷屬于提示性診斷，即形態(tài)學(xué)符合，但是并沒有明確的結(jié)核病病原學(xué)依據(jù)。(3)Ⅲ類診斷屬于描述性診斷，病變組織或細(xì)胞不足以提示診斷為結(jié)核病，只能進(jìn)行病變的形態(tài)描述。(4)Ⅳ類診斷為無法診斷[14]。

Ⅰ類診斷標(biāo)準(zhǔn)明確了在傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上必須要有病原學(xué)依據(jù)。如果僅有常規(guī)病理學(xué)或特殊染色結(jié)果，診斷級別只能到Ⅱ類，只有通過分子病理學(xué)或微生物學(xué)獲得病原學(xué)依據(jù)，才能達(dá)到Ⅰ類診斷級別。沒有應(yīng)用分子病理學(xué)技術(shù)的病理科按照《共識》規(guī)定可以出具Ⅱ類及以下級別的病理診斷報(bào)告?！豆沧R》建議有條件的病理科積極開展分子病理學(xué)診斷工作，以提高結(jié)核病病理學(xué)診斷水平。

結(jié)核病病理學(xué)診斷現(xiàn)狀及存在問題

結(jié)核病病理學(xué)研究在19世紀(jì)80年代至20世紀(jì)50年代非?；钴S。當(dāng)時，結(jié)核病在全球的流行率高、死亡率高，受到醫(yī)學(xué)界的重視。通過尸檢和組織病理學(xué)方法，觀察研究不同類型的結(jié)核病病理形態(tài)改變，提出了很多結(jié)核病發(fā)病機(jī)制及診斷相關(guān)的觀點(diǎn)。但在1950年前后抗結(jié)核藥物陸續(xù)出現(xiàn)，結(jié)核病的治療逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)科藥物治療模式，外科手術(shù)逐漸減少，能獲取的人體組織標(biāo)本越來越少，影響了依靠形態(tài)學(xué)的結(jié)核病組織病理學(xué)的研究。隨著20世紀(jì)末，結(jié)核病卷土重來，尤其是耐藥結(jié)核病等難治性結(jié)核病的出現(xiàn)，結(jié)核病診治新技術(shù)的研究與開發(fā)再一次受到重視。近年來分子病理技術(shù)發(fā)展迅速，結(jié)合傳統(tǒng)病理學(xué)，結(jié)核病病理學(xué)診斷從組織細(xì)胞學(xué)水平發(fā)展到生物大分子水平，其診斷敏感度和準(zhǔn)確性都得到了顯著的提高。同時，微創(chuàng)技術(shù)，如CT引導(dǎo)下的經(jīng)皮肺穿刺、支氣管活檢及超聲引導(dǎo)下的針吸活檢等技術(shù)的發(fā)展，使得疑難性結(jié)核病患者可以通過安全、快速、方便的途徑獲得組織標(biāo)本。因此，病理學(xué)在菌陰肺結(jié)核及肺外結(jié)核的確診中發(fā)揮著越來越重要的作用[15]。

雖然分子病理技術(shù)發(fā)展迅速，但是結(jié)核病病理診斷目前多以傳統(tǒng)的常規(guī)病理和抗酸染色手段為主，只有少數(shù)高級別醫(yī)院在開展結(jié)核病分子病理學(xué)診斷工作。中國結(jié)核病病理學(xué)診斷面臨著以下幾個問題。

一、結(jié)核病?？漆t(yī)院病理科基礎(chǔ)薄弱、人員緊缺

病理學(xué)主要研究疾病的原因，以及疾病發(fā)生、發(fā)展過程和預(yù)后，是連接基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)的橋梁，在醫(yī)學(xué)診斷和研究中占有重要地位。但是，很多結(jié)核病?？漆t(yī)院沒有重視病理學(xué)科的發(fā)展，普遍存在病理科人員緊缺、設(shè)備陳舊、學(xué)科發(fā)展滯后，以及科室設(shè)置不合理等問題。2015年中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(簡稱“國家衛(wèi)計(jì)委”)發(fā)布的《病理專業(yè)醫(yī)療質(zhì)量控制指標(biāo)(2015年版)》[16]中明確指出，病理科每百張病床應(yīng)至少配備1名病理醫(yī)師和1名病理技師。但是，大多數(shù)專科醫(yī)院都達(dá)不到此項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)。很多?？漆t(yī)院甚至沒有病理科的設(shè)置，沒有病理科醫(yī)師。結(jié)核病?？漆t(yī)院亟需重視病理學(xué)科發(fā)展，重視人才培養(yǎng)，改善工作環(huán)境，更新儀器設(shè)備。

二、結(jié)核病分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室缺乏專業(yè)化建設(shè)

近年來，分子病理學(xué)發(fā)展非常迅速，可以為病理學(xué)確診結(jié)核病、鑒別診斷結(jié)核病與非結(jié)核分枝桿菌病、診斷耐藥結(jié)核病提供至關(guān)重要的依據(jù)。但是，除了少數(shù)幾家大型結(jié)核病?？漆t(yī)院外，很多?？漆t(yī)院還沒有開展結(jié)核病分子病理學(xué)診斷工作。

