免疫組化蛋白標志物在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達

侯衛(wèi)華，李從洋，孟祥超，劉艷鋒，于兵兵，張　萌，王建業(yè)，段尚林，胡學信

(中國人民解放軍第152中心醫(yī)院病理科，河南 平頂山 467099)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是起源于甲狀腺濾泡上皮的惡性腫瘤，也是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤。臨床多以甲狀腺腫塊首先就診于內(nèi)分泌代謝科，進而接受后續(xù)外科手術(shù)治療。傳統(tǒng)病理依據(jù)組織學形態(tài)進行診斷，主要觀察細胞核特征及多級分支的乳頭狀結(jié)構(gòu)，而有時一些甲狀腺良性病變(benign thyroid lesions，BTL)亦可呈乳頭狀或假乳頭狀增生，當細胞核的特征不典型時鑒別診斷常會存在一定困難；包裹性濾泡型乳頭狀癌當細胞核的特征不明顯時與濾泡性腺瘤鑒別更是困難。隨著現(xiàn)代病理技術(shù)的發(fā)展，免疫組化技術(shù)在病理診斷中應(yīng)用越來越廣，甚至成為腫瘤病理診斷不可或缺的輔助手段。目前用于甲狀腺腫瘤的蛋白標志物種類繁多，正確評價各種標志物顯得尤為重要。鑒于此，本研究通過對130例PTC和103例BTL進行免疫組化染色并對染色結(jié)果結(jié)合病理形態(tài)學進行分析，探討臨床上常用的免疫組化蛋白標志物在PTC鑒別診斷及預(yù)后評估中的價值，為臨床提供參考。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2010年1月至2015年12月中國人民解放軍第152中心醫(yī)院病理科甲狀腺結(jié)節(jié)存檔標本233例。其中PTC患者130例，男42例，女88例；年齡19～72歲，中位年齡45.4歲，≥40歲者79例，<40歲者51例；單個瘤結(jié)節(jié)83例，多個瘤結(jié)節(jié)47例；腫瘤最大直徑>1 cm者75例，≤1 cm者55例；原發(fā)灶有包膜侵犯者53例，無包膜侵犯者77例；伴有中央?yún)^(qū)和(或)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，其余94例未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；術(shù)后病理分期：Ⅰ期60例，Ⅱ期34例，Ⅲ期28例，Ⅳ期8例[1]。BTL患者103例，其中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫45例，橋本氏甲狀腺炎42例，甲狀腺濾泡性腺瘤16例；男56例，女82例；年齡20～72歲，中位年齡46.2歲。2組患者性別、年齡等基本資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法與結(jié)果判定所有標本均經(jīng)質(zhì)量分數(shù)4%中性多聚甲醛固定，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，免疫組化采用EnVision兩步法，操作步驟按說明書進行。使用已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照，2組標本在同一條件下進行染色。所用一抗為：細胞角蛋白(cytokeratin，CK7、CK8/18、CK19、CK34βE12)、間皮細胞(mesothelial cell，MC)、半乳糖黏附凝集素(galectin-3)、上皮膜抗原(epithelial membrane antigen，EMA)、消化道癌抗原(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)、神經(jīng)細胞黏附分子(neural cell adhesion molecule，NCAM，又稱CD56)、自然殺傷細胞因子(CD57)、甲狀腺過氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)、細胞周期抑制蛋白(p27kip1)、細胞周期素1(Cyclin D1)、甲狀腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1(thyroid transcription factor-1，TTF-1)共15種。免疫組化結(jié)果判定：galectin-3定位于細胞質(zhì)和細胞核，p27kip1、Cyclin D1及TTF-1陽性定位于細胞核，其余抗體表達于細胞質(zhì)和(或)細胞膜上。染色陽性是指細胞核、細胞質(zhì)和(或)細胞膜上呈淺黃色至棕褐色。綜合判斷高倍鏡下陽性細胞百分率評分和染色強度評分。按染色強度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細胞百分率評分：高倍鏡下隨機選取5個視野陽性細胞數(shù)之平均數(shù)為該例陽性細胞數(shù)結(jié)果，其中≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為2分，>75%為4分。染色強度得分和陽性細胞百分率得分相加，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中等陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)，其中后三者均為陽性。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)數(shù)據(jù)以率或百分數(shù)表示，用χ2檢驗(必要時連續(xù)校正)或Fisher確切概率法進行比較，檢驗水準為α=0.05。

