全基因組測(cè)序在結(jié)核病研究中的應(yīng)用進(jìn)展

陳昕昶 張文宏

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的傳染性疾病，其致死率、致殘率已超過(guò)艾滋病，高居全球第一。2016年，據(jù)估計(jì)全世界新發(fā)結(jié)核病患者約為1040萬(wàn)例，約140萬(wàn)例患者死于結(jié)核病。隨著測(cè)序技術(shù)的成熟、測(cè)序成本的降低、生物信息學(xué)的發(fā)展，全基因組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的研究當(dāng)中。筆者對(duì)全基因組測(cè)序技術(shù)的研究方向及成果進(jìn)行回顧，提出其局限性，并展望其應(yīng)用前景。

一、結(jié)核分枝桿菌的微進(jìn)化與傳播

傳統(tǒng)的分型方法主要有基于IS6110的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(IS6110-based restriction fragment length polymorphism，IS6110-RFLP)、間隔區(qū)寡核苷酸分型(spoligotyping)、分枝桿菌多位點(diǎn)數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列分析(mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeats，MIRU-VNTR)等，這些分型方法廣泛應(yīng)用于鑒定結(jié)核分枝桿菌的傳播和暴發(fā)事件。但是這些方法所分析的基因組信息僅為全基因組的1%以下，信息量小、分辨率低，難以判斷細(xì)菌傳播的方向和過(guò)程[1]。全基因組測(cè)序可以鑒定菌株間的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)差異，結(jié)核分枝桿菌自發(fā)突變率低且回復(fù)突變極少見，因此，可以通過(guò)SNP鑒定其傳播方向和傳播鏈。

在對(duì)加拿大溫哥華一次吸毒相關(guān)結(jié)核病暴發(fā)事件的調(diào)查中，研究者對(duì)全部41株菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序和MIRU-VNTR分型。MIRU-VNTR鑒定所有菌株為同一基因型，但是全基因組測(cè)序結(jié)果揭示這是由來(lái)源于共同祖先的、具有相同的MIRU-VNTR基因型的2個(gè)菌株引起的2次暴發(fā)。因此，全基因組測(cè)序可以鑒定傳播事件，彌補(bǔ)MIRU-VNTR分型方法分辨率低的不足，并且可以識(shí)別所謂的超級(jí)傳播者(super spreaders)，即傳染性極強(qiáng)的個(gè)體，避免將他們的毒株傳染給其他人群[2]。

一項(xiàng)英國(guó)的回顧性研究在社區(qū)和家庭傳播的成簇菌株中發(fā)現(xiàn)，遺傳距離大于5個(gè)SNP的患者之間都沒(méi)有流行病學(xué)聯(lián)系，因此，推斷遺傳距離大于5個(gè)SNP可以排除傳播[3]。隨后的研究也得到了相似的結(jié)論，但根據(jù)分析方法、地域特點(diǎn)等不同，排除傳播所用的SNP差異數(shù)閾值有所不同[4-5]。比如，一項(xiàng)研究收集了2007—2012年在英國(guó)牛津郡分離的所有可用的結(jié)核分枝桿菌，并對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序，根據(jù)SNP差異聚集成簇的菌株相差0～7個(gè)SNP，而無(wú)聯(lián)系的菌株間的SNP差異數(shù)的中位數(shù)為1106個(gè)SNP[6]。在中國(guó)上海的一項(xiàng)研究中，研究者收集了上海市疾病預(yù)防控制中心2009—2012年全部的耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株(multidrug-resistant MTB，MDR-MTB)，發(fā)現(xiàn)MIRU-VNTR一致且具有流行病學(xué)聯(lián)系的菌株間最大相差12個(gè)SNP[7]。以上研究提示，對(duì)于流行病學(xué)上直接相關(guān)的菌株，基因組間SNP差異數(shù)應(yīng)該很少；距離較近的近期傳播，SNP差異數(shù)可能為0，仍然無(wú)法僅根據(jù)全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分辨?zhèn)鞑シ较騕8]，要依靠流行病學(xué)調(diào)查提供確鑿的證據(jù)；但是，當(dāng)SNP差異很多時(shí)，可以排除直接傳播。

微進(jìn)化的另一部分重要內(nèi)容是宿主體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌菌株的多態(tài)性，這種多態(tài)性主要?dú)w因于2個(gè)方面：一是混合感染，即宿主感染了2種不同菌株；二是結(jié)核分枝桿菌感染宿主后在其體內(nèi)發(fā)生的微進(jìn)化。分辨混合感染和微進(jìn)化的策略主要有以下幾種：一是同時(shí)感染的2種結(jié)核分枝桿菌的比例較為特殊，且其遺傳背景差異較大時(shí)，可以根據(jù)其差異SNP位點(diǎn)處堿基類型及其比例，將2種亞群分開[9]；二是用現(xiàn)有SNP以最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹，可以發(fā)現(xiàn)該菌株出現(xiàn)在2個(gè)進(jìn)化過(guò)程或不同譜系中，即認(rèn)為是混合感染[2]；三是根據(jù)SNP差異個(gè)數(shù)，有研究定義同一例患者同時(shí)取痰液培養(yǎng)的多個(gè)菌株或者同一例患者先后多次取痰液培養(yǎng)的菌株之間SNP差異數(shù)不超過(guò)11個(gè)SNP即為微進(jìn)化，大于等于475個(gè)SNP即為混合感染[6]。這個(gè)策略也應(yīng)用于分辨復(fù)燃還是再感染。