分子病理實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)要求與傳統(tǒng)病理實(shí)驗(yàn)室有很大區(qū)別，主要體現(xiàn)在3個方面：(1)建立符合標(biāo)準(zhǔn)的分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室；(2)必須有掌握分子病理學(xué)基本知識的、具有開展PCR臨床檢測審核資質(zhì)的專業(yè)醫(yī)師及技術(shù)人員；(3)配備符合分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)要求的專業(yè)設(shè)備。場地、人員、設(shè)備是開展分子病理學(xué)診斷工作最基本的條件。因此，?？漆t(yī)院在病理科建設(shè)和發(fā)展中不僅應(yīng)該重視傳統(tǒng)病理學(xué)的發(fā)展，在條件允許的情況下也要考慮分子病理學(xué)的同步發(fā)展，應(yīng)該在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室建立、專業(yè)人才培養(yǎng)、專業(yè)化管理方面多做工作。

三、結(jié)核病病理學(xué)診斷的質(zhì)量控制體系亟待完善

2004年《臨床技術(shù)操作規(guī)范：病理學(xué)分冊》[14]出版，是我國第一部病理科技術(shù)操作方面的規(guī)范，主要包括病理學(xué)檢查常規(guī)、基本技術(shù)操作及相關(guān)技術(shù)操作。2009年中華人民共和國衛(wèi)生部頒布了《病理科建設(shè)與管理指南(試行)》[17]，主要對執(zhí)業(yè)條件、質(zhì)量控制、安全管理、監(jiān)督管理等方面做了規(guī)范。該指南在病理科場所、設(shè)施、設(shè)備及人員方面提出了明確的基本要求。2015年，國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會頒布了《病理專業(yè)醫(yī)療質(zhì)量控制指標(biāo)(2015年版)》(簡稱《質(zhì)量控制指標(biāo)》)[15]；其中包括了13項(xiàng)內(nèi)容：每百張病床病理學(xué)醫(yī)師數(shù)、每百張病床病理學(xué)技術(shù)人員數(shù)、標(biāo)本規(guī)范化固定率、HE染色切片優(yōu)良率、免疫組織化學(xué)染色切片優(yōu)良率、術(shù)中快速病理學(xué)診斷及時率、組織病理學(xué)診斷及時率、細(xì)胞病理學(xué)診斷及時率、各項(xiàng)分子病理學(xué)診斷室內(nèi)質(zhì)量控制合格率、免疫組化染色室間質(zhì)量評價合格率、各項(xiàng)分子病理學(xué)檢查室間質(zhì)量評價合格率、細(xì)胞病理學(xué)診斷質(zhì)量控制符合率、術(shù)中快速診斷與石蠟診斷符合率。該《質(zhì)量控制指標(biāo)》貼近病理科日常工作，從人員配置，主要診斷工作的重要環(huán)節(jié)、技術(shù)要求及質(zhì)量控制等方面做了明確的說明。同年，《分子病理診斷實(shí)驗(yàn)室建設(shè)指南(試行)》[18]發(fā)表，建議三級甲等醫(yī)院病理科應(yīng)設(shè)置分子病理學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室，并且在醫(yī)院準(zhǔn)入、人員準(zhǔn)入、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置要求、實(shí)驗(yàn)室生物安全、檢測項(xiàng)目準(zhǔn)入、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制、試劑盒消耗品準(zhǔn)入和管理、報(bào)告格式和內(nèi)容、分子病理學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室管理等9個方面給出了指導(dǎo)性參考意見[18]。結(jié)核病專科醫(yī)院病理科建設(shè)也應(yīng)該按照上述指南和規(guī)范，做好病理科的各項(xiàng)質(zhì)量控制工作。同時，應(yīng)該發(fā)揮結(jié)核病?？漆t(yī)院的特點(diǎn)，在實(shí)際工作中建立具有結(jié)核病專業(yè)特色的質(zhì)量控制體系。但是，目前無論是國家層面還是?？葡到y(tǒng)內(nèi)都沒有針對結(jié)核病病理學(xué)相關(guān)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。如抗酸染色、結(jié)核病分子病理學(xué)及結(jié)核病免疫組織化學(xué)染色等都需要進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評價工作，但這些工作目前都存在嚴(yán)重不足。未來，結(jié)核病病理學(xué)需要建立健全的質(zhì)量控制體系，以保證和提高結(jié)核病病理學(xué)診斷的質(zhì)量，為結(jié)核病診治與防控提供有力保障。

展 望

分子病理學(xué)作為結(jié)核病確診的重要途徑，可為難以獲得細(xì)菌學(xué)證據(jù)的疑難性結(jié)核病的診斷提供結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)依據(jù)，還可以提供病原菌的基因型藥敏試驗(yàn)結(jié)果。隨著“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”理念的發(fā)展，結(jié)核病的診治模式也在逐漸發(fā)生變化。目前，從傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)的模式越來越多地采用循證醫(yī)學(xué)觀念，并向精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代邁進(jìn)。實(shí)現(xiàn)結(jié)核病的精準(zhǔn)治療，建立個體化的治療方案是我們的愿景。分子病理學(xué)新技術(shù)的推廣和普及，勢必促進(jìn)結(jié)核病診斷水平更上一層樓，成為結(jié)核病精準(zhǔn)治療不可或缺的診斷手段。未來，結(jié)核病病理學(xué)不僅要做好傳統(tǒng)病理學(xué)的基礎(chǔ)工作，還應(yīng)該加快步伐推進(jìn)分子病理學(xué)專業(yè)化建設(shè)、人才隊(duì)伍建設(shè)，以及加快和完善質(zhì)量控制體系建設(shè)，以適應(yīng)結(jié)核病防治事業(yè)發(fā)展的需要。