W ee1蛋白激酶的研究進展

袁會軍 劉斌 楊艷麗 范鈺 李晶晶

Wee1蛋白激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸家族成員之一，在進化上高度保守并大量存在于多種真核生物中，在細胞周期的S期和G2期非?；钴S。Wee1最初由Nurse［1］從裂殖酵母細胞中分離出來，由于其可通過抑制細胞分裂控制蛋白2（cell division control protein 2，Cdc2，芽殖酵母中稱Cdc28，人類中稱CDK1）活性，從而抑制細胞進行有絲分裂致使真核生物細胞體積減小，故將其命名為“Wee”家族。Wee1蛋白激酶是DNA復制、染色體濃縮、組蛋白轉錄中的關鍵調控中樞，這些生物學行為異?？蓪е禄蚪M不穩(wěn)定，引起惡性腫瘤發(fā)生［2］，但在惡性腫瘤中抑制或下調Wee1蛋白激酶的表達，可引發(fā)有絲分裂災難和細胞凋亡，導致腫瘤細胞死亡。本文就Wee1蛋白激酶的研究進展作一綜述。

1 Wee1蛋白激酶的結構特點

Wee家族包括Wee1A、Wee1B和Myt1，Wee1A存在于體細胞中；Wee1B存在于胚細胞中；Myt1在體細胞和胚細胞中均表達［3］。人Wee1基因位于11p15.3～p15.1，能轉錄一個3 kD的mRAN，編碼含有647個氨基酸，相對分子質量大小為94 kD［4］。該蛋白激酶包括3個結構域：N端調節(jié)域、中心激酶結構域和C端調節(jié)域［5］。其mRNA的3'端和5'端各有兩種長短不一的非翻譯區(qū)，3'端序列上有兩個磷酸化位點，能被泛素化系統(tǒng)識別和降解，5'端則會影響其半衰期［6］。

在細胞周期間期，Wee1蛋白激酶活性的維持依靠其與14-3-3β蛋白結合及其自身磷酸化；在細胞G2/M期，Wee1蛋白激酶通過CDK1介導的磷酸化負反饋機制、與14-3-3β蛋白結合及其他磷酸化激酶作用機制下調其活性；在細胞M期，β-TrCP與Wee1蛋白激酶磷酸化位點Ser53和PS121結合，導致Wee1蛋白激酶降解［7］。

2 Wee1蛋白激酶在細胞周期中的作用

細胞周期是指真核細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經(jīng)歷的全過程。真核細胞增殖必須依次經(jīng)歷其準備階段的間期和有絲分裂期，即前一個細胞周期時相必須在下一個細胞周期時相開始前結束。細胞周期能否正確運行和按序完成細胞周期事件，受控于精準的細胞周期調控機制。細胞周期調控系統(tǒng)的核心成分是細胞周期依賴性蛋白激酶CDKs（cyclin-dependent kinase，CDKs）［8］，為確保細胞周期事件發(fā)生的時相性和協(xié)同性，CDKs的時相性激活在細胞周期中尤為重要，它主要依賴細胞周期蛋白（cyclins）的特異性或時相性表達、積累和分解。

CDKs與cyclins結合形成的CDKs/Cyclins復合物稱為有絲分裂促進因子（mitosis promoting factor，MPF），其調控細胞周期各個環(huán)節(jié)的啟動與進展，進而控制細胞增生與凋亡，CDKs是MPF的催化亞基，cyclins是MPF的調節(jié)亞基。在細胞G2/M期，Wee1蛋白激酶通過磷酸化CDK1的Tyr15位點，抑制CDK1活性使CDK1/Cyclin B復合物失活，進而抑制細胞周期進入有絲分裂期；在細胞S期，Wee1蛋白激酶作為“染色質合成傳感器”，有兩個連續(xù)的磷酸化事件，一是在整個細胞S期磷酸化CDK1的Tyr15位點，防止細胞進入下一個細胞周期時相，直到DNA復制或修復完成；二是磷酸化組蛋白H2B的Tyr37位點，終止組蛋白合成，在進入有絲分裂期前維持正確的組蛋白與DNA比例［9］。由于DNA合成與組蛋白轉錄的耦合對染色體形成至關重要，因此這兩個過程使Wee1蛋白激酶成為維持染色體完整性的主要調節(jié)者。

最近研究［10］表明，Wee1蛋白激酶參與DNA復制的調節(jié)和復制叉停滯維持，通過調節(jié)CDK2活性，Wee1蛋白激酶磷酸化和失活CDK2/Cyclin E復合物，進而在細胞S期控制和調節(jié)DNA復制。在Wee1蛋白激酶缺乏的細胞中增強CDK2活性，可導致復制起始協(xié)調性失控、分裂過程中DNA結構異常，引起基因組不穩(wěn)定。