2　結(jié)果

CK19、CK34βE12、MC、galectin-3、CA19-9、CD57、Cyclin D1在PTC組織中的陽性表達率分別為94.6%(123/130)、90.8%(118/130)、88.5%(115/130)、96.2%(125/130)、85.4%(111/130)、95.4%(124/130)、75.4%(98/130)，明顯高于BTL的34.0%(35/103)、16.5%(17/103)、10.7%(11/103)、35.9%(37/103)、12.6%(13/103)、18.4%(19/103)、28.2%(29/103)，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=96.797、130.058、140.004、98.404、122.212、143.496、51.695，P均<0.05)；CD56、TPO、p27kip1在PTC組織中的陽性表達率分別為7.7%(10/130)、23.8%(31/130)、32.3%(42/130)，明顯低于BTL的91.3%(94/103)、95.1%(98/103)、79.6%(82/103)(χ2=162.410、118.219、51.652，P均<0.05)；CK7、CK8/18、EMA、Tg、TTF-1在PTC組織中的陽性表達率分別為99.2%(129/130)、91.5%(119/130)、86.2%(112/130)、99.2%(129/130)、100.0%(130/130)，BTL組織中分別為99.0%(102/103)、94.2%(97/103)、77.7%(80/103)、100.0%(103/103)、100.0%(103/103)，均高表達(χ2=0.027、0.591、2.853，Tg比較用Fisher確切概率法，TTF-1均為100.0%，P均>0.05)。PTC組織中p27kip1和Cyclin D1陽性表達率與腫瘤有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[(16.7%vs38.3%，χ2= 5.569，P<0.05)、(100.0%vs66.0%，χ2= 16.257，P<0.05)]及TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期)[(37.6%vs18.9%，χ2= 6.632，P<0.05)、(69.9%vs89.2%，χ2=5.312，P<0.05)]有關(guān)，而與患者年齡、性別、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目、腫瘤直徑、包膜侵犯與否均無明顯關(guān)系(P均>0.05)。其他蛋白與PTC患者的臨床病理參數(shù)均無明顯關(guān)系(P均>0.05)。