二、結(jié)核分枝桿菌的宏觀進(jìn)化與種系發(fā)生

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)是通過(guò)一系列染色體缺失從一個(gè)共同的祖先菌株進(jìn)化而來(lái)的[10]。目前認(rèn)為，與MTBC 原始祖先菌株親緣關(guān)系最近的是一種僅在東非吉布提分離的平滑菌落菌株——坎納分枝桿菌(M.canettii)[11]。對(duì)M.canettii基因組進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)比其他MTBC成員的基因組大10～115 kb，并且顯示出比所有其他MTBC菌株加起來(lái)更大的基因組多樣性和更多的SNP差異，且有很明顯的生物學(xué)特性上的差異[12]。

根據(jù)SNP的差異和缺失可以將結(jié)核分枝桿菌菌株分為幾個(gè)主要的譜系(lineage)。古代譜系包括lineage 1(Indo-Oceanic)，主要分布在菲律賓和印度洋海岸線?，F(xiàn)代譜系中的lineage 2(East Asian)，包括北京家族，主要分布在東亞、中亞和俄羅斯；lineage 3以印度和東非為中心；lineage 4(Euro-American)主要分布在歐洲、美洲、非洲和中東地區(qū)[13]。有研究將一個(gè)由220個(gè)結(jié)核分枝桿菌基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與人類線粒體基因組的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行比較，兩個(gè)進(jìn)化樹最深的分支進(jìn)化枝都是非洲起源的，這與人類和結(jié)核分枝桿菌都起源于非洲的觀點(diǎn)一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)MTBC大約在七萬(wàn)年前出現(xiàn)，伴隨著現(xiàn)代人類遷徙到非洲，并由于新石器時(shí)代人口密度的增加而擴(kuò)大。這一長(zhǎng)期的共同進(jìn)化過(guò)程與MTBC所展示出高度適應(yīng)性是一致的[14]。

三、結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)突變的檢測(cè)

現(xiàn)有的耐藥分子檢測(cè)手段主要基于PCR、分子雜交技術(shù)等，已有多種商業(yè)化試劑盒，基本完成了利福平及異煙肼的耐藥診斷，敏感度及特異度可以達(dá)到90%以上[15]，即耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的快速診斷基本得到了解決。但是，現(xiàn)有的分子診斷方法面臨以下幾個(gè)問(wèn)題：一是隨著耐藥機(jī)制研究的深入，更多的耐藥相關(guān)突變不斷被發(fā)現(xiàn)；二是診斷為MDR-TB后，沒(méi)有其他抗結(jié)核藥物的耐藥信息，導(dǎo)致在藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果回復(fù)前無(wú)法給予患者最佳的治療方案，或出現(xiàn)了不良反應(yīng)后無(wú)法根據(jù)耐藥情況調(diào)整方案[16]。

已知的耐藥突變位點(diǎn)不能解釋所有表型耐藥，科學(xué)家們想通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)性分析(genome-wide associated study，GWAS)研究SNP與表型之間的關(guān)系；2013年有2篇論文先后發(fā)表于NatureGenetics上。Farhat等[17]對(duì)116株菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，并對(duì)同一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹內(nèi)的敏感菌株及耐藥菌株進(jìn)行GWAS，以排除種系發(fā)生相關(guān)的SNP，最終找到了39個(gè)可能與耐藥相關(guān)的基因區(qū)域，這些基因與細(xì)胞壁生物合成、藥物泵、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及DNA修復(fù)有關(guān)。Zhang等[18]對(duì)來(lái)自中國(guó)的包括敏感株、耐多藥、廣泛耐藥的161株菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序及分析，發(fā)現(xiàn)了約121個(gè)與耐藥相關(guān)性很強(qiáng)的SNP，這些SNP可能會(huì)調(diào)控下游基因的表達(dá)，影響小RNA的轉(zhuǎn)錄。但是以上2項(xiàng)研究所篩選出的SNP沒(méi)有重疊的部分。2015年，Walker等[19]共收集了3000多株臨床分離株進(jìn)行全基因組測(cè)序及GWAS，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新的可靠的耐藥突變位點(diǎn)。現(xiàn)在我們意識(shí)到，由于臨床菌株的遺傳背景差異很大、耐藥及進(jìn)化的機(jī)制遠(yuǎn)比預(yù)想的復(fù)雜，僅通過(guò)增加樣本量、利用表型與基因型的相關(guān)性分析很難找到可信的耐藥突變，需要開發(fā)新的策略和算法，這需要生物信息學(xué)家和微生物學(xué)家的共同努力。