3 Wee1蛋白激酶在DNA損傷反應中的作用

DNA存儲著生物體賴以生存和繁衍的遺傳信息，外界環(huán)境和生物體內部的因素可導致DNA分子損傷或改變，如果DNA損傷或遺傳信息的改變不能更正，會影響基因組的穩(wěn)定性。真核細胞依賴復雜的細胞周期檢測點和DNA修復系統(tǒng)確保基因組的穩(wěn)定性，在細胞DNA受到化學性或放射性損傷后，細胞周期檢測點被激活，阻止細胞周期進程而使DNA修復。DNA修復途徑主要有二個分支：毛細血管擴張性共濟失調突變基因（ataxia t elangiectasia-mutatedkinase，ATM）/檢查點激酶2（checkpoint kinase 2，Chk2）和ATR（ATM and rad3-related kinase，ATR）/Chk1（checkpoint kinase 1，Chk1）通路，這兩條通路存在較多聯(lián)系。ATM可被電離輻射、放療和引起DNA雙鏈損傷的藥物激活，ATM可磷酸化和激活Chk2，Cdc25c磷酸酶的Ser216位點，生成一個能與14-3-3δ蛋白結合的位點封閉Cdc25c磷酸酶出入細胞核與細胞質的進出口，有效滅活Cdc25c磷酸酶活性，使CDK1處于無功能狀態(tài)，CDK1/Cyclin B復合物亦無活性，細胞周期便不能進入有絲分裂期［11］。ATR可被廣泛的基因毒性刺激，進而導致DNA單鏈斷裂而激活［12］。此外，ATR可依賴ATM激活而激活，發(fā)生在雙鏈DNA斷裂的過程中［13］，ATR是負責磷酸化、激活Chk1的主要激酶，與Chk2相比，Chk1能被ATM和ATR同時激活，可發(fā)生在正常的細胞周期過程中或在響應細胞復制壓力時（比如在復制叉停滯期），Chk1可同時磷酸化、激活Wee1蛋白激酶和Cdc25c磷酸酶，Wee1蛋白激酶磷酸化CDK1/Cyclin B復合物CDK1的Tyr15位點，使其失活，結果使細胞周期阻止在G2期，進行DNA修復。Cdc25c磷酸酶可去磷酸化作用CDK1的Tyr15位點，使其恢復活性，結果使細胞周期進入M期?？梢娂毎芷谀芊襁M入M期，取決于Wee1蛋白激酶和Cdc25c磷酸酶的平衡狀態(tài)。

4 Wee1蛋白激酶與腫瘤

4.1 Wee1蛋白激酶與腫瘤的相關性

惡性腫瘤最基本的生物學特征是腫瘤細胞失控性增生，涉及細胞周期調控機制及DNA損傷修復的細胞傳導通路改變。有研究指出，M期細胞周期蛋白與腫瘤關系密切，其中CDK1/Cyclin B磷酸化調節(jié)機制缺陷與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關［14-15］。p53基因主要在G1/S期對DNA損傷點進行檢查，監(jiān)控基因組的完整性，但多數(shù)腫瘤細胞中p53基因缺失，導致細胞周期G1檢查點缺陷，故在DNA復制及損傷修復過程中更加依賴于G2/M檢查點，促進Wee1蛋白激酶大量表達，使CDK1/Cyclin B復合物不能被激活，間接引起Cyclin B過度積聚，從而促進腫瘤發(fā)生。當降低Wee1蛋白含量時，可引起Fasligand誘導的細胞凋亡，同時產(chǎn)生CDK1的Caspase依賴性激活［16］。

Wee1蛋白激酶作為重要的調節(jié)因子，在DNA復制、組蛋白合成和染色體濃縮等過程中起重要調節(jié)作用，這些過程的不穩(wěn)定都會使染色體的完整、遺傳和表觀遺傳信息傳遞受影響，導致腫瘤發(fā)生。Wee1基因缺失或表達抑制后，可導致細胞周期相關激酶活性上調，進一步導致DNA損傷、細胞有絲分裂災難和細胞凋亡事件發(fā)生?？梢?，Wee1蛋白激酶既是腫瘤發(fā)生的原因，又是腫瘤治療的潛在靶點。

4.2 Wee1蛋白激酶與腫瘤治療

研究表明，Wee1蛋白激酶在多種惡性腫瘤中過表達，如胰腺癌［17］、惡性黑色素瘤［18］和惡性膠質瘤［19］等，其高表達與無病生存率相關［20］。抑制Wee1蛋白激酶表達可致G2檢測點廢除，允許細胞周期攜帶未修復的DNA進入有絲分裂期，引發(fā)有絲分裂災難，最終導致細胞死亡。合成致死（synthetic lethality）是指兩個或多個非致死基因同時失活導致細胞死亡的現(xiàn)象［21］，如果腫瘤中存在特定基因失活，用藥物抑制其合成致死搭檔，可特異性殺死癌細胞，且不損害正常細胞。由于p53基因在腫瘤中缺失普遍，因此對于p53缺失的腫瘤，利用Wee1抑制劑可取得更好的效果［22］。此外，Wee1抑制劑與Chk1抑制劑具有協(xié)同效應，能更好地殺死腫瘤細胞［23］。