3　討論

本研究對臨床常用的15種免疫組化蛋白標志物在PTC和BTL組織中的表達和意義進行探討。按病理生理機制和病理意義的不同簡單歸類并進行分析闡述。

3.1甲狀腺濾泡細胞標志物Tg是由甲狀腺濾泡細胞合成的一種糖蛋白，是甲狀腺濾泡細胞及其起源腫瘤的最特異性標志物，主要用于PTC或甲狀腺濾泡癌與甲狀腺髓樣癌及轉(zhuǎn)移癌的鑒別。本組1例呈Tg免疫陰性，提示Tg陰性，尤其是在甲狀腺腫瘤穿刺活檢標本中Tg陰性不能完全排除PTC的可能。在BTL組織中Tg表達可有不同，濾泡立方或柱狀增生細胞免疫表達較濾泡腔內(nèi)充滿膠質(zhì)而受壓扁平或萎縮的濾泡細胞要強，如在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中因膠質(zhì)聚積，濾泡細胞受壓明顯，染色則較溫和，相比而言，橋本氏甲狀腺炎組織中增生的濾泡細胞著色較強，濾泡性腺瘤著色更強，但巨濾泡性腺瘤和伴乳頭狀增生性濾泡性腺瘤表達明顯減弱以至部分區(qū)域呈陰性。TPO是甲狀腺濾泡細胞合成的一種酶，生理狀態(tài)下直接參與甲狀腺激素的合成。研究顯示TPO在BTL組織中均呈陽性，而在PTC組織中陽性表達率顯著降低，提示TPO的表達對PTC和BTL具有鑒別意義。TTF-1是NKX基因家族中的同源轉(zhuǎn)錄因子之一，存在于內(nèi)胚層分化的甲狀腺濾泡細胞、間腦上皮和Ⅱ型肺泡上皮中。TTF-1在調(diào)節(jié)Tg和TPO的合成以及肺表面活性物質(zhì)形成中發(fā)揮重要作用[2-3]。TTF-1常在甲狀腺、肺上皮細胞及其腫瘤中表達，是器官特異性轉(zhuǎn)錄因子。因此，TTF-1是目前臨床外檢中用于確定轉(zhuǎn)移癌原發(fā)部位的常用免疫標志物，染色陽性常被認為來源于甲狀腺或肺。本研究結(jié)果顯示TTF-1在PTC及BTL組織中陽性表達率均為100.0%，但在PTC組織中的染色強、彌漫且均勻。然而隨著免疫組化的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)TTF-1還可表達于極少數(shù)結(jié)腸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌，乳腺癌等腫瘤[4-5]。為克服TTF-1的局限性，臨床實踐中與Tg聯(lián)合應(yīng)用仍可在PTC與轉(zhuǎn)移性癌鑒別診斷中起到重要作用。

3.2上皮細胞抗原或癌抗原標志物CK是上皮細胞的主要細胞骨架成分。本研究顯示CK7、CK8/18在PTC和BTL組織中均呈高表達。CK19在PTC和BTL組織中表達差異明顯，提示CK19有助于兩者的鑒別。CK34βE12是一組包括CK1、CK5、CK10和CK14的中間絲蛋白。Liberman等[6]報道CK34βE12表達于91%的PTC，并將其解釋為存在CK1的抗原決定簇，或是存在一種不能被CK5、CK10、CK14抗體所識別的抗原決定簇。Tan等[7]報道CK34βE12在PTC組織中呈強陽性表達。我們研究發(fā)現(xiàn)CK34βE12在PTC中陽性率為90.8%，與文獻報道一致，著色模式呈斑駁狀，在BTL組織中陰性或灶狀弱陽性，表明CK34βE12有助于鑒別PTC和BTL。通過比較可以發(fā)現(xiàn)上述幾種CK中以CK19、CK34βE12作為PTC與BTL鑒別診斷的參考指標較為理想。EMA廣泛分布于各種正常上皮細胞及腫瘤中，亦可表達于PTC和BTL。CA19-9是一種消化道癌抗原，主要用于確定轉(zhuǎn)移癌原發(fā)部位，染色陽性常被認為來源于消化道或胰腺。國外文獻[8]曾報道CA19-9在PTC組織中的陽性表達率為70.0%，濾泡性腺瘤組織中無表達。我們研究發(fā)現(xiàn)CA19-9在PTC組織中陽性表達率為85.5%，在BTL組織中陰性或僅點灶狀弱陽性著色。值得注意的是CA19-9不宜單獨用于PTC，尤其是PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶[9]，而應(yīng)與Tg、TTF-1聯(lián)合檢測以免誤診為消化道或胰腺癌轉(zhuǎn)移。

3.3間皮細胞和細胞黏附素MC是間皮表面微絨毛的一種酸性氨基酸多聚糖蛋白，最初主要用于間皮源性腫瘤的診斷，近年來發(fā)現(xiàn)其在甲狀腺良惡性疾病中具有鑒別診斷價值[10]。本研究顯示MC在PTC組織中的表達顯著高于BTL。值得注意的是，在PTC組織中MC陽性定位于細胞膜，頂端胞膜或腔緣著色增強，而在BTL組織中僅細胞質(zhì)弱陽性，甚至可視為陰性，充分認識不同染色模式對疾病的鑒別診斷十分有利。MC對于PTC和BTL鑒別診斷具有重要價值。Galectin-3是一種同型細胞黏附凝集素，主要作用和同類細胞間黏附有關(guān)，亦有報道指出其與許多腫瘤的形成、細胞分化與凋亡、浸潤和轉(zhuǎn)移過程有關(guān)，如結(jié)腸癌、PTC等[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)galectin-3在PTC組織中的表達明顯高于BTL，且細胞質(zhì)和細胞核同時陽性，而在BTL組織中多為片狀細胞質(zhì)弱陽性，因此在PTC和BTL的鑒別診斷中有很好的提示意義。未發(fā)現(xiàn)其與包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期等有關(guān)。