隨后，全球多個(gè)團(tuán)隊(duì)利用體外誘導(dǎo)及全基因組測(cè)序的方法，在體外篩查出多個(gè)結(jié)核耐藥基因，如與吡嗪酰胺耐藥相關(guān)的rpsA和panD[20-21]，與環(huán)絲氨酸耐藥相關(guān)的Rv0678和Rv1979c[22]，與利奈唑胺耐藥相關(guān)的rrl和rplC[23]等，以上耐藥相關(guān)基因的診斷價(jià)值已經(jīng)在臨床分離菌株中得到了驗(yàn)證[24-25]。

現(xiàn)有的全基因組測(cè)序方法仍然需要基于培養(yǎng)。有研究團(tuán)隊(duì)嘗試在早期培養(yǎng)物或者直接在痰液中進(jìn)行核酸的富集后測(cè)序，使得更快地獲得全基因組信息成為可能；但是由于操作繁瑣、價(jià)格高昂，近期內(nèi)無(wú)法推廣[26-27]。在英國(guó)等結(jié)核病低負(fù)擔(dān)的發(fā)達(dá)國(guó)家，已經(jīng)嘗試將全基因組測(cè)序作為結(jié)核病診斷及結(jié)核病耐藥診斷的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目納入臨床診治流程。2015年和2016年，2個(gè)英國(guó)團(tuán)隊(duì)分別在LancetRespiratoryMedicine、NatureCommunications上發(fā)文，他們用前瞻性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)全基因組測(cè)序診斷耐藥平均需要6～10 d，而傳統(tǒng)方法需要14～32 d，證實(shí)了全基因組測(cè)序所需時(shí)間更短，且經(jīng)濟(jì)可行[28-29]。但是2017年同一團(tuán)隊(duì)再次發(fā)表研究結(jié)果，全基因組測(cè)序?qū)怂峥偭亢唾|(zhì)量要求很高，導(dǎo)致測(cè)序失敗率高于PCR和線性探針的傳統(tǒng)分子檢測(cè)手段，且由于分析流程繁瑣、數(shù)據(jù)量過(guò)大導(dǎo)致分析時(shí)間遠(yuǎn)長(zhǎng)于預(yù)期，傳統(tǒng)方法與全基因組測(cè)序方法分別需要20和21 d。因此，與傳統(tǒng)診斷方法比較，全基因組測(cè)序可以更準(zhǔn)確地診斷物種及藥物敏感型別，但是并沒(méi)有縮短檢出時(shí)間[30]。

四、展望與不足

在微進(jìn)化與傳播的研究中，與原有分型方法比較，全基因組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)大大提高了分辨率，推進(jìn)了分子流行病學(xué)的研究，可以更好地監(jiān)控結(jié)核病傳播和鑒定傳播源頭；但是現(xiàn)有的研究異質(zhì)性很高，不同研究采用不同測(cè)序平臺(tái)、分析流程等致使分析結(jié)果難以相互比較[31]。

在耐藥診斷的研究中，全基因組測(cè)序能夠快速、全面、一次性獲得臨床菌株對(duì)現(xiàn)有全部抗結(jié)核藥物的耐藥信息，以指導(dǎo)臨床醫(yī)生的治療方案。這與近年來(lái)一直提倡的精準(zhǔn)醫(yī)療思路一脈相承，都強(qiáng)調(diào)了針對(duì)菌株耐藥情況進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療方案調(diào)整，使患者最大程度受益。結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，過(guò)去我們常把表型與基因型耐藥情況的不一致歸因于機(jī)制研究的不足。但事實(shí)上，造成全基因組測(cè)序局限性的不僅是機(jī)制研究不全面，還包括臨界濃度、原發(fā)或者獲得性耐藥、測(cè)序的檢出限度、隨機(jī)誤差、基因型和表型之間錯(cuò)誤的關(guān)聯(lián)等多種原因。比如，有一些基因型與表型的不一致是由于表型出了錯(cuò)誤，以吡嗪酰胺和乙胺丁醇為例，其藥敏試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性很差，低度耐藥無(wú)法檢測(cè)[32]。

盡管如此，目前還有很多問(wèn)題尚未解決。比如：不同條件下結(jié)核分枝桿菌的進(jìn)化速率、為什么某些譜系僅存在于特定的地理區(qū)域內(nèi)、新發(fā)現(xiàn)的基因組差異是如何引起耐藥或適應(yīng)性變化的，等等。全基因組測(cè)序在結(jié)核病低負(fù)擔(dān)的高收入國(guó)家已經(jīng)列入常規(guī)診斷流程，其診斷耐藥的準(zhǔn)確性不劣于現(xiàn)有方法，但是還沒(méi)有穩(wěn)健、快速的分析方法或軟件，而且實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的異質(zhì)性較大，可比性差。這些問(wèn)題還亟待解決。

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