4.3 Wee1抑制劑的臨床應用

Wee1抑制劑有AZD-1775、PD0166285和PD0407824。PD0166285可同時抑制Wee1和Myt1；PD0407824是Wee1和Chk1的共同抑制劑；AZD1775是Wee1的特異性小分子抑制劑。此外，miR-194對Wee1亦有抑制作用。目前研究最多的是AZD-1775，其已進入Ⅱ期臨床試驗，被用于Wee1高表達的腫瘤，其耐受性良好，不良反應較少。

HepG2/DDP細胞系是被敲除Wee1基因的肝癌細胞，Wee1蛋白激酶被沉默，可導致HepG2/DDP細胞系對順鉑的敏感性增強，同時也增加細胞凋亡的速度；GST、MRP1、LRP、BCL-2、Pgp、Survivin等蛋白表達水平在HepG2/DDP細胞系中明顯減少，MEK/ERK的磷酸化水平也顯著降低，說明Wee1可調節(jié)藥物相關基因的表達及MEK/ERK通路活性，從而控制人類肝癌細胞的耐藥性及增殖［24］。有研究顯示，Wee1在結直腸癌肝轉移中作為分支血管的推動者，在腫瘤的生長和發(fā)展中起重要作用，AZD-1775可減少腫瘤血管形成的范圍而不依賴于對腫瘤細胞的影響；在對比轉移病灶內的血管內皮細胞與正常肝組織相鄰的血管內皮細胞時發(fā)現(xiàn)，內皮細胞形態(tài)上相似，但其分子表達不同［25］。在對Ⅳ期胃癌患者和伴淋巴結轉移的男性胃癌患者研究中，Wee1蛋白激酶具有較高的表達水平且其存活率較低；對胃癌細胞系（AGS、YCC-2、MKN28、KATOⅢ、SNU-1、SNU-5、SNU-16、SNU-216、SNU-601、SNU-638、SNU-668和SNU-719）的研究顯示，AZD-1775可顯著抑制胃癌細胞增殖、誘發(fā)細胞凋亡和細胞周期停滯，在Wee1高表達的胃癌細胞株中更有效，Wee1抑制劑聯(lián)合其他抗癌藥物（5-FU、紫杉醇等）較單獨應用更有效［26］。胰腺導管腺癌細胞系中，AZD-1775的抗腫瘤效果受DNA修復狀態(tài)影響，在DDR-P（DNA repair proficient）細胞系（MIA PaCa2和PANC-1）中的效果優(yōu)于含DNA修復基因（FANCC、FANCG和BRCA2）突變的細胞系（PL11、Hs 766T和Capan-1），單獨抑制Wee1可能無法提供臨床幫助，特別是FANCC、FANCG和BRCA2基因突變者［27］。三陰性乳腺癌的研究表明，順鉑治療誘導DNA損傷可激活DNA復制檢測點ATR、Chk1、Wee1調節(jié)，使細胞周期阻滯在S期以便DNA修復，阻止了順鉑引起的細胞死亡而產(chǎn)生耐藥。利用Wee1抑制劑或siRNA可引起DNA復制再燃，進一步增加復制壓力和導致更多的DNA損害，最終使癌細胞死亡，同時使用順鉑和AZD-1775抑制劑治療三陰性乳腺癌，有望克服順鉑耐藥性并取得更好的治療效果［28］。miR-194表達在喉鱗狀細胞癌組織和細胞中顯著下調，在喉鱗狀細胞癌細胞中miR-194過表達能抑制腫瘤增殖、轉移、浸潤和耐藥，而Wee1被證明是miR-194新的直接作用靶點，其過表達在一定程度上克服了miR-194抑制腫瘤的效果［29］。以上研究表明，Wee1抑制劑可降低腫瘤細胞耐藥性，抑制腫瘤生長及轉移，Wee1高表達者采用Wee1抑制劑與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應用抗腫瘤效果更佳，但其效果取決于DNA的修復狀態(tài)。

5小結

綜上所述，Wee1蛋白激酶在細胞周期S期和G2/M過渡期有重要作用，如在細胞DNA損傷時，可使細胞周期停滯以便受損的DNA修復。在多種腫瘤中由于Wee1蛋白激酶處于過表達狀態(tài)，抑制或下調Wee1蛋白激酶可引起有絲分裂災難，導致細胞凋亡，因此，Wee1蛋白激酶可能是理想的腫瘤治療靶點。Wee1蛋白激酶抑制劑AZD-1775聯(lián)合其他抗腫瘤藥物可增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，取得更好的療效。雖然Wee1蛋白激酶在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的確切作用機制尚未完全明了，但現(xiàn)有的研究結果為抗癌治療帶來了新的希望。

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