3.4神經(jīng)內(nèi)分泌蛋白標志物CD56為神經(jīng)細胞黏附分子，主要分布于大多數(shù)神經(jīng)外胚層起源的組織及腫瘤中，臨床上常與Syn、CgA聯(lián)合用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的診斷。EI Demellawy等[13]研究發(fā)現(xiàn)CD56在PTC組織中均呈陰性，而在癌旁甲狀腺組織或BTL組織中呈陽性，特異性及敏感性為100.0%。我們發(fā)現(xiàn)PTC組織中CD56陽性表達率為7.8%，而在BTL組織中陽性表達率91.3%，研究表明CD56的失表達有助于PTC的鑒別診斷[12]。CD57為自然殺傷細胞因子，主要標記淋巴組織中的自然殺傷細胞，還與多種神經(jīng)腫瘤發(fā)生反應(yīng)，在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中應(yīng)用較廣。Khan等[14]研究了CD57在PTC組織中的表達，結(jié)果表明CD57表達于95%的PTC、10%的濾泡性腺瘤、27%的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，并認為CD57對鑒別PTC和BTL是有幫助的。我們觀察的結(jié)果與其較為相似，但需注意的是在BTL組織中濾泡內(nèi)的膠質(zhì)著色較強，甚至遮掩陰性的濾泡細胞。CD56和CD57組合從正反兩方面對PTC進行鑒別診斷更具臨床價值。

3.5細胞周期調(diào)節(jié)蛋白P27kip1是一種細胞周期調(diào)節(jié)有絲分裂因子和腫瘤抑制基因，作為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白，能抑制不同類型的Cyclin與細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinase，CDK)形成Cyclin-CDK復(fù)合物，阻礙細胞周期由G1期進入S期，對細胞周期起負調(diào)控作用。Cyclin D1是該家族的重要成員，為細胞周期的正調(diào)控因子，在生理狀態(tài)下，細胞進入S期后Cyclin D1迅速分解。p27kip1失表達使其抑制細胞增長功能降低，則Cyclin D1持續(xù)高表達，導(dǎo)致G1期縮短，提前進入S期，細胞增殖失控，最終形成腫瘤[15]。我們觀察到p27kip1在PTC組織中陽性表達率很低，在BTL組織中高；相反Cyclin D1在PTC組織中陽性表達率較高，而在BTL組織中陽性表達率較低。在PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期患者中Cyclin D1的陽性表達率明顯提高，p27kip1的陽性表達率進一步降低。研究[15-16]表明p27kip1丟失和Cyclin D1表達上調(diào)不但有助于PTC與BTL的鑒別診斷，而且與腫瘤預(yù)后有關(guān)?？傊?lián)合檢測p27kip1和Cyclin D1有助于PTC的鑒別診斷和預(yù)后判斷。

綜上所述，當遇見不典型病例或鑒別診斷有困難時，選擇性聯(lián)合檢測上述指標，對PTC的確診具有重要參考價值，有助提高正確診斷率。CK19、CK34βE12、MC、TPO、Galectin-3、CD56、CD57、CA19-9均可選作PTC和BTL鑒別診斷的首選抗體；p27kip1及Cyclin D1不但助于鑒別診斷，而且對預(yù)后判斷有一定指導(dǎo)意義。Tg和TTF-1同時陽性對確定甲狀腺濾泡上皮起源癌具有決定性意義。